火鶴AaSERK基因克隆及其在體細(xì)胞胚胎發(fā)生中的表達(dá)分析

田 娜,王愛(ài)香,張克中,崔金騰,賈月慧

(北京農(nóng)學(xué)院 園林學(xué)院,北京 102206)

火鶴AaSERK基因克隆及其在體細(xì)胞胚胎發(fā)生中的表達(dá)分析

田 娜,王愛(ài)香,張克中*,崔金騰,賈月慧

(北京農(nóng)學(xué)院 園林學(xué)院,北京 102206)

為了探討體細(xì)胞胚胎發(fā)生相關(guān)類受體蛋白激酶(SERK)基因在火鶴體細(xì)胞胚胎發(fā)生中的作用,以火鶴胚性愈傷組織為材料,利用RT-PCR結(jié)合RACE技術(shù),克隆了火鶴體細(xì)胞胚胎發(fā)生相關(guān)類受體蛋白激酶基因(AaSERK),通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real time-PCR)技術(shù)分析了AaSERK的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示:(1)該基因全長(zhǎng)為1 949 bp,包含1 866 bp開(kāi)放閱讀框,編碼蛋白由622個(gè)氨基酸組成。(2)預(yù)測(cè)該基因具有SERK家族典型的結(jié)構(gòu)域:1個(gè)信號(hào)肽、1個(gè)亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域、5個(gè)富亮氨酸重復(fù)序列結(jié)構(gòu)域、1個(gè)SPP基序、1個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域、含11個(gè)亞區(qū)的激酶結(jié)構(gòu)域、1個(gè)C端結(jié)構(gòu)域。DNAMAN分析顯示,該基因編碼的氨基酸序列與其它植物的一致性達(dá)到65%～89%。(3)在離體誘導(dǎo)體細(xì)胞胚胎發(fā)生的各階段中,AaSERK基因在誘導(dǎo)階段及發(fā)育培養(yǎng)階段微弱表達(dá)或者幾乎不表達(dá),在繼代培養(yǎng)第30天的胚性愈傷組織中表達(dá)量最高。推測(cè)該基因可以作為火鶴體細(xì)胞胚胎發(fā)生的一個(gè)標(biāo)記基因。

火鶴;基因克隆;AaSERK基因;體細(xì)胞胚胎發(fā)生

火鶴(Anthuriumandraeanum)是經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高的重要觀賞植物之一,目前多通過(guò)組培再生不定芽方式繁育種苗,少見(jiàn)通過(guò)體細(xì)胞胚胎發(fā)生方式繁育組培苗。體細(xì)胞胚胎發(fā)生方式繁育組培苗具有如下優(yōu)點(diǎn):再生植株起源于單個(gè)胚性細(xì)胞,不會(huì)出現(xiàn)遺傳嵌合;結(jié)合液體懸浮培養(yǎng)或生物反應(yīng)器,能高通量生產(chǎn)火鶴種苗;重現(xiàn)胚胎發(fā)生途徑,再生苗生理年齡較小、生活力更強(qiáng)。

現(xiàn)已發(fā)現(xiàn),許多基因參與體細(xì)胞胚胎發(fā)生的調(diào)控,例如SERK基因[1]、LEAFYCOTYLEDON基因[2]、BABYBOOM基因[3]、AGAMOUS-Like15[4]、ARF5a基因[5]等,但這些基因多是在體細(xì)胞胚胎發(fā)生后才起作用。只有類受體蛋白激酶(somatic embryogenesis receptor-like kinase,SERK)基因是在體細(xì)胞由營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向胚性生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化中以及早期的體細(xì)胞胚胎發(fā)生中起作用。人們最初在胡蘿卜(Daucuscarota)中發(fā)現(xiàn)SERK基因,發(fā)現(xiàn)其在胚性細(xì)胞中表達(dá)且只表達(dá)到球形胚時(shí)期,在非胚性細(xì)胞及球形期后的體細(xì)胞胚中不表達(dá)。因此,SERK基因被認(rèn)為是胡蘿卜體胞胚發(fā)生的標(biāo)記基因[1]。后來(lái),人們?cè)邙喢?Dactylisglomerata)[6]、蜜桔(Citrusunshiu)[7]、仙客來(lái)(Cyclamenpersicum)[8]、馬尾松(Pinusmassoniana)[9]等植物中,均發(fā)現(xiàn)SERK基因也具有標(biāo)記成胚能力的作用。目前,已經(jīng)從多種植物中克隆到SERK基因[6-11],但火鶴AaSERK基因的研究還未見(jiàn)報(bào)道,對(duì)于AaSERK基因與火鶴體細(xì)胞胚胎發(fā)生之間的機(jī)理研究也未見(jiàn)報(bào)道。若能克隆火鶴AaSERK基因,有可能建立火鶴體細(xì)胞胚胎發(fā)生的分子標(biāo)記,為火鶴體細(xì)胞胚胎發(fā)生分子機(jī)理研究提供線索。前期研究中,我們已初步建立了火鶴‘阿拉巴馬’體細(xì)胞胚胎發(fā)生的形態(tài)學(xué)標(biāo)記和細(xì)胞學(xué)標(biāo)記的關(guān)聯(lián)體系[12]。

