右美托咪定在大鼠脊髓缺血再灌注損傷中的保護(hù)作用及機(jī)制研究

江亞楠 梁永新，施彩鳳 孫一笑 李少娜

摘 要：目的 探討右美托咪定對大鼠脊髓缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用及PI3K/Akt傳導(dǎo)通路在其中的作用。方法 30只成年雄性大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和右美托咪定治療組，每組10只。建立大鼠脊髓缺血/再灌注損傷模型，對再灌注損傷后6 h、12 h、24 h、48 h實(shí)驗(yàn)大鼠后肢運(yùn)動功能進(jìn)行評分，檢測缺血脊髓前角組織中P-AKT的表達(dá)水平及神經(jīng)元的凋亡指數(shù)。結(jié)果 右美托咪定可改善脊髓缺血/再灌注損傷后實(shí)驗(yàn)大鼠的后肢運(yùn)動功能（P<0.05）；提高脊髓前角P-AKT的表達(dá)水平（P<0.05），抑制缺血/再灌注損傷所致的脊髓神經(jīng)元的凋亡（P<0.05）。結(jié)論 右美托咪定對脊髓缺血/再灌注損傷有一定的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與激活PI3K/Akt傳導(dǎo)通路，從而抑制神經(jīng)元的凋亡有關(guān)。

關(guān)鍵詞：右美托咪定； 再灌注損傷；細(xì)胞凋亡；脊髓； PI3K/Akt

中圖分類號：R614 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2018.07.022

文章編號：1006-1959（2018）07-0069-03

Protective Effects and Mechanism of Dexmedetomidine on Spinal Cord Ischemia-Reperfusion Injury in Rats

JIANG Ya-nan，LIANG Yong-xin，SHI Cai-feng，SUN Yi-xiao，LI Shao-na

（Department of Anesthesiology，Affiliated Hospital of Qingdao University，Qingdao 266003，Shandong，China）

Abstract：Objective To investigate the protective effect of dexmetomidine on spinal cord ischemia/reperfusion injury in rats and the role of PI3K/Akt pathway in it.Methods 30 adult male rats were randomly divided into the sham operation group，the model group and the right metomomidine treatment group，with 10 rats in each group.A rat model of spinal cord ischemia/reperfusion injury was established.The hindlimb motor function was scored at 6 h，12 h，24 h，and 48 h after reperfusion，and the expression of P-AKT in the anterior horn of ischemic spinal cord was detected.Levels and neuronal apoptosis index.Results Dexmedetomidine can improve the hindlimb motor function in rats after spinal cord ischemia/reperfusion injury（P<0.05），increase the expression level of P-AKT in the anterior horn of spinal cord（P<0.05），and inhibit the apoptosis of spinal cord neurons induced by ischemia/reperfusion（P<0.05）. Conclusion Dexmedetomidine has a protective effect on spinal cord ischemia/reperfusion injury，and its mechanism may be related to activation of PI3K/Akt conduction pathway and inhibition of neuronal apoptosis.

Key words：Dexmetomidine；Reperfusion injury；Apoptosis；Spinal cord；PI3K/Akt

脊髓供血動脈本身疾患、主動脈手術(shù)、脊髓內(nèi)顯微外科手術(shù)均可引起脊髓缺血再灌注損傷（reperfusion injury，RI），一般預(yù)后較差，致殘率很高。右美托咪定（DEX）是一種高選擇性的α2腎上腺素受體激動劑，對中樞神經(jīng)有很多作用，比如鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛和麻醉藥節(jié)儉作用。有研究表明DEX可以改善大鼠短暫缺血腦組織的損傷[1，2]，其機(jī)制可能與抑制神經(jīng)元凋亡有關(guān)[3]。本研究采用大鼠腹主動脈阻斷建立脊髓RI模型，探討右美托咪定對脊髓RI的保護(hù)作用及其機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料與方法

1.1一般材料 清潔級健康成年雄性Wistar大鼠30只，體質(zhì)量250～300 g，由青島市動物實(shí)驗(yàn)中心提供；鹽酸右美托咪定為江蘇新晨制藥有限公司提供，（批號H20091256）；P-AKT抗體由北京博奧森生物技術(shù)有限公司提供；原位細(xì)胞死亡檢測試劑盒（TUNEL）由武漢博士德公司提供。

