蛋白激酶D1在大鼠骨髓源性內(nèi)皮祖細(xì)胞中的促血管新生作用

劉 暖，楊 雷，毛秉豫，徐國(guó)昌，葉松山，張培華，張?芳

（南陽理工學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，河南南陽 473004）

蛋白激酶D1在大鼠骨髓源性內(nèi)皮祖細(xì)胞中的促血管新生作用

劉 暖，楊 雷，毛秉豫，徐國(guó)昌，葉松山，張培華，張?芳

（南陽理工學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，河南南陽 473004）

中國(guó)圖書分類號(hào)：R-332；R329．24；R345．44；R345.57；R364.3；R977.3

摘要：目的 探討蛋白激酶D1（PKD1）對(duì)大鼠骨髓源性內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs）黏附、遷移、增殖、血管形成能力及內(nèi)皮型一氧化氮合成酶（eNOS）表達(dá)的影響。方法 體外培養(yǎng)、分離和鑒定大鼠骨髓源性EPCs，觀察PKD1及其特異性阻斷劑CID755673對(duì)EPCs的黏附、遷移、增殖、血管形成能力的影響，以及對(duì)EPCs中eNOS的mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果 EPCs體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)表明，PKD1可明顯促進(jìn)EPCs的黏附、遷移和增殖，提升EPCs的血管形成能力，上調(diào)EPCs中eNOS的mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)水平。結(jié)論 PKD1具有調(diào)控EPCs促血管新生的作用，其促血管新生的作用可能以一種依賴eNOS的方式進(jìn)行。

關(guān)鍵詞：蛋白激酶D1；內(nèi)皮祖細(xì)胞；血管新生；內(nèi)皮型一氧化氮合成酶；遷移；增殖

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2015－8－10 14：37 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20150810．1437．016．html

蛋白激酶D（protein kinase D，PKD）屬于進(jìn)化上高度保守的鈣／鈣調(diào)蛋白依賴性的絲氨酸／蘇氨酸激酶家族，其重要家族成員之一PKD1參與很多基礎(chǔ)的生物進(jìn)程調(diào)節(jié)，包括信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞的增殖和分化、跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、分泌、免疫調(diào)節(jié)、心肌細(xì)胞的收縮、血管新生、腫瘤等［1］。特別是PKD1在腫瘤形成的進(jìn)程中倍受關(guān)注，PKD1信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)和胰腺癌、肝癌、胃癌、腸癌、乳腺癌、前列腺癌等的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［2］，其原因在于PKD1既可以直接促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖和分化，又促進(jìn)癌細(xì)胞生長(zhǎng)區(qū)域血管的新生。鑒于此，抗PKD1抑制腫瘤的方法在胰腺癌、乳腺癌等治療中已經(jīng)被提出，如特異的PKD1抑制劑CRT0066101可以明顯抑制小鼠胰腺癌腫瘤細(xì)胞的增生［2］。

近年來，在缺血性心血管系統(tǒng)疾病的治療中，內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cells，EPCs）療法是潛在的最有希望的治療策略之一，其可以被誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞［3］，實(shí)現(xiàn)缺血損傷心肌組織真正意義上的血管新生。PKD1既然可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和腫瘤組織中血管的新生，那么是否也可能有促進(jìn)EPCs黏附、遷移、增殖，誘導(dǎo)EPCs分化為血管的作用？本研究擬對(duì)此進(jìn)行探討并分析其可能作用機(jī)制，為以“PKD1”這一潛在可能靶點(diǎn)治療缺血性心血管疾病提供新的思路。

1　材料與儀器

1．1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠購自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，♂，清潔級(jí)，8周齡，重約200～240 g，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（豫）2010－0002，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：1000142。

1．2藥物與試劑 PKD1購自美國(guó)Pierce公司（生產(chǎn)批號(hào)為OSP00005W），PKD1特異阻斷劑CID755673購自美國(guó)MedChemExpress公司（生產(chǎn)批號(hào)為2011756），DNA酶I、Dulbecco′s PBS、FBS、膠原酶I、BrdU、BrdU鼠單克隆抗體購自上海寶曼生物科技有限公司（生產(chǎn)批號(hào)分別為L(zhǎng)S002004、28374、SH30077、LS004194、83224、MMS-139S-250）；EBM-2培養(yǎng)基購自北京達(dá)科為生物技術(shù)有限公司（生產(chǎn)批號(hào)為CC-3156）；CD133、CD34、eNOS、VEGFR-2抗體購自天津恒業(yè)生物科技有限公司（生產(chǎn)批號(hào)為EL910835、EL162014、EL163112和EL171852）；羊抗兔IgG、DAB顯色液購自武漢博士德生物工程有限公司（生產(chǎn)批號(hào)為TC1378、DD1660）；FN、FITC和DAPI購自北京碧橙藍(lán)生物科技有限責(zé)任公司（生產(chǎn)批號(hào)為PA127507、PA185438和62247）；其它試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1．3主要儀器 A2-1389型生物安全柜（美國(guó)Thermo Scientific公司）；164-5052型PowerPac HC