本研究以火鶴胚性愈傷組織為材料,采用RACE技術(shù)克隆火鶴AaSERK基因,檢測(cè)其在在誘導(dǎo)、繼代、發(fā)育階段的表達(dá)模式,為研究火鶴體細(xì)胞胚胎發(fā)生分子機(jī)理提供線索。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料來(lái)源于北京農(nóng)學(xué)院火鶴種質(zhì)資源圃收集的火鶴盆栽品種‘阿拉巴馬’。

胚性愈傷組織的獲得:參照先前的研究[12],火鶴幼嫩葉片切塊接種到1/2 MS+0.6 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L 6-BA培養(yǎng)基,黑暗培養(yǎng)2個(gè)月左右,獲得光滑緊實(shí)愈傷組織(誘導(dǎo)階段);將上述愈傷組織切割后轉(zhuǎn)至1/2 MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L KT+0.5 mg/L NAA培養(yǎng)基上,培養(yǎng)1個(gè)月后,獲得粗糙疏松愈傷組織,經(jīng)鏡檢為胚性愈傷組織[12](繼代培養(yǎng)階段);胚性愈傷組織轉(zhuǎn)至1/2 MS+0.5 mg/L 6-BA培養(yǎng)基上,通過(guò)胚狀體成苗方式產(chǎn)生根芽齊全幼苗(發(fā)育階段)。以繼代培養(yǎng)階段獲得的胚性愈傷組織為材料,進(jìn)行火鶴SERK基因的克隆。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 火鶴AaSERK基因保守片段的擴(kuò)增 以火鶴胚性愈傷組織為材料,采用改良CTAB法提取總RNA。30 μL RNAse-free水溶解RNA,1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA純度。

采用TaKaRa公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行第一鏈cDNA的合成。參考擴(kuò)增胡蘿卜及玉米SERK保守序列所用簡(jiǎn)并引物[1,12]設(shè)計(jì)本研究引物。共應(yīng)用到3條上游引物和2條下游引物(表1),組成6個(gè)引物對(duì):SERK-R1和SERK-F3,SERK-R1和SERK-F4,SERK-R1和SERK-F5,SERK-R2和SERK-F3,SERK-R2和SERK-F4,SERK-R2和SERK-F5。擴(kuò)增反應(yīng)體系為:第一鏈cDNA 1.0 μL,2×TaqGreen Mix 12.5 μL,上游引物1.0 μL,下游引物1.0 μL。將混合物混勻,短暫離心后,放入已預(yù)熱的PCR儀中執(zhí)行以下反應(yīng):94 ℃預(yù)變性5 min,94 ℃變性40 s,48 ℃退火30 s,72 ℃延伸40 s,38個(gè)循環(huán),72 ℃延伸10 min,4 ℃條件下保存。PCR完成后,將產(chǎn)物于1.2%的瓊脂糖凝膠中電泳分離(圖1,A),按照北京全式金生物技術(shù)有限公司說(shuō)明書(shū)切膠回收該片段,將回收的片段連接到pMD18-T載體上(TaKaRa),連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到top10感受態(tài)細(xì)胞中,挑取陽(yáng)性克隆送上海英俊基因測(cè)序中心進(jìn)行測(cè)序。保守片段的測(cè)序結(jié)果為后續(xù)的3′端和5′端引物設(shè)計(jì)做準(zhǔn)備。

