基于拉曼光譜的不同產(chǎn)地黃芪鑒別研究*

★　俞允第一作者：俞允，男，講師。研究方向：醫(yī)學(xué)物理。E-mail:yuyunsatan@6.com?！『窝恪￡悩s　黃浩通信作者：黃浩，男，教授。研究方向：醫(yī)學(xué)物理。E-mail:mrhhao@6.com。　馮尚源　林居強　黃祖芳　李永增　陳偉煒　林多　林佳　(.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院　福州 50；.江西中醫(yī)藥大學(xué)　南昌 0004；.福建師范大學(xué)光電與信息工程學(xué)院　福州 50007)

基于拉曼光譜的不同產(chǎn)地黃芪鑒別研究*

★俞允1*第一作者：俞允，男，講師。研究方向：醫(yī)學(xué)物理。E-mail:yuyunsatan@163.com。何雁2陳榮3黃浩1*通信作者：黃浩，男，教授。研究方向：醫(yī)學(xué)物理。E-mail:mrhhao@126.com。馮尚源3林居強3黃祖芳3李永增3陳偉煒1林多1林佳3(1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院福州 350122；2.江西中醫(yī)藥大學(xué)南昌 330004；3.福建師范大學(xué)光電與信息工程學(xué)院福州 350007)

摘要：目的:利用拉曼光譜技術(shù)建立黃芪飲片產(chǎn)地鑒別方法。方法:檢測來自內(nèi)蒙古、山西、黑龍江、甘肅四個地區(qū)共100批次黃芪飲片的拉曼光譜，通過主成分分析(PCA)對不同產(chǎn)地樣本進(jìn)行判別區(qū)分，利用偏最小二乘判別法(PLS)建立產(chǎn)地判別模型并予以驗證。結(jié)果:四個產(chǎn)地黃芪飲片拉曼譜線差異主要體現(xiàn)在譜峰強度方面，表明不同產(chǎn)地的黃芪飲片所含生化物質(zhì)在組成比例上有較大差異。PCA分析可對不同產(chǎn)地的黃芪飲片進(jìn)行區(qū)分，主成分得分PC1、PC2、PC3構(gòu)成的三維散點圖中，代表不同產(chǎn)地的數(shù)據(jù)散點各自聚集，沒有重疊。PLS產(chǎn)地判別模型可正確鑒別內(nèi)蒙古、山西、黑龍江、甘肅等四產(chǎn)地黃芪飲片。結(jié)論:本研究表明拉曼光譜技術(shù)結(jié)合PCA及PLS方法，可實現(xiàn)黃芪飲片產(chǎn)地的快速鑒別。同時該方法還可拓展應(yīng)用于其他飲片產(chǎn)地鑒別，具有良好應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：黃芪；拉曼光譜；主成分分析；偏最小二乘法

黃芪是我國重要的傳統(tǒng)飲片，具有多種保健養(yǎng)生治療的功效，如固表止汗、利尿、補氣升陽、生肌等[1-2]。以黃芪為藥材的藥方眾多，黃芪飲片需求量大。然而，不同產(chǎn)地黃芪飲片由于品種、生態(tài)地理環(huán)境、氣候以及栽培加工技術(shù)等差異，使得不同地域黃芪飲片具有不同的生物活性，在色澤、紋理、形狀、療效上均有區(qū)別。

目前主要采用傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)特征對黃芪產(chǎn)地進(jìn)行鑒定，這對鑒定者技術(shù)經(jīng)驗要求高，并且鑒定結(jié)果存在一定主觀性?，F(xiàn)代理化分析如分光光度法、色譜法、顯微鑒別法、紅外光譜法等[3-4]都需對樣品進(jìn)行預(yù)處理，且步驟煩瑣、成本高、費時費力。因此，建立一種操作簡便、結(jié)果客觀、費用低廉的黃芪飲片產(chǎn)地鑒定方法對于黃芪飲片質(zhì)量監(jiān)控具有重大意義。

拉曼光譜技術(shù)是一種快速、簡便的物質(zhì)檢測方法，能夠在分子水平對待測物質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確檢測。近年來拉曼光譜技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于中藥檢測，包括中藥飲片真?zhèn)舞b定、質(zhì)量控制和成分分析等方面[5-7]。本課題組利用拉曼光譜技術(shù)研究黨參飲片、白術(shù)飲片、黃芪飲片、澤瀉湯劑以及白芍藥湯劑的生化成分，已獲得初步成果[8-12]。

本研究嘗試將拉曼光譜檢測技術(shù)結(jié)合主成分分析(Principal Component Analysis，PCA)及偏最小二乘法(Partial Least Squares，PLS)等數(shù)據(jù)分析方法，應(yīng)用于黃芪飲片不同產(chǎn)地快速鑒別分析。

