多肽AP25與多西他賽聯(lián)合用藥對人乳腺癌裸鼠移植瘤的抑制活性研究

王佳藝，何俊勁，郝靜超，程昊冉，徐寒梅

（中國藥科大學(xué)，多肽藥物創(chuàng)制工程研究中心，江蘇南京 210009）

多肽AP25與多西他賽聯(lián)合用藥對人乳腺癌裸鼠移植瘤的抑制活性研究

王佳藝，何俊勁，郝靜超，程昊冉，徐寒梅

（中國藥科大學(xué)，多肽藥物創(chuàng)制工程研究中心，江蘇南京 210009）

中國圖書分類號：R-332；R737．905；R979．1；R977.6

摘要：目的 檢測多肽AP25與多西他賽聯(lián)合使用治療實驗性乳腺癌的活性是否優(yōu)于單用兩種藥物的活性，為臨床合理用藥提供依據(jù)。方法 建立人乳腺癌MDA-MB-231裸鼠移植瘤模型，以多西他賽（10 mg·kg－1）和多西他賽（5 mg· kg－1）為陽性對照，觀察AP25單用及與多西他賽聯(lián)合應(yīng)用對腫瘤生長的抑制作用，用金氏公式計算Q值，評價聯(lián)合用藥的作用效果。結(jié)果 動物實驗表明，AP25與多西他賽聯(lián)合使用抑瘤率明顯提高，AP25（20 mg·kg－1）與多西他賽（10 mg·kg－1）聯(lián)合使用具有較明顯的抑制MDA-MB-231腫瘤生長的作用，0.85＜Q＝0.99＜1.15，聯(lián)合作用為相加；AP25（20 mg·kg－1）與多西他賽（5 mg·kg－1）聯(lián)合使用具有明顯抑制MDA-MB-231腫瘤生長的作用，Q＝1.18＞1.15，聯(lián)合作用為協(xié)同。結(jié)論 多肽AP25與多西他賽聯(lián)合用藥明顯抑制腫瘤生長，兩種藥物聯(lián)合使用可以降低多西他賽的給藥劑量，從而降低毒副作用。

關(guān)鍵詞：AP25多西他賽；抗腫瘤多肽；乳腺癌；金氏公式；協(xié)同作用；聯(lián)合給藥

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2015－8－10 14：37 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20150810．1437．011．html

AP25是我們課題組自主設(shè)計合成的由25個氨基酸組成的抗腫瘤多肽，其中含有兩對二硫鍵，其序列獲得國家發(fā)明專利授權(quán)（專利號：ZL2005100 40378.5），具有開發(fā)為一類抗腫瘤新藥的前景。體外對15種腫瘤細胞株的MTT試驗顯示，它可以有效抑制MGC-803、HeLa、HCT116、U87和MDA-MB-231等腫瘤細胞的增殖，還可以有效抑制內(nèi)皮細胞的遷移，其IC50為7.3 μmol·L－1；體內(nèi)對2種人的腫瘤細胞藥效學(xué)實驗發(fā)現(xiàn)，它可以有效抑制人的乳腺癌、結(jié)腸癌生長，抑制效果相當(dāng)于化學(xué)藥物多西他賽；我們還對AP25的大鼠及食蟹猴的藥代動力學(xué)進行了研究，獲得了其體內(nèi)代謝特征數(shù)據(jù)，包括血漿半衰期、組織分布及排泄的數(shù)據(jù)；急性毒性試驗發(fā)現(xiàn)，SD大鼠經(jīng)靜脈單次給予多肽AP25的最低致死劑量（MLD）為200 mg·kg－1；機制研究顯示，AP25與血管內(nèi)皮細胞表面的整合素αvβ3及其協(xié)同受體硫酸肝素糖蛋白（glypican-1）相互作用，并被募集至細胞表面的脂筏區(qū)域，通過一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用下調(diào)Src激酶的活性，引起RhoGTP轉(zhuǎn)化為RhoGDP，降低RhoA和Rac1蛋白的活性，從而引起actin張力纖維和黏著斑復(fù)合物的解聚，最終抑制腫瘤血管內(nèi)皮細胞的遷移，達到抑制腫瘤血管生成的作用［1－2］。