1.2.2 cDNA末端擴(kuò)增 根據(jù)已經(jīng)獲得的保守片段分別設(shè)計(jì)3′端和5′端克隆的基因特異性引物(表1),以火鶴胚性愈傷組織提取的RNA為材料,分別進(jìn)行3′-RACE擴(kuò)增和5′-RACE擴(kuò)增。相關(guān)擴(kuò)增反應(yīng)均按TaKaRa公司的3′-RACE-Full Length cDNA Kit(D314)和5′-RACE -Full Length cDNA Kit(D315)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。這些反應(yīng)包括:3′-RACE的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng),Outer PCR反應(yīng),Inner PCR反應(yīng);3′-RACE去磷酸化處理,去帽子反應(yīng),5′-RACE Adaptor的連接,反轉(zhuǎn)錄反應(yīng),Outer PCR反應(yīng)和Inner PCR反應(yīng)。將得到的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離,回收擴(kuò)增產(chǎn)物并連接至pMD18-T載體,轉(zhuǎn)化到top10感受態(tài)細(xì)胞中,選陽(yáng)性克隆測(cè)序鑒定。

1.2.3AaSERK基因cDNA全長(zhǎng)的克隆 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)采用全式金反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄(AT301-01)。將兩端測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接得到全長(zhǎng)cDNA序列,根據(jù)此序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增完整ORF框的特異引物F02、R02(表1),以火鶴的胚性愈傷組織cDNA為模版進(jìn)行全長(zhǎng)克隆,PCR反應(yīng)體系為:ddH2O 14.7 μL,緩沖液(含Mg2+,10×Taq酶自帶)2.0 μL,dNTPs(10 mmol/L)0.4 μL,上游引物F02(50 ng/μL)0.8 μL,下游引物R02(50 ng/μL)0.8 μL,Taq聚合酶(5 μ/μL)0.2 μL,cDNA模板1.0 μL。反應(yīng)條件為:94 ℃預(yù)變性2 min,94 ℃變性30 s,50 ℃退火35 s,72 ℃延伸120 s,32個(gè)循環(huán),72 ℃延伸10 min,4 ℃條件下保存。目的片段與T-載體連接、轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coliTop10、陽(yáng)性轉(zhuǎn)化菌落檢測(cè)。陽(yáng)性克隆送上海英俊基因測(cè)序中心測(cè)序。

1.2.4 熒光定量PCR驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 根據(jù)得到的AaSERK基因cDNA全長(zhǎng)設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR特異引物YG-F1、YG-R1,預(yù)期擴(kuò)增長(zhǎng)度為129 bp。PCR反應(yīng)體系(25 μL):SYBRTMPremix ExTaqⅡ(2×)12.5 μL,YG-F1(10 μmol/L)0.5 μL,YG-R1(10 μmol/L)0.5 μL(表1),DNA模板2.0 μL,ddH2O 9.5 μL。采用如下PCR反應(yīng)程序:預(yù)變性95 ℃ 30 s,95 ℃變性10 s,62 ℃退火30 s,34個(gè)循環(huán)。將所得產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳后進(jìn)行常規(guī)切膠回收、連接轉(zhuǎn)化、藍(lán)白斑篩選、菌落PCR,挑取陽(yáng)性克隆送出測(cè)序,經(jīng)驗(yàn)證為火鶴SERK基因的片段。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果表明(圖2,箭頭所指),引物只擴(kuò)增出預(yù)期大小的片段,沒(méi)有引物二聚體和雜帶,可用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。

1.2.5 熒光定量PCR分析 取不同階段葉片或愈傷組織為材料:誘導(dǎo)培養(yǎng)階段第10天、第30天的葉片切塊邊緣,第50天、第70天的愈傷組織;繼代培養(yǎng)階段第10天、第20天、第30天的愈傷組織;發(fā)育培養(yǎng)階段第10天、第20天、第40天、第60天的愈傷組織。每個(gè)階段的樣品等量取3份材料,采用改良CTAB法提取RNA,分別檢測(cè)SERK基因表達(dá)量,檢測(cè)值取3次平均值。以零處理的葉片作為對(duì)照,對(duì)其11個(gè)不同時(shí)期培養(yǎng)物的AaSERK表達(dá)進(jìn)行定量分析。PCR反應(yīng)體系(25 μL):SYBRTMPremix ExTaqⅡ(2×)12.5 μL,YG-F1(10 μmol/L)0.5 μL,YG-R1(10 μmol/L)0.5 μL(表1),DNA模板2.0 μL,ddH2O 9.5 μL?；瘊QSERK基因和內(nèi)參基因(18S rRNA基因)均采用如下PCR反應(yīng)程序:預(yù)變性95 ℃ 30 s;95 ℃變性10 s;62 ℃退火30 s;50個(gè)循環(huán)。