1.2方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 隨機(jī)分為3組， A 組：假手術(shù)組10例，打開腹腔將腹主動脈暴露，然后關(guān)閉腹腔；B組：模型組10例，阻斷腹主動脈，30 min后，將腹主動脈開放再灌注； C組：DEX處理組10例，阻斷腹主動脈，30 min后將腹主動脈開放再灌注，關(guān)閉腹膜前DEX （10 μg/kg）腹腔內(nèi)注射。

1.2.2動物模型 采用Zivin[3]法復(fù)制大鼠脊髓RI模型： 2%戊巴比妥鈉40 mg/kg體質(zhì)量腹腔麻醉，腹正中切口，在無菌條件下打開腹腔，暴露腹主動脈，手術(shù)分離腹主動脈至腎動脈水平，用無創(chuàng)傷血管夾在腎動脈起始部遠(yuǎn)端將腹主動脈夾閉，阻斷脊髓血供。30 min后移去血管夾，使脊髓血液再灌注，關(guān)閉腹腔，即制成脊髓RI模型。術(shù)后常規(guī)給予青霉素40萬單位肌肉注射，2次/d。

1.2.3 神經(jīng)功能評分 再灌注6 h、12 h、24 h和48 h，由一名對分組情況不知曉的觀察者對大鼠后肢神經(jīng)功能進(jìn)行評分。評估標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)Behrmann （1993） 5點(diǎn)分級法[4]評價大鼠后肢功能。

1.2.4脊髓組織P-AKT的表達(dá)及神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的檢測 再灌注48 h后取L5部位脊髓前角灰質(zhì)進(jìn)行檢測。采用抗P-AKT多克隆抗體進(jìn)行免疫組化染色，并采用評分量化表[5]來評價各實(shí)驗(yàn)組P-AKT的表達(dá)程度。評分標(biāo)準(zhǔn)：0（無表達(dá)）、1（陽性）、2（強(qiáng)陽性）。另用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（terminal deoxyribonucleotidyl transferase， TdT）介導(dǎo)的帶生物素dUTP缺口末端標(biāo)記（TdTmediated dUTPbiotin nick end labeling， TUNEL）法原位檢測缺血再灌注后脊髓組織細(xì)胞凋亡的情況，以神經(jīng)元細(xì)胞核染色呈黃色或棕黃色時即為陽性，以凋亡指數(shù)（apoptosis index，AI）作為評定標(biāo)準(zhǔn)。凋亡指數(shù)判定：每張脊髓組織切片中至少1000個細(xì)胞中出現(xiàn)的凋亡細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 本次研究數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件統(tǒng)計分析，計量資料以（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)判定各實(shí)驗(yàn)組與相應(yīng)對照組間差異顯著性；等級資料采用wilcxon秩和檢驗(yàn)；評分給出各分值的例數(shù)，組間比較采用非參數(shù)（Kruska-Walis）檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1右美托咪定對神經(jīng)運(yùn)動功能的影響 假手術(shù)組實(shí)驗(yàn)大鼠后肢運(yùn)動功能無異常。模型組和右美托咪定治療組實(shí)驗(yàn)大鼠于缺血再灌注后均出現(xiàn)不同程度的癱瘓。右美托咪定治療組實(shí)驗(yàn)大鼠后肢運(yùn)動功能的恢復(fù)情況要優(yōu)于模型組（P<0.05），見表1。

2.2 脊髓神經(jīng)元P-AKT表達(dá)程度 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，DEX組P-AKT表達(dá)水平強(qiáng)于其它兩組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

2.3 脊髓神經(jīng)元凋亡指數(shù)的比較 空白對照組脊髓組織未見神經(jīng)元凋亡，模型組脊髓組織可見大量凋亡神經(jīng)元。DEX組凋亡神經(jīng)元較模型組減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表3。

