斑禿易感位點(diǎn)與中國(guó)漢族人群相關(guān)性研究

杜 鵑，高金平，周文明

斑禿易感位點(diǎn)與中國(guó)漢族人群相關(guān)性研究

杜 鵑，高金平，周文明

摘要目的 研究國(guó)外斑禿人群已發(fā)現(xiàn)的易感基因與中國(guó)漢族人群斑禿的相關(guān)性。方法 選擇736例斑禿患者和1 840例對(duì)照者，提取基因組DNA，利用Sequenom Massarray系統(tǒng)，對(duì)國(guó)外報(bào)道的斑禿易感基因位點(diǎn)［17個(gè)單核苷酸多態(tài)性（SNPs）］進(jìn)行驗(yàn)證，用Plink 1.07軟件對(duì)基因型進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果 CTLA4基因上rs3087243（P＝0.041，OR＝1.18，95%CI＝1.01～1.38），經(jīng)Bonferroni校正后無(wú)顯著相關(guān)性（Pc＝0.697），其余16個(gè)位點(diǎn)（TLR1、DMBT1、CHIT1、GBP4、CIITA、IL31RA、CD96、INPPL1、MASP2、IL-13、KIAA0350、PTPN22、SPATA5、TRAF1／C5、IL1A、IL2RA）等位基因頻率在病例組和對(duì)照組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；分層分析顯示發(fā)病年齡＞20歲與≤20歲兩組之間比較，TRAF1基因中rs2416808位點(diǎn)（P＝0.0184，OR＝1.35，95%CI＝1.05～1.74）；輕型與重型斑禿、有無(wú)家族史，等位基因頻率在兩兩之間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論 國(guó)外報(bào)道的17個(gè)SNPs與中國(guó)漢族人群的斑禿沒有顯著相關(guān)性，不同人群之間可能存在遺傳異質(zhì)性，進(jìn)一步的研究需要在較大的斑禿樣本中進(jìn)行。

關(guān)鍵詞斑禿；遺傳學(xué)；關(guān)聯(lián)分析；單核苷酸多態(tài)性

2015-03-16接收

作者單位：安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚性病科，安徽醫(yī)科大學(xué)皮膚病研究所，合肥 230032

斑禿在國(guó)外報(bào)道的患病率為0.1%～0.2%，各個(gè)年齡階段中的男性和女性均可以發(fā)病。根據(jù)斑禿的臨床表現(xiàn)形式可以將斑禿分為局限性脫發(fā)、全禿和普禿。盡管斑禿的發(fā)病機(jī)制尚不明確，但有研究［1］表明遺傳構(gòu)成斑禿易感性的主要因素，環(huán)境因素如感染和心理壓力也可能在斑禿中發(fā)揮重要作用。遺傳因素在斑禿的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用，國(guó)外斑禿人群中驗(yàn)證出大量斑禿的易感基因。我們選擇了全基因組關(guān)聯(lián)分析（genome-wide association study，GWAS）、候選基因關(guān)聯(lián)分析及外顯子測(cè)序中一些重要的基因進(jìn)行驗(yàn)證研究，選取了外顯子測(cè)序的9個(gè)基因DMBT1、GBP4、CIITA、CHIT1、IL31RA、 MASP2、INPPL1、ILR1、CD96［2］，GWAS發(fā)現(xiàn)的2個(gè)基因KIAA0350、IL-13［3］，以及候選基因發(fā)現(xiàn)的6個(gè)基因PTPN22［4］、SPATA5［5］、TRAF1［6］、IL1A［7］、IL2RA［8］、CTLA4［9］，共17個(gè)基因，選取736例病例及1 840例對(duì)照者進(jìn)行驗(yàn)證研究，確定這些易感基因是否也是中國(guó)漢族斑禿人群的易感基因。