電泳儀及FACSCanto II型流式細(xì)胞儀（美國(guó)BIO-RAD公司）；Bullet Blender Storm組織細(xì)胞破碎儀（美國(guó)Next Advance公司）；Nikon Tis型熒光顯微鏡及Nikon NIS-Elements Software BR分析系統(tǒng)（日本尼康公司）。

2　方法

2．1EPCs的體外分離、培養(yǎng)和鑒定 取體重為200～240 g的健康♂SD大鼠，頸椎脫臼處死后，75%乙醇浸泡10 min，無菌操作環(huán)境下取出脛腓骨，用含肝素及DNA酶I的Dulbecco′s PBS反復(fù)沖洗骨髓，收集骨髓液，小心置入等量的淋巴細(xì)胞分離液之中，1 700 r·min－1離心30 min，無菌毛細(xì)吸管吸取分離液中間白膜層，5×PBS重懸細(xì)胞，離心后再用含2%FBS的EBM-2培養(yǎng)基重懸，按每平方厘米105個(gè)標(biāo)準(zhǔn)接種于培養(yǎng)板中，24 h后將未貼壁的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入預(yù)先用50 mg·L－1FN包被的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)，3 d后換第1次液，之后每隔3 d換液1次，倒置顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察，7－10 d后，待細(xì)胞融合80%后，采用膠原酶Ⅰ消化后傳代培養(yǎng)。對(duì)培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞觀察其生長(zhǎng)狀態(tài)，分別在4、7、10、14 d照相并記錄。對(duì)新分離的骨髓單核細(xì)胞進(jìn)行滴片，于d 4、7、10、14取生長(zhǎng)良好的原代細(xì)胞，重懸于PBS中，分別與EPCs細(xì)胞表面標(biāo)記物CD133、CD34、VEGFR-2結(jié)合，再用FITC染色，DAPI復(fù)染，檢測(cè)上述標(biāo)記物陽性表達(dá)的細(xì)胞。

2．2PKD1對(duì)EPCs黏附的影響 提前用50 mg· L－1FN包被細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔再接種5×104個(gè)EPCs，培養(yǎng)過夜，形成單皮層后轉(zhuǎn)入無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)5 h，用鈣黃綠素標(biāo)記EPCs后的制備單細(xì)胞懸液，37℃下孵育30 min。實(shí)驗(yàn)分5個(gè)組：A組，空白對(duì)照組；B組，25 μg·L－1PKD1干預(yù)組；C組，50 μg ·L－1PKD1干預(yù)組；D組，100 μg·L－1PKD1干預(yù)組；E組，PKD1（100 μg·L－1）＋CID755673（100 μg·L－1）干預(yù)組，以下簡(jiǎn)稱CID755673干預(yù)組。每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。各組干預(yù)后，在37℃下、5%CO2孵箱中孵育30 min，用PBS輕輕沖洗細(xì)胞，去除未黏附細(xì)胞，倒置顯微鏡40×下，隨機(jī)取6個(gè)視野拍照，計(jì)數(shù)黏附細(xì)胞個(gè)數(shù)，取平均值。

2．3PKD1對(duì)EPCs遷移的影響 用8 μm孔徑的24孔transwell進(jìn)行遷移實(shí)驗(yàn)，先分別在細(xì)胞小室的上、下室加入50 mg·L－1FN，再注入含2%FBS的EBM-2培養(yǎng)基。然后在上室按照每孔2×104個(gè)的密度接種EPCs，在下層加入A組：空白對(duì)照EBM-2；B-D組：PKD1（25、50、100 μg·L－1）；E組：PKD1 （100 μg·L－1）＋CID755673（100 μg·L－1），每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。培養(yǎng)24 h后，用棉簽擦去上室內(nèi)的細(xì)胞，2%多聚甲醛固定，Giemsa染色，40×下隨機(jī)取6個(gè)視野，倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)遷移過膜的細(xì)胞數(shù)量，取平均值。