3討論

既往認(rèn)為，脊髓缺血后神經(jīng)元的死亡方式為缺血壞死。但近年來研究認(rèn)為，細(xì)胞凋亡可能是脊髓缺血后神經(jīng)元死亡的主要方式[6]。細(xì)胞凋亡，是指機(jī)體細(xì)胞在發(fā)育過程中或在某些因素作用下，通過細(xì)胞內(nèi)基因及其產(chǎn)物的調(diào)控而發(fā)生的一種程序性細(xì)胞死亡。細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死不同，細(xì)胞凋亡不是一件被動的過程，而是主動過程。細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)變化的基本特征是：細(xì)胞質(zhì)凝聚，細(xì)胞核濃縮，凋亡小體形成。大鼠脊髓缺血再灌注損傷后6 h出現(xiàn)神經(jīng)元的凋亡，24 h達(dá)到高峰，主要出現(xiàn)在脊髓前、后角[7]。常規(guī)組織切片染色不易檢測出凋亡細(xì)胞，而TUNEL法是生物素標(biāo)記的dUTP在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT Enzyme）的作用下，可以連接到凋亡細(xì)胞中斷裂DNA的3'-OH末端，并與連接辣根過氧化酶（HRP，horse-radish peroxidase）的鏈霉親和素streptavidin特異性結(jié)合，后者又與POD底物H2O2、二氨基聯(lián)苯胺（DAB）產(chǎn)生深棕色反應(yīng)，特異準(zhǔn)確地定位正在凋亡的細(xì)胞，因而在光學(xué)顯微鏡下即可觀察凋亡細(xì)胞；由于正常的或正在增殖的細(xì)胞幾乎沒有DNA斷裂，因而沒有3'-OH形成，很少能夠被染色。TUNEL法敏感性和特異性極高，是目前國際上公認(rèn)的檢測凋亡細(xì)胞的手段[8]。

細(xì)胞凋亡所涉及的因素及信號傳導(dǎo)途徑非常復(fù)雜。最近的研究表明，PI3K / Akt信號通路是細(xì)胞重要的生存信號，其激活對保護(hù)神經(jīng)元免受缺血和缺氧損傷至關(guān)重要[9-11]。PI3K / Akt信號通路也是膜受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞的主要途徑，可以在維持細(xì)胞存活和抑制細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用。通過影響細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白，細(xì)胞周期控制蛋白的激活過程，抑制細(xì)胞凋亡和促進(jìn)細(xì)胞增殖[12，13]。PI3K可被細(xì)胞外信號激活，如酪氨酸激酶受體，非酪氨酸激酶受體，胰島素受體，活化的PI3K位于細(xì)胞膜中，可進(jìn)一步激活一系列下游蛋白激酶，如PKA，AKT和PKC，并調(diào)控多種病理生理過程，包括增殖，凋亡，遷移和惡性轉(zhuǎn)化。Akt是PI3K信號通路中的下游靶標(biāo)激酶之一。當(dāng)細(xì)胞被細(xì)胞外信號刺激時，活化的PI3K可產(chǎn)生PIP3，其可與Akt的PH結(jié)構(gòu)相互作用，將Akt轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜并將其激活成p-Akt，從而增加信號通路的級聯(lián)反應(yīng)調(diào)節(jié)凋亡[14]。AKT也可以對凋亡通路上的其他因子進(jìn)行磷酸化、抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞生存。腦缺血再灌注后，通過激活PI3K-AKT通路可減少神經(jīng)元凋亡，起到神經(jīng)保護(hù)作用。

有研究證實(shí)，DEX可以通過PKCα和CREB信號通路激活星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌GDNF[15]，而后者可以改善損傷后神經(jīng)元的恢復(fù)。本次研究發(fā)現(xiàn)，大鼠脊髓RI后，模型組脊髓前角神經(jīng)元內(nèi)P-AKT表達(dá)強(qiáng)假手術(shù)組，表明脊髓發(fā)生缺血再灌注損傷后，機(jī)體內(nèi)存在抗細(xì)胞凋亡的自我保護(hù)機(jī)制；與模型組比較，DEX組P-AKT表達(dá)水平增高，脊髓神經(jīng)元凋亡減少，可見DEX可以抑制缺血再灌注后脊髓神經(jīng)元的凋亡，其機(jī)制可能與激活PI3K-AKT通路有關(guān)。

本研究表明，DEX可以抑制大鼠脊髓RI后神經(jīng)元的凋亡，提高再灌注后大鼠后肢6，12，24，48 h的神經(jīng)功能評分，表明DEX對大鼠脊髓缺血RI有保護(hù)作用，其機(jī)制可能是DEX刺激脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌GDNF，而后者激活了PI3K-AKT通路，從而抑制了脊髓RI后神經(jīng)元的凋亡。

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收稿日期：2017-11-23；修回日期：2018-1-21

編輯/李樺