多西他賽為紫杉醇類抗腫瘤藥物，通過干擾細胞有絲分裂和分裂間期細胞功能所必須的微管網(wǎng)絡(luò)而起到抗腫瘤作用。多西他賽可與游離的微管蛋白結(jié)合，促進微管蛋白裝配成穩(wěn)定的微管，同時抑制其解聚，從而抑制細胞的有絲分裂，最終導(dǎo)致腫瘤細胞的死亡，具有較高的抗腫瘤活性。多西他賽對乳腺

癌、非小細胞肺癌、前列腺癌、宮頸癌、卵巢癌、胃癌等都有良好的臨床療效。但多西他賽也能引起嚴重的毒副反應(yīng)，如骨髓抑制、過敏反應(yīng)、體液潴留、脫發(fā)、乏力、黏膜炎、關(guān)節(jié)痛或肌肉痛、低血壓、胃腸道反應(yīng)與惡心、嘔吐或腹瀉等。

化療是目前臨床上治療腫瘤原發(fā)病灶或轉(zhuǎn)移灶的主要手段，但是化療單一用藥容易產(chǎn)生耐藥性，不良反應(yīng)大，而且療效不夠理想［3］，因此，腫瘤的治療已從最初的單一用藥向聯(lián)合用藥方向轉(zhuǎn)變，從機制的互補、作用的協(xié)同、不良反應(yīng)的減輕等方面發(fā)揮作用［4］。其中，靶向藥物與化療藥物聯(lián)用可降低化療藥物的劑量，從而降低其毒副作用，因此在腫瘤的治療上有廣泛的應(yīng)用前景。然而當(dāng)兩種不同作用機制的藥物聯(lián)合應(yīng)用時，其給藥劑量及給藥順序的不同對藥效的發(fā)揮均有極大的影響，有些血管生成抑制劑與化療或放療聯(lián)合應(yīng)用時具有協(xié)同作用［5－6］，但也有些聯(lián)合應(yīng)用時卻具有拮抗作用［7］。因此，如何合理地聯(lián)合血管生成抑制劑和化療藥物，確立最佳聯(lián)合給藥方案和用藥時機，從而最大限度地發(fā)揮藥物的治療作用是目前探索改善腫瘤治療手段切實可行的研究方向［8］。本文對多肽AP25與多西他賽聯(lián)合給藥治療乳腺癌進行研究，結(jié)合金氏公式，評價多肽AP25與化藥聯(lián)用的效果及其抑制作用與給藥劑量的相關(guān)性，為開發(fā)AP25為抗腫瘤藥物提供依據(jù)。

1　材料與儀器

1．1實驗動物和細胞株 BALB／c裸鼠，SPF級，上海西普爾－必凱實驗動物有限公司。實驗動物質(zhì)量合格證許可證號：SCXK（滬）2013－0016，合格證號：0132238。日齡：35～40 d，體質(zhì)量：18～22 g，♀，每組動物數(shù)：陰性對照組12只，其他每組6只。小鼠乳腺癌MDA-MB-231細胞株購自中科院上海細胞所。

1．2主要藥物與試劑 McCoy’s 5A培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；胰蛋白酶（美國Gibco公司）；胎牛血清（FBS）；青霉素、鏈霉素（美國Sciencell公司）；AP25（本課題組，批號121128）；多西他賽（江蘇恒瑞制藥有限公司，批號H20020543）；生理鹽水（山東魯抗辰欣藥業(yè)有限公司，批號1207117102）。