1.2.6 生物信息學(xué)分析 獲得cDNA全長(zhǎng)序列后,將AaSERK序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中用BLAST工具進(jìn)行比對(duì)分析,發(fā)現(xiàn)許多相似度較高的序列。用ORF(open reading frame)finder軟件尋找開(kāi)放閱讀框;用DNAMAN進(jìn)行氨基酸翻譯和蛋白質(zhì)疏水性預(yù)測(cè),用Protparam軟件分析編碼蛋白的理化性質(zhì);用PredictProtein軟件和InterProScan軟件分別預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域;應(yīng)用TMpred軟件預(yù)測(cè)跨膜結(jié)構(gòu),應(yīng)用SignaIP軟件預(yù)測(cè)信號(hào)肽;運(yùn)用MEGA4軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

表1 PCR擴(kuò)增所用引物及其序列

2 結(jié)果與分析

2.1 火鶴SERK基因的克隆及序列分析

以火鶴葉片胚性愈傷組織的cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增,取6 μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示:引物SERK-R1和SERK-F3擴(kuò)增得到1 224 bp和825 bp的2條片段(圖1,A1),SERK-R1和SERK-F4擴(kuò)增得到1條762 bp條帶(圖1,A2),SERK-R1和SERK-F5未擴(kuò)增到條帶(圖1,A3),SERK-R2和SERK-F3擴(kuò)增得到1條922 bp條帶(圖1,A4),SERK-R2和SERK-F4擴(kuò)增得到1條436 bp的條帶(圖1,A5),SERK-R2和SERK-F5未擴(kuò)增到條帶(圖1,A6)。BLASTN分析發(fā)現(xiàn),擴(kuò)增的5條序列中,有4條序列(除825 bp片段外)與其它植物SERK基因具有較高的相似度;762 bp片段與其它植物SERK基因相似度最高,故以其作為3′-RACE和5′-RACE引物設(shè)計(jì)的參照序列。

通過(guò)3′-RACE與5′-RACE擴(kuò)增,電泳均檢測(cè)到大小約1 000 bp左右的擴(kuò)增產(chǎn)物,與預(yù)計(jì)大小相符,測(cè)序后得到了長(zhǎng)度分別為1 085 bp(圖1,B箭頭所指)和1 098 bp(圖1,C箭頭所指)的火鶴AaSERK基因3′端和5′端序列。

將以上克隆到的3段序列通過(guò)DNAMAN拼接后得到一個(gè)長(zhǎng)度為1 949 bpAaSERK基因全長(zhǎng)cDNA序列(圖3)。將拼接片段在NCBI上進(jìn)行ORF Finding查找得到1 869 bp ORF。分別在起始密碼子和終止密碼子附近設(shè)計(jì)全長(zhǎng)引物,最后擴(kuò)增得到包括1 869 bp在內(nèi)的1 949 bp基因全長(zhǎng)片段,其中起始密碼子位于19 bp處,終止密碼子位于1 888 bp處,共編碼622個(gè)氨基酸(圖1,D箭頭所指),將相關(guān)序列提交GenBank(登錄號(hào)為KP418564)。

Protparam軟件分析表明:AaSERK基因編碼蛋白質(zhì)分子量為68 037.8 D,等電點(diǎn)為5.75,為親水性蛋白。PredictProtein軟件預(yù)測(cè)表明:編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)以環(huán)形結(jié)構(gòu)最多,所占比例為59.65%;其次為α-螺旋結(jié)構(gòu),占25.88%;而β-折疊占的比例較少,僅為14.47%;具有由前24個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽,是具有3個(gè)跨膜螺旋的跨膜蛋白。

InterProScan等軟件分析表明:AaSERK具有典型SERK基因結(jié)構(gòu),包含1個(gè)信號(hào)肽(signal peptide,SP)、1個(gè)亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域(leu zipper,ZIP)、5個(gè)富亮氨酸重復(fù)序列(leu-rich repeat,LRR)結(jié)構(gòu)域、1個(gè)SPP(Ser-Pro-Pro)基序的富脯氨酸結(jié)構(gòu)域,1個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域(transmembrane region,TM)、含11個(gè)亞區(qū)的激酶結(jié)構(gòu)域(kinase domains)和1個(gè)C端結(jié)構(gòu)域(圖4)。