1　材料與方法

1.1 病例資料 病例總樣本數(shù)736例，包括男457例，女279例。男女比例1.63∶1，年齡2～74 （32.58±13.71）歲，本課題組入組患者均為2005 年5月～2014年4月間就診于安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科的門診病例，均是中國(guó)漢族人群（表1）。由皮膚科2名副高以上的醫(yī)師確診。斑禿遺傳流行病學(xué)調(diào)查表和正常對(duì)照調(diào)查表，由經(jīng)過專門培訓(xùn)的流行病學(xué)調(diào)查員通過對(duì)患者與對(duì)照者進(jìn)行問卷調(diào)查。調(diào)查的內(nèi)容包括患者性別、年齡、有無(wú)家族史、發(fā)病年齡，指患者或其家屬首次發(fā)現(xiàn)本病，而同時(shí)或其后被醫(yī)師診斷為斑禿。臨床特征是指疾病嚴(yán)重程度、病程、首發(fā)部位、有無(wú)伴發(fā)其他疾病等。對(duì)照組1 840例均來(lái)自安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院體檢中心，對(duì)照組與病例組沒有血緣關(guān)系，同時(shí)要求其一、二、三級(jí)親屬中也無(wú)斑禿患者，自身免疫性疾病、唐氏綜合征和特納綜合征排除在外。經(jīng)調(diào)查對(duì)象知情同意，采集外周靜脈血3～4 ml放置于5 ml的EDTANa2抗凝管中，-80℃凍存。該項(xiàng)研究得到了安徽醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，患者與對(duì)照者都簽寫了知情同意書。進(jìn)行了分層分析，將局限性斑禿歸類為輕型斑禿；全禿和普禿歸類為嚴(yán)重斑禿［10］。將發(fā)病年齡＞20歲歸為高年齡組，≤20歲歸為低年齡組［11］；及有無(wú)家族史（陽(yáng)性家族史是指其一、二或三級(jí)親屬中至少有一位斑禿患者）。

1.2 方法

1.2.1 SNP點(diǎn)的選擇要求 選擇最小等位基因頻率（minor allele frequency，MAF）＞1%，P＜0.05，單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）在對(duì)照樣本中均符合Hardy-Weinberg平衡，優(yōu)勢(shì)比（odds ratio，OR）越大越好，綜合這些依據(jù)，選取了GWAS、候選基因關(guān)聯(lián)分析及外顯子測(cè)序中重要的基因位點(diǎn)，共17個(gè)SNPs進(jìn)行驗(yàn)證研究，見表2。本實(shí)驗(yàn)沒有選擇人類白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）區(qū)域上的位點(diǎn)，因?yàn)樵谠O(shè)計(jì)引物的時(shí)候比較困難。

表1　病例與對(duì)照組的一般資料

1.2.2 DNA提取、引物設(shè)計(jì)及合成 用QIAGEN基因組DNA提取試劑盒，按照產(chǎn)品操作說明書提取樣本基因組DNA，將DNA稀釋至標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)濃度（15 ～25 ng／μl）；用Sequenom MassArray Assay Designer 3.1軟件設(shè)計(jì)引物，將DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用Sequenom plex驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)（SNP的基因分型）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用χ2檢驗(yàn)計(jì)算基因型分布是否符合Hardy-Weinberg平衡，用Bonferroni法對(duì)檢驗(yàn)水平進(jìn)行調(diào)整，得到校正P值Pc，校正后需要達(dá)到0.0029才有意義。用Plink 1.07軟件進(jìn)行分層分析，在整個(gè)樣本中，將17個(gè)SNPs位點(diǎn)進(jìn)行分層分析：發(fā)病時(shí)間、輕型及嚴(yán)重斑禿、有無(wú)家族史。比較各組間等位基因頻率，計(jì)算P值、OR值、95%可信區(qū)間（confidence interval，CI）。

2　結(jié)果

2.1 17個(gè)SNPs位點(diǎn)驗(yàn)證研究的關(guān)聯(lián)結(jié)果 在736例AA患者和1 840例對(duì)照者中有一個(gè)位點(diǎn)rs3087243（P＝0.041，OR＝1.18，95%CI＝1.01 ～1.38），但經(jīng)校正后P值無(wú)顯著相關(guān)性（Pc＝0.697）。其余16個(gè)位點(diǎn)的P值在0.07～0.90，等位基因頻率在病例組和對(duì)照組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表3。

2.2 年齡分層分析 年齡＞20歲的564例患者與≤20歲的172例患者的基因型和等位基因頻率相比較：發(fā)病年齡＞20歲與≤20歲之間，位點(diǎn)rs2416808差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.018，OR＝1.35，95%CI＝1.05～1.74），但校正后無(wú)顯著相關(guān)性，見表4。

2.3 疾病嚴(yán)重程度、有無(wú)家族史的關(guān)聯(lián)分析 輕型斑禿與重型斑禿之間差異無(wú)顯著相關(guān)性；有家族史和無(wú)家族史之間其等位基因頻率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3　討論

研究［12］表明，斑禿是一種由T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的毛囊相關(guān)的自身免疫性疾病，在斑禿遺傳易感的個(gè)體中，由于毛囊缺失了免疫赦免，導(dǎo)致T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)攻擊生長(zhǎng)初期的毛囊所致。目前多數(shù)研究［13］主要集中在細(xì)胞因子上，如白介素1、白介素10等，缺乏遺傳方面的相關(guān)研究。

