mTOR/P70S6K信號通路在宮頸癌組織中的表達及其臨床意義

張文芳，潘春燕，張印星

mTOR/P70S6K信號通路在宮頸癌組織中的表達及其臨床意義

張文芳，潘春燕，張印星

目的探討mTOR/P70S6K信號通路在宮頸癌組織中的表達水平及其相關(guān)臨床診斷、治療意義。方法

收集2012年1月—2014年1月手術(shù)切除或進行活檢的正常宮頸組織65例，宮頸癌組織、癌旁組織各85例，提取組織中的mRNA，應(yīng)用RT-PCR的方法來檢測3種組織中mTOR和P70S6K mRNA的表達水平，并進行分析。結(jié)果 宮頸癌組織中mTOR、P70S6K mRNA的表達明顯高于癌旁組織及正常組織(P＜0.05)，mTOR、P70S6K mRNA水平在宮頸癌組織、癌旁組織及正常組織中均呈正相關(guān)(P＜0.05)。結(jié)論 mTOR信號通路在宮頸癌組織中處于活化狀態(tài)，其在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展以及向其他部位轉(zhuǎn)移中具有重要作用，是一個診斷和治療的分子靶點。

宮頸腫瘤;TOR絲氨酸－蘇氨酸激酶;核糖體蛋白質(zhì)S6激酶類，70-kDa;他克莫司結(jié)合蛋白質(zhì)類

宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一，在女性惡性腫瘤發(fā)病率中占第2位，僅低于乳腺癌。據(jù)統(tǒng)計全世界每年宮頸癌的新發(fā)病例約50萬例，并且每年有27萬左右的婦女死于宮頸癌，死亡率在婦科惡性腫瘤中居于首位，85%以上的病例出現(xiàn)在發(fā)展中國家。中國每年宮頸癌的新發(fā)病例約14萬，占全世界總數(shù)的三分之一以上［1］。隨著醫(yī)學科學技術(shù)的進步，宮頸癌在早期診斷、早期治療等方面都取得了較大的進展，但是宮頸癌發(fā)生發(fā)展的機制目前仍不明確。闡明宮頸癌的分子生物學發(fā)病機制，獲得宮頸癌分子生物學診斷、治療的特異性標志物，為宮頸癌的早期診斷和治療提供新的作用靶點［2］，是目前研究的一個重要課題。

哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是由多個細胞信號介導(dǎo)的細胞信號通路，包括激素(胰島素、生長激素)、營養(yǎng)素(氨基酸、葡萄糖)、細胞應(yīng)激狀態(tài)等，它是一種非典型的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。mTOR信號通路在正常機體內(nèi)細胞的增殖和分化過程中具有重要的作用，目前還發(fā)現(xiàn)其在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中具有作用，例如在乳腺癌、結(jié)腸癌、淋巴瘤等組織中的表達出現(xiàn)異常［3］，而對于其在宮頸癌細胞和組織表達的研究較少。mTOR主要是通過其信號通路下的蛋白P70S6K發(fā)揮作用，P70S6K也是目前研究比較多的mTOR下游調(diào)節(jié)因子［4］，經(jīng)過活化后可以激活核糖體40S小亞基蛋白，從而起到相應(yīng)的分子生物學作用。本研究通過研究mTOR/P70S6K信號通路在宮頸癌組織中的表達，來初步探討其在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的作用，為宮頸癌的早期診斷、早期預(yù)防和基因治療奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料來源 收集2012年1月—2014年1月我院手術(shù)切除或進行活檢的宮頸組織標本，其中正常宮頸組織65例，年齡 30 ～58(46．20 ±6．98)歲;宮頸癌組織、癌旁組織各85例，年齡28～60(43．8±7．12)歲;所有組織常規(guī)取材后，在離體30 min內(nèi)儲存在－80℃冰箱里，備用。

1.2 主要試劑 Trizol試劑盒、RT-PCR試劑盒和DNA標記物購自上海生工生物工程公司。引物依據(jù)mTOR和P70S6K的DNA序列進行設(shè)計，并由北京博大泰克生物技術(shù)公司設(shè)計合成。