1．3主要儀器 CO2培養(yǎng)箱，恒溫培養(yǎng)箱，倒置顯微鏡，Canon照相機。

2　方法

2．1MDA-MB-231乳腺癌細胞的培養(yǎng) 從液氮罐中取出一支MDA-MB-231乳腺癌細胞凍存管，于37℃水浴中快速融化，無菌條件下滴入15 mL的離心管離心，在培養(yǎng)瓶中加入10 mL含10%的FBS 的McCoy’s 5A培養(yǎng)基，將離心后的細胞用1 mL培養(yǎng)基重懸滴入細胞培養(yǎng)瓶中，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2．2MDA-MB-231乳腺癌細胞裸鼠皮下移植瘤模型的建立 將乳腺癌MDA-MB-231細胞株進行傳代培養(yǎng)，當(dāng)獲得大量培養(yǎng)細胞后，收集并接種于裸鼠右側(cè)腋下，接種量為每鼠1×106個細胞／0.1 mL，待腫瘤體積達75～100 mm3時進行分組、給藥。給藥期間，觀察并記錄裸鼠狀態(tài)，測量裸鼠體重，并用游標卡尺測量瘤體大小，體重和瘤體積每2 d測量1次。將動物隨機分為8組，陰性組12只，其他組每組6只。給藥21 d，以尾靜脈注射方式給藥，陰性組給生理鹽水，多西他賽組分別注10、5 mg·kg－1劑量的多西他賽，AP25組分別注射20、10 mg·kg－1劑量的AP25，聯(lián)合給藥組先注射多西他賽，然后再注射AP25。給藥體積為每只0.2 mL，給藥方案見Tab 1。d 22時頸椎脫臼處死裸鼠，剝離瘤塊，稱重并計算抑瘤率。

劑量設(shè)置：多西他賽劑量10 mg·kg－1由臨床上藥物有效劑量通過人與小鼠劑量換算公式計算得來；多西他賽劑量5 mg·kg－1由10 mg·kg－1減半得來；通過本課題組前期體內(nèi)外實驗摸索，確定多西他賽（10 mg·kg－1）及多西他賽（5 mg·kg－1）為陽性對照。AP25劑量20、10 mg·kg－1由本課題組前期體內(nèi)外實驗摸索得來，作為本次實驗的給藥組。

Tab 1 Dosage regimen

2．3腫瘤測量及抗腫瘤活性評價方法

2．3．1腫瘤體積及抑制率 腫瘤體積（tumor vol-ume，TV）的計算公式為：TV＝1／2×a×b2，其中a、b分別表示長寬。根據(jù)測量的結(jié)果計算出相對腫瘤體積（relative tumor volume，RTV），計算公式為：RTV ＝Vt／V0。其中V0為分籠給藥時（即d0）測量所得腫瘤體積，Vt為每次測量時的腫瘤體積。

腫瘤體積抑制率／%＝（陰性對照組平均體積－給藥組平均體積）／陰性對照組平均體積×

100%。每2 d測一次瘤體積，根據(jù)體積抑制率可動態(tài)觀察各給藥組的抑瘤效果。

2．3．2腫瘤瘤重及抑瘤率 抑瘤率／%＝（陰性對照組平均瘤重－給藥組平均瘤重）／陰性對照組平均瘤重×100%。給藥21 d后，完成治療。對裸鼠剖瘤，并對剖出的腫瘤進行稱重。然后計算出瘤重抑瘤率。

2．3．3裸鼠體重和存活情況 每2 d測1次裸鼠體重，觀察裸鼠體重變化情況和生長狀態(tài)，旨在檢測藥物的毒副作用。

2．4聯(lián)合作用評價 采用金氏公式評價兩種藥物的聯(lián)合作用。金氏公式表達式：

EA、EB分別表示A和B兩種藥物單獨用藥的效應(yīng)；E（A＋B）表示藥物A和藥物B聯(lián)合用藥的效應(yīng)。通過判讀Q值來評價二藥物在聯(lián)合使用后的治療效果是否優(yōu)于單獨給藥。如果Q在0.85－1.15之間為單純相加，Q＞1.15為協(xié)同作用，Q＜0.85為拮抗作用。

