梔子苷對PDGF誘導(dǎo)的HSC-T6增殖活化的影響

孔令娜，占書箱，黃 成，馬陶陶，林 翔，李 俊

梔子苷對PDGF誘導(dǎo)的HSC-T6增殖活化的影響

孔令娜1，2，3，占書箱1，2，3，黃 成1，2，3，馬陶陶1，2，3，林 翔1，2，3，李 俊1，2，3

摘要目的 探討梔子苷抑制血小板衍生生長因子（PDGF）介導(dǎo)的大鼠肝星狀細胞（HSC-T6）增殖活化的作用及其可能機制。方法 培養(yǎng)HSC-T6，體外給予不同濃度（20、50、100、200、400 μg／ml）的梔子苷，通過MTT法檢測細胞的活力；選取20、50、100 μg／ml的梔子苷，PDGF刺激后，采用MTT、實時定量PCR（qRT-PCR）和Western blot法檢測細胞增殖和細胞活化標(biāo)志物α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）的表達；進一步采用Western blot法檢測梔子苷對MAPK通路蛋白P-ERK、P-p38和Akt／mTOR／p70S6K 通路蛋白的表達。結(jié)果 梔子苷可以抑制PDGF誘導(dǎo)的HSC-T6的增殖和減少活化標(biāo)志物α-SMA的表達，并且明顯抑制Akt、mTOR 和p70S6K的磷酸化水平，但是對ERK、p38活化水平無顯著影響。結(jié)論 梔子苷可以抑制PDGF誘導(dǎo)的HSC-T6的增殖與活化，可能起到抗纖維化的作用，這一作用的產(chǎn)生可能與Akt／mTOR／p70S6K通路有關(guān)。

關(guān)鍵詞梔子苷；HSC-T6；肝纖維化；Akt／mTOR／p70S6K

2014－12－26接收

作者單位：1安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，合肥 230032

2安徽天然藥物活性研究省級實驗室，合肥 2300323安徽省創(chuàng)新藥物產(chǎn)業(yè)共性技術(shù)研究院，合肥 230032

肝纖維化是一種由體內(nèi)體外多種因素，如病毒、代謝、藥物、酒精、血吸蟲等作用于肝臟引起的細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）過度沉積的炎性病變過程，是慢性肝病發(fā)展到肝硬化的必經(jīng)階段［1］。大量研究［2］證實，活化的肝星狀細胞（hepatic stellates cells，HSCs）是過度沉積的ECM的主要來源，并且HSCs的活化是肝纖維化形成和發(fā)展的中心環(huán)節(jié)。梔子是藥食兩用的傳統(tǒng)中藥，藥用梔子是茜草科植物梔子的干燥成熟果實，具有利膽、鎮(zhèn)

痛、抗炎等作用［3］。梔子苷屬于環(huán)烯醚萜類化合物，是梔子藥效作用的主要有效成分，研究［4－5］表明，梔子苷有利膽、保肝、抗炎等方面作用。研究［6］表明，梔子苷有肝臟保護作用。該研究使用梔子苷進行預(yù)處理并篩選了相關(guān)的信號通路，探討梔子苷抑制血小板衍生生長因子（platelet derived growth factor，PDGF）介導(dǎo)的大鼠肝星狀細胞（HSC-T6）增殖活化的作用及其可能機制，最終表明梔子苷抑制PDGF誘導(dǎo)的HSC-T6的增殖與活化可能與核糖體蛋白S6激酶（ribosomal protein s6 kinases，p70S6K）有關(guān)。

1 材料與方法

1．1 細胞株和細胞培養(yǎng) HSC-T6購自中國科學(xué)院上海細胞研究所。用DMEM高糖混合培養(yǎng)基（含10%FBS及100 U／ml青霉素、100 μg／ml鏈霉素）于37℃、5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)，細胞為貼壁生長，當(dāng)細胞生長融合達到約80%時，用0.25%胰酶消化液消化傳代或按濃度接種培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板。實驗細胞均處于對數(shù)生長期。