表1 IL-18基因啟動子-137G/C、-607C/A位點多態(tài)性引物

1.3 RT-PCR反應(yīng)

1.3.1 RT反應(yīng)體系:2μl、5×RT B緩沖液，1μl dNTP 混合液(10 mmol/L)，0．5 μl Oligo-dT，0．5 μl RNA 酶抑制劑(40 U/μl)，0．5 μl AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶，5．0 μl樣品 RNA，0．5 μl RNA free H2O。42℃、45 min;95℃、5 min;冰浴5 min，共35個循環(huán)。

1.3.2 PCR 反應(yīng)循環(huán)條件:2．5 μl RT產(chǎn)物，0．5 μl Taq mix DNA polymerase，0．5 μl 上 游 引 物(5 μmol/L)，0．5 μl下游引物(5 μmol/L)，0．5 μl dNTP(10 mmol/L)，2．5 μl 10 × PCR Buffer，加ddH2O補充至總體積為 25．0μl。預(yù)變性溫度94℃、3 min;變性溫度 94℃、30 s;退火溫度 60℃、30 s;延伸溫度72℃、90 s;共35個循環(huán);最后延伸溫度 72℃、5 min。

1.3.3 PCR反應(yīng)產(chǎn)物檢測:用瓊脂糖凝膠電泳將得到的PCR產(chǎn)物進行分離后，溴化乙啶進行染色，根據(jù)DNA標準條帶確認擴增產(chǎn)物。凝膠成像分析儀掃描拍照，使用凝膠成像分析系統(tǒng)對條帶進行光密度掃描分析測定條帶灰度值。對比目的基因條帶灰度值與內(nèi)參基因電泳條帶灰度值，計算目的基因的相對表達水平。

2 結(jié)果

2.1 宮頸癌組織、相應(yīng)癌旁組織以及正常宮頸組織中mTOR mRNA的表達 宮頸癌組織、癌旁及正常宮頸組織中mTOR基因的擴增產(chǎn)物均有特異性條帶顯示，見圖1。宮頸癌組織中mTOR mRNA的表達水平為 0．624±0．308，其明顯高于癌旁組織(0.415 ±0．108)及正常組織(0．369 ±0．078)，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);癌旁組織高于正常組織，但差異無統(tǒng)計學意義(P=0.064)。

圖1 3組宮頸組織中m TOR mRNA的表達

2.2 P70S6K mRNA在宮頸癌組織、癌旁組織以及正常宮頸組織中的表達情況 宮頸癌組織、癌旁及正常宮頸組織的PCR擴增產(chǎn)物均顯示特異性條帶，如圖2。P70S6K mRNA在宮頸癌組織中的表達水平(0．598 ±0．256)明顯高于癌旁組織(0．468 ±0.154)及正常組織(0．408 ±0．112)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);癌旁組織高于正常組織，但差異無統(tǒng)計學意義(P=0.090)。

圖2 3組宮頸組織中P70S6K mRNA的表達

2.3 宮頸癌組織、癌旁組織以及正常宮頸組織中mTOR、P70S6K mRNA表達的相關(guān)性 mTOR、P70S6K mRNA水平在宮頸癌組織、癌旁組織及正常組織中均呈正相關(guān)(P＜0.05)，見表2。

表2 3組宮頸組織中m TOR、P70S6K m RNA表達的相關(guān)性(±s)

表2 3組宮頸組織中m TOR、P70S6K m RNA表達的相關(guān)性(±s)

組別 例 mTORmRNA P70S6KmRNA r P宮頸癌組織85 0．624 ±0．308 0．598 ±0．256 0．569 0．013癌旁組織 85 0．415 ±0．108 0．468 ±0．154 0．611 0．005正常宮頸組織65 0．369 ±0．078 0．408 ±0．112 0．745 0．014