DNAMAN分析表明,AaSERK基因編碼的氨基酸序列與其它植物的一致性達(dá)到65%～89%。應(yīng)用MEGA4軟件對(duì)火鶴AaSERK與其它植物SERK氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析,結(jié)果顯示(圖5):二穗短柄草、高粱、玉米、小麥等禾本科植物的SERK基因聚在一起,禾本科植物與菠蘿(鳳梨科)、椰子(棕櫚科)及火鶴(天南星科,單子葉植物)聚為一類。薔薇科、蕓香科、茄科等雙子葉植物聚為另一類。這與普通分類的結(jié)果一致。

圖2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)M.DL2000;1.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,箭頭所指為目標(biāo)片段

圖1 AaSERK基因擴(kuò)增結(jié)果A.保守區(qū)片段;B.3′-RACE;C.5′-RACE;D.cDNA全長(zhǎng);MI.DL1500;M.DL2000;箭頭所指為目標(biāo)片段

圖3 火鶴AaSERK cDNA全長(zhǎng)核苷酸序列及其推導(dǎo)氨基酸序列標(biāo)識(shí)長(zhǎng)方形的堿基序列ATG和TGA分別表示起始密碼子和終止密碼子

2.2 火鶴SERK基因的表達(dá)分析

火鶴AaSERK基因在不同培養(yǎng)階段材料中的qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明(圖6):在加有2,4-D的誘導(dǎo)培養(yǎng)階段的第10、30天,幾乎檢測(cè)不到AaSERK表達(dá);此時(shí)葉片切塊邊緣誘導(dǎo)出愈傷組織,但這些愈傷組織經(jīng)鏡檢為非胚性愈傷組織[12],可見(jiàn)在火鶴非胚性愈傷組織中,檢測(cè)不到AaSERK表達(dá)。隨著誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間增加到第50、70天,檢測(cè)到AaSERK少量表達(dá);經(jīng)鏡檢,此時(shí)愈傷組織已有不定芽原基的分化[12],某些愈傷組織表面甚至長(zhǎng)出了不定芽,可見(jiàn)不定芽分化期AsSERK會(huì)有少量表達(dá)。在撤掉2,4-D的繼代培養(yǎng)第10天、第20天,幾乎檢測(cè)不到AaSERK表達(dá)。在繼代培養(yǎng)第30天,老愈傷組織切塊邊緣長(zhǎng)出新鮮疏松愈傷組織,經(jīng)鏡檢新鮮愈傷組織中已分化出大量多細(xì)胞原胚[12],鑒定為胚性愈傷組織;我們?cè)诖伺咝杂鷤M織中檢測(cè)到AaSERK基因的最高表達(dá)。進(jìn)入發(fā)育培養(yǎng)階段,僅在末期(發(fā)育培養(yǎng)第40天、第60天)檢測(cè)到AaSERK基因的微弱表達(dá),此時(shí)胚狀體已開(kāi)始進(jìn)行根芽的分化?？梢?jiàn),火鶴AaSERK基因在旺盛分化多細(xì)胞原胚的胚性愈傷組織中大量表達(dá),在器官分化階段(不定芽分化、胚狀體根芽分化)僅少量表達(dá)。

圖4 不同植物SERK氨基酸序列比對(duì)圖中從上至下依次代表的是玉米、菠蘿、火鶴、二穗短柄草、番木瓜、甜橙、溫州蜜桔、椰子、龍眼、湖北海棠、犬薔薇、西紅柿、秘魯番茄、馬鈴薯、高粱、小麥中相應(yīng)的SERK氨基酸序列;序列上部標(biāo)出的分別為信號(hào)肽、亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域、富亮氨酸重復(fù)序列結(jié)構(gòu)域、SPP基序的富脯氨酸結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域、激酶結(jié)構(gòu)域(其11個(gè)亞區(qū)用羅馬數(shù)字標(biāo)記)、C端結(jié)構(gòu)域;兩對(duì)半氨酸殘基用三角符號(hào)標(biāo)記

圖6 火鶴體胚發(fā)生過(guò)程中AaSERK基因的相對(duì)表達(dá)I、S、D分別代表誘導(dǎo)培養(yǎng)、繼代培養(yǎng)、發(fā)育培養(yǎng)階段;I-10代表誘導(dǎo)培養(yǎng)第10天