2．5免疫組化檢測 治療完成后，脫椎處死裸鼠，剖瘤。每組取2－3個樣本進行免疫組化。瘤組織置于4%甲醛中固定，經(jīng)脫水、透明、滲蠟、石蠟包埋，用CD31抗體進行染色，觀察腫瘤組織中微血管密度（MVD）。微血管密度的計數(shù)：腫瘤組織中的微血管定位在血管內(nèi)皮細胞的細胞膜和細胞質(zhì)，呈棕黃色，陽性定位在血管內(nèi)皮細胞的細胞膜和細胞質(zhì)。根據(jù)Weidner法［9］進行MVD計數(shù)，首先在低倍鏡（×100）下觀察整張切片，找到腫瘤組織中微血管較密集的區(qū)域，再在高倍鏡（×200）下選擇5個視野計數(shù)血管數(shù)，取其平均值作為此樣本的MVD值。任何1個被染為棕黃色的內(nèi)皮細胞或內(nèi)皮細胞簇，只要與相鄰的微血管、腫瘤細胞或其他結(jié)締組織界限分明，都被認為是1個微血管，進行計數(shù)［10］，管腔大于8個細胞或帶有較厚肌層的血管不計數(shù)。

2．6統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 19．0軟件中配對樣品t檢驗分析（Paired-samples t test），結(jié)果以±s表示。

3　結(jié)果

3．1腫瘤體積及抑制率 腫瘤體積變化及體積抑制率見Fig 1-A、1-B，22 d剖瘤時所測的體積中，陰性組腫瘤體積為（1 722.42±46.89）mm3；單獨給藥治療組G2（多西他賽10 mg·kg－1）、G3（多西他賽5 mg·kg－1）、G4（AP25 20 mg·kg－1）、G5（AP25 10 mg·kg－1）的腫瘤體積分別為（537.04±19.69）mm3、（1 224.05±27.94）mm3、（643.77±23.74） mm3、（1 323.75±39.77）mm3；聯(lián)合給藥組G6（多西他賽10 mg·kg－1＋AP25 20 mg·kg－1）、G7（多西他賽5 mg·kg－1＋AP25 10 mg·kg－1）、G8（多西他賽5 mg·kg－1＋AP25 20 mg·kg－1）的腫瘤體積分別為（203.73±6.67）mm3、（961.18±20.34）mm3、（227.71±5.21）mm3。與陰性組相比，G2、G4、G6、G8治療組腫瘤體積差異有顯著性（P＜0.01）；根據(jù)Fig 1-B中的腫瘤體積動態(tài)抑制率變化看，G2、G4、G6、G8治療組在7～21 d期間的抑瘤率比較明顯，在給藥后期尤其明顯。

3．2腫瘤瘤重及抑瘤率 陰性組瘤重為（1.50± 0.11）g，聯(lián)合給藥組瘤重均明顯小于陰性組（P＜0.01），分別為G6組（0.17±0.05）g、G7組（0.76± 0.12）g、G8組（0.19±0.06）g。與陰性組相比，聯(lián)合給藥組腫瘤較小，且中心有較大面積壞死部分，表明瘤體新生血管生成受到抑制，供血不足，見Fig 2。

Fig 1 Tumor volume and inhibition rate

Tab 2 Tumor weight（g），inhibition rate（%）and MVD（CD31）

Fig 2 Photos of tumors at the end of the study indicate the therapeutic effects of docetaxel and AP25 on mice

據(jù)瘤重計算出的抑瘤率見Tab 2，其中單獨給藥組多西他賽（10 mg·kg－1）和多西他賽（5 mg· kg－1）的抑瘤率分別是71.36%和32.83%，AP25 （20 mg·kg－1）和AP25（10 mg·kg－1）的抑瘤率分別是62.05%和25.26%；聯(lián)合給藥組G6、G7、G8抑瘤率分別是88.58%、49.43%和87.69%。