1．2 主要試劑 重組小鼠血小板衍生生長因子（PDGF）購于英國PEPROTECH公司；梔子苷購于上海純優(yōu)生物科技有限公司；FBS購于杭州四季青生物工程材料有限公司；DMEM培養(yǎng)液購于美國Hy-Clone公司；TRIzol Reagent RNA提取試劑購于美國Invitrogen Life Technologies公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒購于加拿大Fermentas公司；引物由上海生工生物公司合成；DMSO購于美國Sigma公司；MTT購于美國Amresco公司；熒光定量染料SYBR Green購于德國QIAGEN公司；小鼠抗β-actin抗體購于美國Santa Cruz Biotechnology公司；兔抗α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）抗體購于武漢博士德生物工程有限公司；兔抗p70S6K和兔抗P-p70S6K抗體購于美國Cell Signaling公司。

1．3 儀器與設(shè)備 酶標(biāo)儀MK3（荷蘭雷勃公司）；Napco-6100型細胞培養(yǎng)箱（美國杜邦公司）；多功能顯微鏡（日本OLY MPUS公司）；潔凈工作臺（江蘇蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；Eppendorf Centrifuge 5415R冷凍離心機和Mastercycle epgradient Eppendorf PCR擴增儀（德國Eppendorf公司）；Bio-RAD Power Pac Basic電泳儀以及Western blot設(shè)備（美國Biorad公司）；電子天平FA2004A（上海精天電子儀器廠）。

1．4 方法

1．4．1 MTT法檢測細胞增殖 處于對數(shù)生長期的HSC-T6細胞，0．25%胰蛋白酶消化，完全培養(yǎng)基重懸，常規(guī)接種于96孔板中，每孔5×103個細胞，培養(yǎng)細胞密度至80%～90%進行試驗，實驗分為6組：正常組、20、50、100、200、400 μg／ml梔子苷組。培養(yǎng)24 h或48 h后，每孔加20 μl 5 mg／ml MTT，避光繼續(xù)培養(yǎng)4 h。終止培養(yǎng)，5 ml注射器小心吸盡各孔液體，加入150 μl DMSO，立即使用酶標(biāo)儀進行檢測吸光度（optical density，OD）值OD492 nm。

1．4．2 實時定量PCR（qRT-PCR）測定細胞中α-SMA mRNA的含量 實驗分為正常組、PDGF組、PDGF＋梔子苷20 μg／ml組、PDGF＋50 μg／ml組、PDGF＋100 μg／ml組，收集細胞，按TRIzol試劑盒操作說明提取細胞總RNA，凝膠電泳判斷有無降解。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后使用熒光定量染料SYBR Green制備反應(yīng)混合物。重復(fù)試驗3次。根據(jù)GenBank登錄的α-SMA 和β-actin核苷酸序列設(shè)計引物，由上海生工生物公司合成（α-SMA F：5′-CGAAGCGCAGAGCAAGAGA-3′，R：5′-CATGTCGTCCCAGTTGGTGAT-3′；β-actin F：5′-ACCACAGCTGAGAGGGAAATCG-3′，R：5′-AGAGGTCTTTACGGATGTCAACG-3′）。

1．4．3 Western blot法檢測α-SMA、P-ERK、P-p38 和Akt／mTOR／p70S6K蛋白的含量 實驗分組同1．4．2，提取細胞總蛋白，進行12%SDS-PAGE電泳，經(jīng)0.45 μm PVDF膜轉(zhuǎn)移，一抗4℃孵育過夜，再與辣根過氧化物酶偶聯(lián)二抗室溫孵育1 h，ECL顯色。成像結(jié)果應(yīng)用Image J軟件分析。

1．5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13．0軟件進行分析，數(shù)據(jù)以±s表示；One-Way ANOVA法檢驗各組間差異的顯著性。

2 結(jié)果

2．1 梔子苷對HSC-T6的毒性作用 通過MTT法分析，當(dāng)梔子苷作用于HSC-T6的濃度達到200、400 μg／ml時，HSC-T6活力受到明顯的抑制，與正常組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F＝12.831，P＜0.05），見圖1。

2．2 梔子苷抑制PDGF誘導(dǎo)的HSC-T6細胞增殖用20、50、100 μg／ml的梔子苷作用于HSC-T6 2 h后，加PDGF（10 ng／ml）繼續(xù)培養(yǎng)24 h或48 h。MTT法結(jié)果顯示，24 h和48 h PDGF組均能明顯促進HSC-T6的增殖，與正常組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F＝21.516，P＜0．05，P＜0.01），提示模型建立成