2．4PKD1對(duì)EPCs增殖的影響 將EPCs用含2%FBS的EBM-2的基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸，每孔104個(gè)加入96孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞貼壁后，更換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，每孔加入終濃度為10 μmol·L－1的BrdU孵育。實(shí)驗(yàn)分組同“2.2”。分別在培養(yǎng)的24、48和72 h后，每孔加入100 μL的BrdU鼠單克隆抗體（1∶100）室溫孵育1 h后，wash buffer沖洗2次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠IgG（1∶2 000稀釋）孵育1 h后，wash buffer再次沖洗2次，加入100 μL TMB過氧化物酶底物室溫避光孵育30 min，加入100μL終止液，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀450 nm波長(zhǎng)處讀取各孔吸光度值（A450），取其平均值。

2．5PKD1對(duì)EPCs血管形成能力的影響 將EPCs用含2%FBS的EBM-2的基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸，每孔5×104個(gè)加入Matrigel-Matrix預(yù)處理的48孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞貼壁后，更換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分組同“2.2”。在培養(yǎng)的72 h后，40×倒置顯微鏡下觀察管狀結(jié)構(gòu)數(shù)量，隨機(jī)選擇6個(gè)視野照相，取其平均值。

2．6PKD1對(duì)EPCs中eNOS mRNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)的影響 將EPCs用含2%FBS的EBM-2的基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸，每孔105個(gè)加入6孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞貼壁后，更換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分組同“2．2”。在培養(yǎng)24 h后，TRIzol法提取EPCs總RNA，根據(jù)GenBank序列，分別設(shè)計(jì)eNOS的上下游引物為5′-CTGCTGCCCCAGATATCTTC-3′和5′-CAGGTACTG-CAGTCCCTCCT-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度為230bp。每組細(xì)胞取2μg總RNA，根據(jù)試劑盒的說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cD-NA，再取2 μg逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行普通PCR，94℃，1 min，95℃，30 s，54℃，1 min，72℃，1 min，30個(gè)循環(huán)，延伸2 min。取反應(yīng)產(chǎn)物10 μg進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后AlphaView SA軟件攝圖，并分析eNOS與β-actin基因的灰度比值。

2．7PKD1對(duì)EPCs中eNOS蛋白表達(dá)的影響細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)同“2.6”。應(yīng)用Next Advance Bullet Blender Storm組織細(xì)胞破碎儀將EPCs打碎，勻漿，4℃下12 000×g離心2min，提取組織總蛋白后Bradford法測(cè)定蛋白濃度，取其中20 μg蛋白進(jìn)行12%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，5%的脫脂奶粉封閉2 h后洗膜，標(biāo)記1∶250稀釋的eNOS一抗，4℃過夜，洗膜，與辣根過

氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠IgG（1∶2 000稀釋）孵育1 h后TBST洗膜，沖洗后暗室曝光顯影。同時(shí)以β-actin蛋白表達(dá)水平作為內(nèi)參對(duì)照。膠片經(jīng)成像分析系統(tǒng)掃描，并應(yīng)用AlphaView SA軟件分析各樣本與β-actin蛋白灰度的比值，記錄蛋白相對(duì)含量。

2．8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16．0統(tǒng)計(jì)軟件系統(tǒng)，計(jì)量資料以±s表示，多組間均數(shù)比較比較用單因素方差分析，組間多重比較用SNK-q檢驗(yàn)。

3　結(jié)果

3．1EPCs的鑒定 EPCs結(jié)合FITC后呈現(xiàn)綠色，DAPI復(fù)染后胞核呈藍(lán)色。EPCs呈卵圓形、紡錘形或者不規(guī)則狀，CD133、CD34或VEGFR-2表達(dá)陽性，見Fig 1。

Fig 1 Immunofluorescence detection of CD34（A／D），VEGFR-2 （B／E）and CD133（C／F）for EPCs（×200）

3．2PKD1對(duì)EPCs黏附、遷移能力的影響 和對(duì)照組相比，PKD1各干預(yù)組促EPCs黏附、遷移的能力明顯增強(qiáng)（P＜0.05），且呈劑量依賴性（F黏附＝21.323，F(xiàn)遷移＝18.586，均P＜0.05）。加入CID755673干預(yù)之后，EPCs的黏附、遷移的能力明顯下降（P＜0.05）。見Fig 2。