3．3裸鼠體重變化及存活情況 體重情況見Fig 3，含多西他賽的治療組G2、G3、G6、G7、G8小鼠體重明顯下降且偏低，表明多西他賽在有效劑量下有很大的毒副作用；陰性組小鼠體重明顯增加；AP25組小鼠體重略微減輕，表明多肽AP25無明顯毒副作用。從動物存活情況看，所有組動物全部存活。

3．4聯(lián)合作用分析 金氏公式計算得到：多西他賽（10 mg·kg－1）與AP25（20 mg·kg－1）聯(lián)合使用，0.85＜Q＝0.99＜1.15，聯(lián)合作用為相加；多西他賽（5 mg·kg－1）與AP25（20 mg·kg－1）聯(lián)合使用，

Q＝1.18＞1.15，聯(lián)合作用為協(xié)同。

Fig 3 Mice weight

3．5免疫組化分析 如（Tab 2，F(xiàn)ig 4）所示：陰性組MVD為25.53±6.63，AP25（20 mg·kg－1）、AP25（10 mg·kg－1）MVD分別為17.56±3.68、19.79±3.33，與陰性組對比，差異具有顯著性，表明AP25在有效劑量下對腫瘤新生血管有明顯抑制作用。在聯(lián)合用藥組中，多西他賽（mg·kg－1）聯(lián)合AP25（20 mg·kg－1）組MVD為10.04±1.37，多西他賽（5 mg·kg－1）聯(lián)合AP25（20 mg·kg－1）組MVD為11.78±3.50，抑制腫瘤血管效果好于多西他賽單獨給藥組和AP25單獨給藥組，進一步提示傳統(tǒng)化藥與血管生成抑制劑聯(lián)用具有多靶點、多途徑聯(lián)合抗腫瘤的效果。

4　討論

1 972年，F(xiàn)olkman提出了著名的腫瘤新生血管

學(xué)說，認為新生血管為腫瘤提供營養(yǎng)和氧氣，并為腫瘤的轉(zhuǎn)移提供通道，是腫瘤生長、浸潤和轉(zhuǎn)移的重要基礎(chǔ)［11］。在癌癥臨床治療上，血管生成抑制劑類藥物與化療藥物聯(lián)合應(yīng)用非常普遍，很多文獻報道，兩者聯(lián)合應(yīng)用具有協(xié)同作用［12－16］。

Fig 4 Microvasculature of each histological grade using CD31 immunostaining（×200）

實驗結(jié)果表明，多肽AP25（20 mg·kg－1）與多西他賽（5 mg·kg－1）聯(lián)合使用具有協(xié)同作用，二者聯(lián)用可以明顯提高抑制腫瘤生長的效果，而且可以降低多西他賽的用藥劑量。這個結(jié)果可以為乳腺癌的臨床合理用藥提供一些建議，降低化療藥物用量，從而減少毒副反應(yīng)，降低耐藥性，減輕腫瘤患者的痛苦。

綜合分析實驗結(jié)果，多肽AP25與多西他賽聯(lián)合使用達到協(xié)同作用的原因可能首先是兩種藥物的抗腫瘤作用機制不同，多西他賽（docetaxel）是以微管為靶點的抗腫瘤藥物，屬于細胞周期特異性藥物，作用于M期，能促進微管異常聚合并保持其穩(wěn)定，從而抑制細胞有絲分裂時紡錘體形成以及微管的其他功能，抑瘤效果明顯；多肽AP25為整合素阻斷劑類抗腫瘤多肽，作用靶點為血管內(nèi)皮細胞表面的整合素αvβ3，整合素作為細胞與細胞、細胞與ECM黏附的重要受體，通過結(jié)合配體中的RGD序列介導(dǎo)細胞與ECM之間的相互作用，抑制內(nèi)皮細胞遷移及腫瘤細胞的浸潤、轉(zhuǎn)移，進而影響腫瘤新生性血管系統(tǒng)。多肽AP25與多西他賽是兩種具有完全不同作用機制的藥物，兩者聯(lián)合使用，可以增強抑制腫瘤生長的效果，達到協(xié)同作用。其次，二種藥物聯(lián)用還能減少化藥用量，降低化藥毒性。多西他賽雖然具有明顯的抗腫瘤效果，但作為細胞毒類的化療藥物，它也能引起嚴重的毒副反應(yīng)，如骨髓抑制、過敏反應(yīng)、體液潴留、脫發(fā)、乏力、黏膜炎、關(guān)節(jié)痛和肌肉痛、低血壓、胃腸道反應(yīng)與惡心、嘔吐或腹瀉等。而多肽AP25作為以整合素為靶點的抗腫瘤多肽，與多西他賽相比，細胞毒性明顯降低（從實驗中裸鼠的體重增長趨勢即可看出）。因此兩者聯(lián)合使用，降低了多西他賽的用量，大幅度降低了化療的毒副作用，提高了機體抵御腫瘤細胞的能力，最終提高了抗腫瘤療效，達到協(xié)同作用。