功，后續(xù)的試驗中都選用48 h PDGF組為模型組。當(dāng)培養(yǎng)時間為24 h，梔子苷對HSC-T6增殖的抑制作用不明顯，只有高濃度梔子苷（100 μg／ml）能抑制細胞的增殖，與PDGF組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F＝15.934，P＜0.05）；而當(dāng)培養(yǎng)時間為48 h，低、中、高濃度的梔子苷均可以顯著抑制HSC-T6增殖，與PDGF組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F＝36.715，P ＜0.05，P＜0.01），見圖2。

2．3 梔子苷抑制PDGF誘導(dǎo)的HSC-T6細胞活化梔子苷（20、50、100 μg／ml）預(yù)處理HSC-T6細胞2 h后，加PDGF（10 ng／ml）繼續(xù)作用48 h，提取總RNA或總蛋白。qRT-PCR結(jié)果表明，低、中、高濃度的梔子苷（20、50、100 μg／ml）均可抑制HSC-T6細胞活化標(biāo)志物α-SMA的基因表達，濃度越高，抑制作用越明顯，與PDGF組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F ＝95.891，P＜0.05，P＜0.01），見圖3A。Western blot法結(jié)果顯示，濃度50、100 μg／ml的梔子苷能顯著抑制HSC-T6活化標(biāo)志物α-SMA的蛋白表達，與PDGF組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F＝13.770，P＜0.05），低濃度梔子苷則不能抑制，見圖3B。

2．4 梔子苷對MAPK通路蛋白P-ERK、P-p38表

達的影響 梔子苷（20、50、100 μg／ml）預(yù)處理HSC-T6細胞2 h后，加PDGF（10 ng／ml）繼續(xù)作用48 h，總蛋白被提取。Western blot法結(jié)果顯示，與正常組相比，梔子苷組對MAPK通路蛋白ERK和p38的活化沒有顯著影響。見圖4。

2．5 梔子苷對Akt／mTOR／p70S6K通路蛋白的影響 梔子苷（20、50、100 μg／ml）預(yù)處理HSC-T6細胞2 h后，加PDGF（10 ng／ml）繼續(xù)作用48 h，提取總蛋白。與正常組相比，PDGF組Akt、mTOR和p70S6K的磷酸化水平均明顯升高且差異有統(tǒng)計學(xué)意義，提示PDGF組Akt／mTOR／p70S6K通路被激活。濃度50、100 μg／ml的梔子苷能顯著抑制蛋白Akt的磷酸化水平，與PDGF組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F＝11.877，P＜0.05），見圖5A；濃度50、100 μg／ml的梔子苷能顯著抑制蛋白mTOR的磷酸化水平，與PDGF組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F＝35.505，P＜0.01），見圖5B；濃度50、100 μg／ml的梔子苷能顯著抑制蛋白p70S6K的磷酸化水平，與PDGF組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F＝48.976，P＜0.05），見圖5C。

3 討論

HSCs的活化、增殖、合成及分泌ECM是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的中心環(huán)節(jié)。肝纖維化過程中，多種細胞因子如轉(zhuǎn)化生長因子-β、PDGF等可調(diào)節(jié)HSCs的活化增殖［7］。本實驗采用PDGF誘導(dǎo)活化HSCs，結(jié)果顯示PDGF能明顯誘導(dǎo)HSC-T6的增殖與活化。PDGF作為重要的促纖維化生長因子和有絲分裂原，可激活細胞內(nèi)多條信號通路。研究［8］證明，應(yīng)用PDGF誘導(dǎo)HSCs，可明顯活化MAPK信號通路；研究［9］顯示，PDGF可促進Akt／mTOR蛋白的表達。