3．3PKD1對(duì)EPCs增殖能力的影響 和對(duì)照組相比，24、48、72 h PKD1各劑量組促EPCs的增殖能力均明顯升高（P＜0.05），且隨劑量增加促增殖能力呈上升趨勢(shì)；加入CID755673干預(yù)之后，EPCs的增殖能力明顯下降（P＜0.05）。24、48、72 h時(shí)間組組間相比，隨時(shí)間推移，PKD1各劑量組促EPCs增殖能力均明顯升高（F時(shí)間＝7.137，P＜0.05）；且時(shí)間和劑量均明顯影響EPCs增殖（F交互＝10.098，P＜0.05）。見Fig 3。

Fig 2 Effect of PKD1 on migration and adherence in EPCs

Fig 3 Effect of PKD1 on proliferation in EPCs

3．4PKD1對(duì)EPCs血管形成能力的影響 與對(duì)照組相比，PKD1各干預(yù)組EPCs管腔樣結(jié)構(gòu)的數(shù)目明顯增加（P＜0.05），且呈劑量依賴性增加趨勢(shì)。加入CID755673干預(yù)之后，EPCs管腔樣結(jié)構(gòu)的數(shù)目明顯減少（P＜0.05），且管狀結(jié)構(gòu)結(jié)點(diǎn)模糊。見Fig 4。

Fig 4 Effect of PKD1 on numbers of tube-like structures in EPCs

3．5PKD1對(duì)EPCs中eNOS mRNA及蛋白表達(dá)的影響 和對(duì)照組相比，PKD1各干預(yù)組EPCs中eNOS mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯升高（P＜0.05），和25 μg·L－1PKD1干預(yù)組相比，50及100 μg·L－1PKD1干預(yù)組EPCs中eNOS mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯升高（P＜0.05），但后兩組組間比較無差異；加入CID755673干預(yù)之后，EPCs中eNOS mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯降低（P＜0.05）。見Fig 5－6。

4　討論

Fig 5 Effect of PKD1 on mRNA expression of eNOS in EPCs

Fig 6 Effect of PKD1 on protein expression of eNOS in EPCs

本研究結(jié)果從PKD1激活和阻斷兩方面均證實(shí)PKD1明顯促進(jìn)EPCs的黏附和遷移，且呈劑量依賴性。這可能與PKD1對(duì)細(xì)胞間黏附分子l（intercellu-lar adhesion molecule 1，ICAM-1）和血管細(xì)胞黏附分子l（vascular cell adhesion molecule l，VCAM-1）的活化作用密切相關(guān)。ICAM-1和VCAM-1介導(dǎo)EPCs之間的黏附、趨化因子誘導(dǎo)的EPCs跨內(nèi)皮的遷移，而黏附和遷移是歸巢過程中的重要環(huán)節(jié)［3］。本研究結(jié)果同時(shí)證實(shí)，在24、48、72 h不同時(shí)間段，PKD1各劑量干預(yù)組均明顯增加EPCs的增殖，且呈時(shí)間依賴性，時(shí)間和劑量方差交互分析證實(shí)兩者均明顯影響EPCs的增殖。這表明，PKD1可以明顯促進(jìn)EPCs的增殖。進(jìn)一步的研究結(jié)果表明，PKD1呈劑量依賴性提升EPCs的管腔樣結(jié)構(gòu)數(shù)量。之前的研究證實(shí)EPCs向缺血組織歸巢，分化為成熟的內(nèi)皮細(xì)胞，并通過旁分泌的方式調(diào)控現(xiàn)存的內(nèi)皮細(xì)胞，以一種和胚胎時(shí)期血管形成相似的方式分化成為血管內(nèi)皮細(xì)胞，進(jìn)而形成血管［4］。同時(shí)，PKD1還可以誘導(dǎo)生成多種生長(zhǎng)因子，聯(lián)合發(fā)揮作用，參與血管新生和組織再生的整個(gè)修復(fù)進(jìn)程［5］。這和我們的研究結(jié)果高度吻合。這表明，PKD1可以通過調(diào)控EPCs的黏附、遷移、增殖以及血管形成能力，促進(jìn)受損組織區(qū)域內(nèi)微血管的新生，而在缺血性心肌組織損傷