其他還有很多因素可以影響化療聯(lián)合用藥的抗腫瘤療效，比如多肽AP25與多西他賽之間是否存在相互作用，從而提高各自的抗腫瘤療效，或者二者合用是否與機體產(chǎn)生反應(yīng)，從而提高聯(lián)合用藥的抗腫瘤藥效，我們還需要做進一步的藥代動力學(xué)研究和機制研究，從而為開發(fā)AP25為抗腫瘤藥物奠定基礎(chǔ)。

（致謝：本實驗在中國藥科大學(xué)多肽藥物創(chuàng)制工程研究中心完成。感謝導(dǎo)師徐寒梅教授為本實驗提供充足的資金支持和整體的思路指導(dǎo)；感謝胡加亮老師的精心指導(dǎo)；感謝何俊勁、郝靜超、程昊冉、吳曉東同學(xué)的盡心協(xié)助。）

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Combination of polypeptide AP25 and docetaxel in the treatment of breast cancer

WANG Jia-yi，HE Jun-jin，HAO Jing-chao，CHENG Hao-ran，XU Han-mei
（The Engineering Research Center of Peptide Drug Discovery and Development，China Pharmaceutical University，Nanjing 210009，China）

Abstract：Aim To evaluate whether the combination of polypeptide AP25 and docetaxel is more efficient in treating experimental breast cancer，than either reagent used alone，and to offer suggestions for clinical use．Methods An experimental breast carcinoma model was set up to investigate the anti-tumor effects of AP25 and docetaxel combination．The Q value was caluculat-ed by Guinness rules and the anti-tumor effects of the combination of polypeptide AP25 and docetaxel were e-valuated．Results The treatment by the combination of polypeptide AP25 and docetaxel showed a better tumor inhibition rate．The combination of AP25 20 mg ·kg－1and docetaxel 10 mg·kg－1significantly inhibi-ted the tumor growth with 0.85＜Q＝1.01＜1.15，showing an additive effect while the combination of AP25 20 mg·kg－1and docetaxel 5 mg·kg－1signifi-cantly inhibited the tumor growth with Q＝1.18＞1.15，showing a synergistic effect．Conclusions The combination of AP25 and docetaxel can significantly in-hibit the tumor growth with a synergistic effect and de-crease the dose of chemotherapy．

Key words：AP25；docetaxel；anti-tumor peptide；breast cancer；Guinness rules；synergistic effect；com-bination therapy

作者簡介：王佳藝（1987－），女，碩士生，研究方向：腫瘤藥理學(xué)，E-mail：wangjiayi0921＠163．com；徐寒梅（1966－），女，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：抗腫瘤新藥研究開發(fā)，Tel：025-83271007，E-mail：13913925346＠126．com

基金項目：國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃（863計劃）資助項目（No 2012AA020304）；國家科技部“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項（No 2014ZX09508007-001，2012ZX09103301-004）；國家重點實驗室培育計劃（No SKLNMBZ201403）

收稿日期：2015－04－18，修回日期：2015－06－05

文獻標志碼：A

文章編號：1001－1978（2015）09－1233－06

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．09．011