表2　17個(gè)SNPs的基本信息

表3　16個(gè)SNPs位點(diǎn)驗(yàn)證研究的關(guān)聯(lián)結(jié)果

表4　16個(gè)SNPs與不同年齡組間相關(guān)性分析

本研究對(duì)國(guó)外斑禿人群已發(fā)現(xiàn)的17個(gè)易感基因與中國(guó)漢族人群相關(guān)性的研究。研究國(guó)外報(bào)道的斑禿易感位點(diǎn)與中國(guó)漢族人群斑禿相關(guān)性。國(guó)外報(bào)道的17個(gè)SNPs中，發(fā)現(xiàn)1個(gè)SNP的P＜0.05，校正后無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞抗原4（cytotoxic T-lymphocyte antigen 4，CTLA4）基因與斑禿的相關(guān)性具有提示意義。本研究結(jié)果表明，CTLA4基因（P＝0.041），與意大利人群P值結(jié)果保持一致［9］。但本研究結(jié)果經(jīng)校正后，P值無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CTLA4是T細(xì)胞誘導(dǎo)外周免疫耐受的重要性調(diào)節(jié)分子，是首個(gè)在獨(dú)立人群中被驗(yàn)證出來(lái)的AA相關(guān)的GWAS基因。Megiorni et al［9］研究表明此基因與斑禿、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、1型糖尿病、小兒乳糜瀉有關(guān)聯(lián)。

在所有的病例中，進(jìn)行了分層分析，包括發(fā)病時(shí)間、嚴(yán)重程度、有無(wú)家族史。數(shù)據(jù)也表明，腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子1受體（tumor necrosis factor receptor-associated factor 1，TRAF1）似乎與發(fā)病年齡＞20歲有關(guān)，有研究［6］表明，TRAF1與家族史及嚴(yán)重斑禿有顯著相關(guān)性。TRAF1參與AA的發(fā)病機(jī)制，且和其他免疫性疾病有相關(guān)性，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等。同時(shí)也表明腦惡性腫瘤缺失基因1（deleted in malignant brain tumors，DMBT1）可能與嚴(yán)重斑禿有關(guān)聯(lián)，韓國(guó)人群研究［2］結(jié)果表明，DMBT1基因（P＝0.003）與嚴(yán)重斑禿具有相關(guān)性?，F(xiàn)在的觀點(diǎn)表明，DMBT1基因并不是一種與免疫防御和免疫監(jiān)督有關(guān)的抑癌基因，而是在免疫系統(tǒng)和腫瘤細(xì)胞間發(fā)生交互作用［14］。

本研究提示僅有一個(gè)CTLA4基因與斑禿有關(guān)聯(lián)，與國(guó)外結(jié)果有顯著差異，造成這種發(fā)病機(jī)制的差異，認(rèn)為可能有以下幾點(diǎn)原因：首先，可能與有不同的遺傳背景、地域及環(huán)境有很大的關(guān)聯(lián)，存在一定的遺傳異質(zhì)性，也對(duì)實(shí)驗(yàn)組中對(duì)照者的位點(diǎn)與歐美人群的MAF進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)確實(shí)存在差異；其次，可能這些SNP對(duì)漢族人群的斑禿影響小，驗(yàn)證需要更大的樣本；再次，在病例-對(duì)照研究中，是存在一定的差異性，從而導(dǎo)致假陰性結(jié)果，因?yàn)檫@是一個(gè)以醫(yī)院為基礎(chǔ)的病例對(duì)照研究，對(duì)照不能代表所有正常人群；最后，本課題主要是選擇歐美人群中的斑禿易感基因進(jìn)行驗(yàn)證，有可能這些基因不參與漢族人群的致病通路，又或者這些基因是間接的參與斑禿的發(fā)病機(jī)制。

在本課題中，以國(guó)外斑禿人群GWAS及候選基因、外顯子測(cè)序發(fā)現(xiàn)的SNPs點(diǎn)為基礎(chǔ)，選擇位于不同基因上的17個(gè)顯著位點(diǎn)，在中國(guó)漢族人群中進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)這些位點(diǎn)可能與中國(guó)漢族人群斑禿發(fā)病無(wú)相關(guān)性，不同人群可能存在一定的遺傳異質(zhì)性，進(jìn)一步的研究是需要在較大的斑禿樣本中進(jìn)行。

參考文獻(xiàn)

［1］ Seetharam K A.Alopecia areata：an update［J］.Indian J Dermatol Venereol Leprol，2013，79（5）：563-75.

［2］ Lee S，Paik S H，Kim H J，et al.Exomic sequencing of immunerelated genes reveals novel candidate variants associated with alopecia universalis［J］.PLoS One，2013，8（1）：e53613.