修復(fù)的進(jìn)程中發(fā)揮著重要的作用。

本研究還分別從PKD1激活和阻斷兩個(gè)截然相反的角度證實(shí)PKD1可以明顯上調(diào)EPCs中eNOS 的mRNA和蛋白表達(dá)水平。eNOS和其產(chǎn)物NO在血管系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)維持中扮演著重要的角色，不僅調(diào)控著血壓水平、血管的緊張度，而且發(fā)揮著重要的抗炎、抗氧化、抗血栓形成效應(yīng)［6］。eNOS的激活是通過1179的絲氨酸激活位點(diǎn)，Akt、CaMKII、AMPK、PKD1均可以通過這一位點(diǎn)而激活eNOS［7－8］。之前的文獻(xiàn)報(bào)道，在VEGF介導(dǎo)的eNOS激活的進(jìn)程中，PKD1是必不可少的［9］。也有學(xué)者認(rèn)為，eNOS屬于新發(fā)現(xiàn)的PKD的底物，因?yàn)閑NOS被各種氨基酸識(shí)別結(jié)合激活的位點(diǎn)恰恰均存在于現(xiàn)有報(bào)道的PKD底物之內(nèi)，采用PKD1阻斷劑或者基因沉默PKD1均可以以一種依賴eNOS的方式阻斷動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的遷移，減緩受損傷口的愈合［10］。和上述結(jié)果相似，我們的研究也表明，PKD1可能以一種依賴eNOS的方式促進(jìn)EPCs的黏附、遷移、增殖和血管形成。

當(dāng)前在缺血性心臟病的臨床治療進(jìn)程中，由于心肌細(xì)胞分化和增殖能力極差，心肌組織缺血受損后通常以纖維組織進(jìn)行疤痕修補(bǔ)，這對(duì)修復(fù)后的心臟功能產(chǎn)生較大的損害作用［11］。本研究結(jié)果對(duì)于后續(xù)的骨髓源性EPCs移植至心肌梗死大鼠動(dòng)物模型或者心肌梗死患者受損的心肌組織中，促缺血區(qū)域局部血管的新生，以及干預(yù)PKD1誘導(dǎo)EPCs分化為內(nèi)皮細(xì)胞，促內(nèi)皮細(xì)胞遷移，減輕或者逆轉(zhuǎn)損傷心肌組織纖維化修復(fù)進(jìn)程，促損傷心肌組織心功能狀態(tài)的恢復(fù)有積極的參考意義。

（致謝：本文的實(shí)驗(yàn)在南陽理工學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心完成，實(shí)驗(yàn)由楊雷博士和毛秉豫教授共同設(shè)計(jì)，并進(jìn)行經(jīng)費(fèi)資助。劉暖為實(shí)驗(yàn)的主要完成人，徐國(guó)昌主要負(fù)責(zé)統(tǒng)計(jì)學(xué)工作，葉松山、張培華、張?芳協(xié)助進(jìn)行分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。對(duì)以上同志的工作特別表示感謝?。?/p>

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Angiogenesis of protein kinase D1 in bone marrow-derived endothelial progenitor cells of rats

LIU Nuan，YANG Lei，MAO Bing-yu，XU Guo-chang，YE Song-shan，ZHANG Pei-hua，ZHANG Li-fang
（Medical Experimental Center，Nanyang Institute of Technology，Nanyang Henan 473004，China）

Abstract：Aim To explore the effect of protein kinase D1（PKD1）on adherence，migration，proliferation，microvascular formation，and eNOS expression in bone marrow-derived endothelial progenitor cells（EPCs）of rats．Method The EPCs were isolated from bone marrow of rats，cultured and detected，the effects of PKD1 and its specific blocking agent CID755673 on adhesion，migration，proliferation，or microvascular formation were observed，as well as mRNA and protein expression of endothelial nitric oxide synthase（eNOS）

in EPCs．Results PKD1 significantly promoted adhe-sion，migration，proliferation and microvascular forma-tion of EPCs，and upregulated the mRNA and protein expression of eNOS in EPCs，according to the cell cul-ture experiments of EPCs in vitro．Conclusion PKD1 has the role of angiogenesis through regulation of EPCs，which might be dependent on eNOS．

Key words：protein kinase D1；endothelial progenitor cells；angiogenesis；endothelial nitric oxide synthase；migration；proliferation

作者簡(jiǎn)介：劉 暖（1987－），女，碩士，助教，研究方向：心血管疾病發(fā)病機(jī)制，E-mail：liunuan2006＠126．com；楊 雷（1977－），男，博士，副教授，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合抗心血管疾病發(fā)病機(jī)制，Tel：0377-62071309，E-mail：yanglei200609＠126．com；毛秉豫（1958－），男，博士，教授，研究方向：心血管疾病的氣血并治方藥，Tel：0377-62071305，E-mail：maobing yu2005＠126．com

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No 81473438，81202791，81173372）；河南省中醫(yī)內(nèi)科學(xué)重點(diǎn)學(xué)科支撐課題（豫教高［2012］186號(hào)）

收稿日期：2015－05－13，修回日期：2015－06－23

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001－1978（2015）09－1259－06

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．09．016