3 討 論

SERK基因最早由Schmidt從胡蘿卜中克隆出,他們發(fā)現(xiàn)2,4-D處理后,胡蘿卜實(shí)生苗下胚軸中能發(fā)育成體細(xì)胞胚的單個(gè)感受態(tài)細(xì)胞開(kāi)始表達(dá)SERK;感受態(tài)細(xì)胞分裂前膨大到35×90 μm時(shí),檢測(cè)到SERK表達(dá);當(dāng)感受態(tài)細(xì)胞分化成2～8個(gè)細(xì)胞原胚以及約100個(gè)細(xì)胞的小球形胚時(shí),SERK均顯著表達(dá);當(dāng)體細(xì)胞胚進(jìn)入球形胚中后期及魚(yú)雷形胚,SERK表達(dá)消失[1]。鴨茅中也發(fā)現(xiàn):葉肉組織上單個(gè)胚性細(xì)胞、2細(xì)胞原胚,球形胚均能檢測(cè)到SERK的表達(dá);球形胚后的棒形胚,僅在莖分生組織處有少量表達(dá)[6]。蜜桔CiSERKa基因在簡(jiǎn)單增殖的愈傷組織中檢測(cè)不到,但在胚性愈傷組織內(nèi)能檢測(cè)到[7]。仙客來(lái)(CyclamenpersicumMill.)的CpSERKa和CpSERKb基因,均能在具有胚性發(fā)生能力的組織中檢測(cè)到,而未獲得或喪失胚性能力的組織中檢測(cè)不到表達(dá)[8]。因此,SERK基因可能是某些植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生的早期標(biāo)記基因。

在本研究中,火鶴繼代培養(yǎng)第30天獲得的新愈傷組織為胚性愈傷組織,里面有大量發(fā)育不同步的多細(xì)胞原胚[12],而此時(shí)我們檢測(cè)到了AaSERK的最高表達(dá),其相對(duì)表達(dá)量約是誘導(dǎo)培養(yǎng)第70天非胚性愈傷組織中的10倍。馬尾松PmSERK1在誘導(dǎo)培養(yǎng)的非胚性愈傷組織中不表達(dá),而在經(jīng)繼代培養(yǎng)的胚性愈傷組織中表達(dá)量很高且逐漸增加,且在培養(yǎng)第20天時(shí)達(dá)到最高[9]。我們的研究結(jié)果與其非常相似。因此,初步確定克隆的火鶴AaSERK基因可作為火鶴體細(xì)胞胚胎發(fā)生的早期標(biāo)記基因。

最開(kāi)始人們認(rèn)為SERK僅具有標(biāo)記體細(xì)胞胚胎發(fā)生的功能,后來(lái)發(fā)現(xiàn)SERK基因也具有多功能性:其表達(dá)與“細(xì)胞重新編程”(cellular reprogramming)相關(guān),其通常在“發(fā)育轉(zhuǎn)換區(qū)域”(developmental transition zones)或“發(fā)育轉(zhuǎn)換時(shí)期”(developmental transition period)表達(dá)量上調(diào)[13-17]。本研究中,誘導(dǎo)培養(yǎng)第50和70天,檢測(cè)到了AaSERK的輕微表達(dá),可能是因?yàn)榇藭r(shí)愈傷組織開(kāi)始了芽原基分化;發(fā)育培養(yǎng)階段第40和60天,SERK基因表達(dá)有少量上調(diào),可能是因?yàn)榕咝杂鷤M織開(kāi)始向胚芽和胚根發(fā)育。上述分化或發(fā)育均是“細(xì)胞重新編程”,出現(xiàn)了“發(fā)育轉(zhuǎn)換區(qū)域”或“發(fā)育轉(zhuǎn)換時(shí)期”,所以能檢測(cè)到AaSERK的輕微表達(dá)。

本研究在前期研究[12]的基礎(chǔ)上,首次從火鶴胚性愈傷組織克隆到了AaSERK基因,并檢測(cè)到旺盛分化的胚性愈傷組織中高表達(dá),在其它時(shí)期不表達(dá)或弱表達(dá),初步認(rèn)為克隆AaSERK基因可作為火鶴體細(xì)胞胚胎發(fā)生的標(biāo)記基因。這將為研究火鶴體細(xì)胞胚胎發(fā)生的分子機(jī)理提供線索。