MAPK是細胞內(nèi)的一類絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶，包括ERK、P38等，研究［10］表明其在將細胞外刺激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至細胞及其核內(nèi)并引起細胞生物學(xué)反應(yīng)（如細胞增殖、分化、轉(zhuǎn)化及凋亡等）的過程中至關(guān)重要。此外，MAPK信號通路在肝纖維化中的作用也已經(jīng)被證實［11］，通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化生長因子、瘦素、PDGF等因素實現(xiàn)對HSCs的作用，從而影響肝纖維化。mTOR則是一個十分保守的蛋白激酶，屬于3-磷脂酰肌醇激酶－相關(guān)激酶超家族，p70S6K是其下游的效應(yīng)器，可以促進細胞的生長和增殖。研究［12］表明，mTOR／p70S6K信號通路在炎癥反應(yīng)、血管新生及纖維化發(fā)生過程中起著核心的作用。研究［13］表明p70S6K的活化可以抑制腫瘤細胞的增長，而本實驗室前期研究［14］也顯示降低p70S6K的活性可以抑制HSC-T6的增殖與活化，產(chǎn)生抗纖維化的作用。本實驗表明PDGF誘導(dǎo)的HSCs細胞模型組磷酸化ERK、p38及p70S6K蛋白表達明顯高于正常組。表明PDGF可通過影響MAPK、mTOR信號通路促進HSCs的活化增殖。

鑒于HSCs的增殖活化在肝纖維化發(fā)生發(fā)展中的核心作用，尋找有效抑制HSCs的增殖活化以預(yù)防及治療肝纖維化的藥物一直是防治肝纖維化的熱點。本實驗室前期研究［6］表明，梔子苷對大鼠非酒精性脂肪性肝炎模型具有保護作用。本研究結(jié)果顯示梔子苷對HSC-T6的增殖有抑制作用，可明顯抑制α-SMA表達；為了進一步研究其作用機制，先后篩選了與HSCs增殖密切相關(guān)的MAPK通路和Akt／mTOR／p70S6K通路。結(jié)果顯示高、中、低3種濃度的梔子苷對MAPK通路蛋白ERK和p38的磷酸化水平均無影響；而對Akt／mTOR／p70S6K通路，高、中濃度的梔子苷對其有明顯的抑制作用；與PDGF誘導(dǎo)相比，蛋白Akt、mTOR、p70S6K的磷酸化水平明顯降低。

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◇臨床醫(yī)學(xué)研究◇

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The study on the effect of geniposide on the proliferation and activation of PDGF-induced HSC-T6

Kong Lingna1，2，3，Zhan Shuxiang1，2，3，Huang Cheng1，2，3，et al
（1School of Pharmacy，Anhui Medical University，Hefei 230032；2Provincial Natural Drug Active Research Laboratory，Hefei 230032；3Anhui Institute of Innovative Drugs，Hefei 230032）

AbstractObjective To investigate the effect of geniposide on regulating the proliferation and activation of PDGF-induced HSC-T6 cells．Methods HSC-T6 cells were cultivated by geniposide with different concentrations（0，20，50，100，200，400 μg／ml），and or after the cells were stimulated with PDGF，respectively．Cell activity，mRNA and total protein expressions were assayed by MTT，qRT-PCR and Western blot．Results The geniposide pretreatment effectively inhibited PDGF-mediated proliferation and the expressions of the activation markers（α-SMA）in HSC-T6，and also inhibited the phosphorylation levels of Akt，mTOR and p70S6K．But the geniposide couldn′t affect the activation levels of ERK and p38．Furthermore，the protein of the MAPK pathway（P-ERK and P-p38）and Akt／mTOR／p70S6K signaling pathway were detected by Western blot．Conclusion The proliferation and activation of HSC-T6 induced by PDGF are inhibited by geniposide treatment，and then it maybe provide new ideas and targets for the prevention of liver fibrosis，which is probably through modulating the Akt／mTOR／p70S6K signaling pathway．

Key wordsgeniposide；HSC-T6；liver fibrosis；Akt／mTOR／p70S6K

作者簡介：孔令娜，女，碩士研究生；李 俊，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：lijun＠ahmu．edu．cn

基金項目：國家自然科學(xué)基金（編號：81273526、81202978）；安徽高校省級科學(xué)研究重點項目（編號：KJ2012A156）；博士科研啟動基金項目（編號：XJ201118）

文獻標(biāo)志碼A

文章編號1000－1492（2015）04－0481－05

中圖分類號R 285．5；R 322．47；R 575．2