3 討論

近年研究表明人乳頭瘤狀病毒感染是導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生的一個重要因素。但多數(shù)感染人乳頭瘤狀病毒的患者最終并不會發(fā)展成宮頸癌［5］。隨著人們對惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子生物學的深入研究，發(fā)現(xiàn)調(diào)控細胞生長的一些信號通路在腫瘤發(fā)生過程中具有非常重要的作用，所以信號通路、細胞因子漸漸成為人們進行診斷、治療腫瘤的靶點，如VEGFa、TP53、PIK3CA、MEK/ERK、mTOR/P70S6K 等多個信號通路，mTOR/P70S6K信號通路就是其中之一［6-13］，這些通路中的信號傳導(dǎo)均與mTOR/P70S6K的表達有一定的關(guān)系，因此，mTOR/P70S6K信號通路在宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展過程中的作用非常重要。

mTOR是在分析不同啤酒酵母突變體對雷帕霉素抵抗作用的差別時發(fā)現(xiàn)的。其廣泛存在于各種細胞中［14-16］，是一類保守的大分子蛋白質(zhì)，mTOR信號通路在正常細胞和腫瘤細胞的生長、分化的過程中具有較為重要的作用。這個信號通路的活化會抑制細胞凋亡，并且促進細胞的存活和增殖。它與正常細胞的癌變、癌細胞的生存、增殖具有緊密的關(guān)系，其在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮著不可替代的作用［17-18］。Rashmi等［19-20］研究表明，通過阻斷 mTOR信號通路可以調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號通路，進而促進宮頸癌細胞的凋亡，PI3K/AKT信號通路在各種腫瘤組織中均有突變，影響腫瘤細胞放化療后的治療效果及預(yù)后。

本研究表明，宮頸癌組織中mTOR mRNA的表達水平明顯高于癌旁組織及正常宮頸組織，同時，宮頸癌組織中P70S6K mRNA的表達水平也明顯高于癌旁及正常宮頸組織。宮頸癌組織中P70S6K mRNA、P70S6K mRNA的表達水平與癌旁組織及正常宮頸組織比較，均具有明顯統(tǒng)計學差異。mTOR mRNA、P70S6K mRNA在宮頸癌組織、癌旁組織、正常宮頸組織中的表達均呈正相關(guān)，組織中mTOR mRNA的表達水平越高，相應(yīng)的P70S6K mRNA表達水平也越高。這也證實了P70S6K是mTOR信號通路中下游的一個比較重要的作用靶點，其活化后，能夠使P70S6K磷酸化，進而發(fā)揮其調(diào)控與各種生理生化活動相關(guān)蛋白質(zhì)的合成，最終達到細胞的生長和增殖。

綜上所述，mTOR信號通路在宮頸癌組織中處于活化狀態(tài)，其在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過程中，宮頸癌向其他部位轉(zhuǎn)移的過程中具有重要的作用。同時其也是具有非常好的診斷和治療前景的靶點，為宮頸癌的早期診斷、基因治療等提供了一定的基礎(chǔ)。

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Expression ofmTOR/P70S6K Signaling Pathway in Human Tissues of Cervical Cancer and Its Clinical Significance

ZHANGWen-fang，PAN Chun-yan，ZHANG Yin-xing(Department of Obstetrics and Gynecology，Central Hospital of Huangshi City，Huangshi，Hubei435000，China)

ObjectiveTo analyze the expression ofmTOR/P70S6K signaling pathway in human tissues of cervical cancer and its clinical significance．MethodsA total of65 normal cases of cervical tissues(group A)，85 cases of cervical cancer tissues(group B)and 85 casesof para-carcinoma tissues(group C)from patientsundergoing exairesisor biopsy during January 2012 and January 2014 were collected，and thenmRNA wasobtained from all the groups．ThemRNA expressions ofmTOR and P70S6K in the three groupswere detected using reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR)method，and then the expressions were analyzed．ResultsThe mRNA expressions of mTOR and P70S6K in group C were significantly higher than those in group A and B(P＜0.05)，and themRNA expressions of mTOR and P70S6K had significantly positive correlations in the three groups(P＜0.05)．ConclusionThemTOR signaling pathway is in an activated state in human tissues of cervical cancer，and plays an important role in the pathogenesis，development and metastasis，therefore itmay be used as a therapeutic target．

Uterine cervical neoplasms;TOR serine-threonine kinases;Ribosomal protein S6 kinases，70-kDa;Tacrolimus binding proteins

R737．33

A

2095-140X(2015)04-0012-04

10．3969/j．issn．2095-140X．2015．04．004

435000湖北黃石，黃石市中心醫(yī)院婦產(chǎn)科

2014-12-17 修回時間:2015-01-16)

·小經(jīng)驗·