SERK基因?qū)儆诟涣涟彼嶂貜?fù)序列受體類蛋白激酶(leucine-rich repeat sequence receptor-like kinase,LRR-RLK)家族中的第二亞類[18-19]。受配體誘導(dǎo),SERK基因可能與膜上的其它RLKs形成二聚體或多聚體,引起胞內(nèi)激酶域磷酸化,激活了下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。擬南芥中,SERK基因可能通過(guò)蕓苔素(brassinosteroid,BR)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,激發(fā)了體細(xì)胞胚的發(fā)生[20-23]。AaSERK基因通過(guò)何種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑介導(dǎo)火鶴體細(xì)胞胚胎發(fā)生,將是我們下一步研究的方向。

[1] SCHMIDT E D,GUZZO F,TOONEN M A J,etal.A leucine-rich repeat containing receptor-like kinase marks somatic plant cells competent to form embryos[J].Development,1997,124(1):2 049-2 062.

[2] STONE S,KWONG L,YEE K,etal.LEAFYCOTYLEDON2 encodes a B3 domain transcription factor that induces embryo development[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,2001,98(20):11 806-11 811.

[3] BOUTILIER K,OFFRINGA R,SHARMA V K,etal.Ectopic expression ofBABYBOOMtriggers a conversion from vegetative to embryonic growth[J].ThePlantCell,2002,14(8):1 737-1 749.

[4] HARDING E W,TANG W N,NICHOLS K W,etal.Expression and maintenance of embryogenic potential is enhanced through constitutive expression ofAGAMOUS-Like15[J].PlantPhysiology,2003,133(2):653-663.

[5] LIN L X(林麗霞),QU Y(屈 瑩),XU Y(徐 洋),etal.Cloning and expression analysis ofDlARF5ain the process of somatic embryogenesis inDimocarpuslonganLou[J].ActaBot.Boreal.-Occident.Sin.(西北植物學(xué)報(bào)),2014,34(6):1 075-1 082(in Chinese).

[6] SOMLEVA M N,SCHMIDT E D L,VRIES DE S C.Embryogenic cells inDactylisglomerataL.(Poaceae) explants identified by cell tracking and bySERKexpression[J].PlantCellReports,2000,19(7):718-726.

[7] SHIMADA T,HIRABAYASHI T,ENDO T,etal.Isolation and characterization of the somatic embryogenesis receptor-like kinase gene homologue (CitSERK1) fromCitrusunshiuMarc[J].ScientiaHorticulturae,2005,103(2):233-238.

[8] 翠 榮.仙客來(lái)體細(xì)胞胚胎發(fā)生、發(fā)育及SERK基因在體細(xì)胞胚性轉(zhuǎn)化過(guò)程的表達(dá)特性[D].山東青島:中國(guó)海洋大學(xué),2009.

[9] GAO Y(高 燕),XI M L(席夢(mèng)利),WANG G F(王桂鳳),etal.Molecular characterization and expression analysis ofPmSERK1 during somatic embryogenesis in masson pine[J].MolecularPlantBreeding(分子植物育種),2010,8(1):53-58(in Chinese).

[10] HECHT V,VIELLE-CALZADA J P,HARTOG M V,etal.TheArabidopsissomatic embryogenesis receptor kinase 1 gene is expressed in developing ovules and embryos and enhances embryogenic competence in culture[J].PlantPhysiology,2001,127(3):803-816.

[11] HU H,XIONG L,YANG Y.RiceSERK1 gene positively regulates somatic embryogenesis of cultured cell and host defense response against fungal infection[J].Planta,2005,222(1):107-117.

[12] WANG A X(王愛(ài)香),ZHANG K ZH(張克中),JIA Y H(賈月慧),etal.Histocytology observation onAnthuriumandraeanumcallus during embryoid induction stage and development stage[J].MolecularPlantBreeding(分子植物育種),2011,9(97):1 700-1 705(in Chinese).

[13] BAUDINO S,HANSEN S,BRETTSCHNEIDER R,etal.Molecular characterisation of two novel maize LRR receptor-like kinases,which belong to theSERKgene family[J].Planta,2001,213(1):1-10.

[14] KWAAITAAL M A C J,DE VRIES S C,RUSSINOVA E.Arabidopsisthalianasomatic embryogenesis receptor kinase 1 protein is present in sporophytic and gametophytic cells and undergoes endocytosis[J].Protoplasma,2005,226(1/2):55-65.

[15] ITO Y,TAKAYA K,KURATA N.Expression ofSERKfamily receptor-like protein kinase genes in rice[J].BiochimicaetBiophysicaActa,2005,1 730(3):253-258.