［3］ Jagielska D，Redler S，Brockschmidt F F，et al.Follow-up study of the first genome-wide association scan in alopecia areata：IL13 and KIAA0350 as susceptibility loci supported with genome-wide significance［J］.J Invest Dermatol，2012，132（9）：2192-7.

［4］ El-Zawahry B M，Azzam O A，Zaki N S，et al.PTPN22 gene polymorphism in Egyptian alopecia areata patients and its impact on response to diphencyprone immunotherapy［J］.Gene，2013，523 （2）：147-51.

［5］ Forstbauer L M，Brockschmidt F F，Moskvina V，et al.Genomewide pooling approach identifies SPATA5 as a new susceptibility locus for alopecia areata［J］.Eur J Hum Genet，2012，20（3）：326-32.

［6］ Redler S，Brockschmidt F F，F(xiàn)orstbauer L，et al.The TRAF1／C5 locus confers risk for familial and severe alopecia areata［J］.Br J Dermatol，2010，162（4）：866-9.

［7］ Lu D，Chen L，Shi X，et al.A functional polymorphism in interleukin-1α（IL1A）gene is associated with risk of alopecia areata in Chinese populations［J］.Gene，2013，521（2）：282-6.

［8］ Redler S，Albert F，Brockschmidt F F，et al.Investigation of selected cytokine genes suggests that IL2RA and the TNF LTA locus are risk factors for severe alopecia areata［J］.Br J Dermatol，2012，1 67（6）：1360-5.

［9］ Megiorni F，Mora B，Maxia C，et al.Cytotoxic T-lymphocyte antigen 4（CTLA4）＋49AG and CT60 gene polymorphisms in Alopecia Areata：a case-control association study in the Italian population［J］.Arch Dermatol Res，2013，305（7）：665-70.

［10］Alkhalifah A.Alopecia areata update［J］.Dermatol Clin，2013，31（1）：93-108.

［11］Wengraf D A，McDonagh A J，Lovewell T R，et al.Genetic analysis of autoimmune regulator haplotypes in alopecia areata［J］.Tissue Antigens，2008，71（3）：206-12.

［12］Alkhalifah A，Alsantali A，Wang E，et al.Alopecia areata update：part I.Clinical picture，histopathology，and pathogenesis ［J］J Am Acad Dermatol，2010，62（2）：177-88.

［13］Ito T，Ito N，Bettemann A，et al.Collapse and restoration of MHC class-I-dependent immune privilege：exploiting the human hair follicle as a model［J］.Am J Pathol，2004，164（2）：623-34.

［14］Diegelmann J，Czamara D，Le Bras E，et al.Intestinal DMBT1 expression is modulated by Crohn′s disease-associated IL23R variants and by a DMBT1 variant which influences binding of the transcription factors CREB1 and ATF-2［J］.PLoS One，2013，8 （11）：e77773.

Association study of alopecia areata susceptibility loci in Han Chinese population

Du Juan，Gao Jinping，Zhou Wenming
（Dept of Dermatology，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

AbstractObjective To study the correlation between alopecia areata and the susceptibility genes identified in our previous study with Han Chinese population.Methods The study performed an independent replication study using 736 cases and 1 840 controls.DNA was extracted from peripheral blood leukocytes by salting out with saturated NaCl solution according to standard methods.The evidence for association had been obtained from former gene study.Then a fine-mapping study and genotyped the locus with an additional 17 SNPs were performed.Data were analyzed with the use of Plink 1.07 software.Results Only one SNP achieved nominal significance，rs3087243 （P＝0.041，OR＝1.18，95%CI＝1.01～1.38）.The other 16 genes（TLR1，DMBT1，CHIT1，GBP4，CIITA，IL31RA，CD96，INPPL1，MASP2，IL-13，KIAA0350，PTPN22，SPATA5，TRAF1／C5，IL1A，IL2R）failed.A further stratification analysis of alopecia areata was adopted，including the analysis of family history，the age of onset and the severity of alopecia areata.The stratification analysis revealed that the age of onset＞20 years achieved nominal significance P＜0.05 for one SNP，rs2416808（P＝0.018，OR＝1.35，95%CI＝1.05～1.74），whereas，the other results were of no statistical significance.Conclusion The results indicate that 17 SNPs may not be associated with AA in Han Chinese population.Further study should be performed in a larger Han Chinese samples.

Key wordsalopecia areata；genetics；association study；single-nucleotide polymorphism

作者簡(jiǎn)介：杜 鵑，女，碩士研究生；周文明，男，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：zhouwenming＠m(xù)edmail.com.cn

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：81171493）

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)1000-1492（2015）05-0612-04

中圖分類號(hào)R 758.71