[16] THOMAS C,MEYER D,HIMBER C,etal.Spatial expression of a sunflowerSERKgene during induction of somatic embryogenesis and shoot organogenesis[J].PlantPhysiologyandBiochemistry,2004,42(1):35-42.

[17] NOLAN K E,KURDYUKOV S,ROSE R J.Expression of the somatic embryogenesis receptor like kinase1 (SERK1) gene is associated with developmental change in the life cycle of the model legumeMedicagotruncatula[J].JournalofExperimentalBotany,2009,60(6):1 759-1 771.

[18] GOU X,HE K,YANG H,YUAN T,etal.Genome-wide cloning and sequence analysis of leucine-rich repeat receptor-like protein kinase genes inArabidopsisthaliana[J].BMCGenomics,2010,11(1):19-34.

[19] SHIU S H,BLEECKER A B.Receptor-like kinase fromArabidopsisfrom a monophyletic gene family related to animal receptor kinases[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,2001,98(19):10 763-10 768.

[20] KARLOVA R,BOEREN S,RUSSINOVA E,etal.TheArabidopsissomatic embryogenesis receptor-like kinase1 protein complex includes brassinosteroid insensitive1[J].ThePlantCell,2006,18(3):626-638.

[21] ALBRECHT C,RUSSINOVA E,KEMMERLING B,etal.Arabidopsissomatic embryogenesis receptor kinase proteins serve brassinosteroid-dependent and independent signaling pathways[J].PlantPhysiology,2008,148(1):611-619.

[22] GOU X,YIN H,HE K,etal.Genetic evidence for an indispensable role of somatic embryogenesis receptor kinases in brassinosteroid signaling[J].PlosGenetics,2012,8(1):1-12.

[23] MALIK M R,WANG F,DIRPAUL J M,etal.Isolation of an embryogenic line from non-embryogenicBrassicanapuscv.Westar through microspore embryogenesis[J].JournalofExperimentalBotany,2008,59(10):2 857-2 873.

(編輯:宋亞珍)

Clone and Expression ofAaSERKGene inAnthuriumandraeanum’s Somatic Embryogenesis

TIAN Na,WANG Aixiang,ZHANG Kezhong*,CUI Jinteng,JIA Yuehui

(College of Landscape,Beijing University of Agriculture,Beijing 102206,China)

To study the function of somatic embryogenesis receptor-like kinase gene (SERK) inAnthuriumandraeanum’ s somatic embryogenesis,we isolated a novelAaSERKgene from the embryogenic callus ofA.andraeanumby reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) and rapid amplification of cDNA ends (RACE).The expression levels ofAaSERKwere analyzed by Real time-PCR.The results showed that:(1)The full-length cDNA ofAaSERKwas 1 949 bp with an open reading frame of 1 866 bp encoding a protein of 622 amino acid residues.(2)It was speculated that theAaSERKwas a typicalSERKgene with one signal peptide,one leucine zipper domain,five Leu-rich repeat(LRR) domains,one SPP motif,one transmembrane domain,the kinase domain with eleven subdomains,and one C-terminal domain.DNAMAN analysis showed that the putative AaSERK amino acid sequence had 65%-89% identity with those of the other plants.(3)In the different stages of somatic embryogenesisinvitro,the expression ofAaSERKwas weak or little in the inducing stage and the developmental stage,but was the highest in the embryogenic callus on the 30th day of the subculture stage.It was speculated that theAaSERKmight be one of the marker genes of somatic embryogenesis inA.andraeanum.

Anthuriumandraeanum;gene cloning;AaSERKgene;somatic embryogenesis

1000-4025(2015)04-0674-08

10.7606/j.issn.1000-4025.2015.04.0674

2014-11-25;修改稿收到日期:2015-02-08

北京市科技提升計(jì)劃(PXM2013-014207-000079,PXM2014-014207-000081);北京市屬高等學(xué)校創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)項(xiàng)目(IDHT20150503);北京市教委科技創(chuàng)新平臺(tái)項(xiàng)目(PXM2014-014207-000018);城鄉(xiāng)生態(tài)環(huán)境北京實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目(PXM2015-014207-000014)

田 娜(1989-),女,在讀碩士研究生,主要從事花卉栽培與育種研究。E-mail:632416963@qq.com

*通信作者:張克中,博士,教授,主要從事花卉育種與產(chǎn)業(yè)化研究。E-mail:zkzzxd@vip.sina.com

Q785;Q789

A