1材料

黃芪飲片由福建中醫(yī)藥大學(xué)國醫(yī)堂提供，藥學(xué)院鑒定。飲片產(chǎn)地分別為：內(nèi)蒙古(產(chǎn)地分類賦值1)、山西(賦值2)、黑龍江(賦值3)、甘肅(賦值4)，每個產(chǎn)地共獲取25批次樣本，具體信息見表1。將不同產(chǎn)地的黃芪飲片用超純水(Simplicity水純化系統(tǒng)，MILLIPORE公司)洗凈后晾干，在60℃烘箱中烘干至恒重，冷卻后經(jīng)高速飲片粉碎機粉碎，過100目篩后儲存?zhèn)錅y。每批次黃芪飲片制備成一份待測樣本，四產(chǎn)地共計100份樣本。

2方法

2.1拉曼光譜檢測采用Renishaw Invio顯微共聚焦拉曼光譜儀進(jìn)行拉曼光譜檢測。激發(fā)光源為近紅外半導(dǎo)體激光器，波長785 nm，照射到樣品表面的激發(fā)光功率約100 mW。在20倍Leica物鏡下采集拉曼信號，CCD積分取譜時間10 s，取譜范圍500～1800 cm-1，光譜分辨率為2 cm-1。采集時溫度、濕度保持恒定。

將待測樣品粉末置于載玻片上，均勻壓片后任意位置進(jìn)行檢測，共檢測10個位置拉曼信號。為了消除儀器激光強度波動對檢測結(jié)果的的影響，我們將獲得的光譜數(shù)據(jù)分別進(jìn)行熒光背景扣除[13]和歸一化處理(500～1800 cm-1，譜線下面積積分)，最后取每個樣本測得的十條譜線的平均譜作為該樣本的拉曼特征譜。

表1　黃芪樣品產(chǎn)地來源、分類及批數(shù)狀況

2.2統(tǒng)計分析從每個產(chǎn)地的25個樣本中均隨機抽取20個黃芪樣本的拉曼特征譜進(jìn)行建模(定標(biāo)集)，剩余5個樣本用于預(yù)測(驗證集)。最終定標(biāo)集樣本共80樣(每個產(chǎn)地20樣)，驗證集樣本20樣(每個產(chǎn)地5樣)。

采用Unscrambler95軟件(CAMO,ASA Oslo,Norway)對定標(biāo)集中80條黃芪拉曼特征譜數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析(PCA)，并以偏最小二乘法(PLS)建立產(chǎn)地分析模型[14]。該模型以定標(biāo)集中光譜數(shù)據(jù)作為輸入變量x，以四個產(chǎn)地山西、甘肅、內(nèi)蒙古、黑龍江的產(chǎn)地分類賦值1、2、3、4作為輸出變量y，驗證方法采用杠桿率校正法(Leverage correction)。并以驗證集中的20個黃芪樣本拉曼特征譜數(shù)據(jù)作為未知樣本對模型進(jìn)行檢驗。

圖1　內(nèi)蒙古、山西、黑龍江、甘肅四產(chǎn)地黃芪拉曼光譜

3結(jié)果

3.1四產(chǎn)地黃芪飲片拉曼光譜圖1為內(nèi)蒙古、山西、黑龍江、甘肅四個產(chǎn)地黃芪樣本的拉曼光譜，譜線陰影部分為標(biāo)準(zhǔn)差，代表同一產(chǎn)地中不同批次樣本譜線之間的波動性。表2為黃芪飲片拉曼譜峰所對應(yīng)的各種物質(zhì)成分[15-16]。

表2　拉曼譜峰位置及歸屬

3.2四產(chǎn)地黃芪飲片拉曼光譜PCA分析如圖1所示，山西產(chǎn)地的黃芪飲片拉曼光譜與甘肅、內(nèi)蒙古和黑龍江三地黃芪飲片拉曼光譜差異明顯，但后三者光譜差異不明顯，難以直接通過拉曼光譜對產(chǎn)地進(jìn)行判定。因此，使用PCA對四個產(chǎn)地的黃芪飲片拉曼光譜進(jìn)行統(tǒng)計分析。

圖2　四產(chǎn)地黃芪樣本拉曼光譜的主成分分析

圖2為PCA散點分布圖，PC1、PC2、PC3分別作為X、Y、Z軸。如圖2所示，代表不同產(chǎn)地的數(shù)據(jù)點分別聚集到獨立的區(qū)域，彼此之間沒有交集。這一結(jié)果說明利用前三個主成分能夠較好區(qū)分來自四個產(chǎn)地的80個樣本。

3.3黃芪飲片產(chǎn)地判別模型在PCA分析基礎(chǔ)上，利用PLS方法建立黃芪飲片產(chǎn)地的判別模型。圖3是獲得的判別模型，相關(guān)系數(shù)R2達(dá)到0.994，說明該判別模型具有較好的精度，可以很好地實現(xiàn)定標(biāo)集中四個不同產(chǎn)地黃芪飲片的識別。

圖3　PLS判別模型的標(biāo)準(zhǔn)值與預(yù)測值散點圖

為驗證該模型對未知樣本的產(chǎn)地判別適用性，利用未參與建模的驗證集樣本(每個產(chǎn)地5個，共20個樣本)對模型進(jìn)行驗證，結(jié)果如圖4所示：判別模型預(yù)測20個樣本的正確率達(dá)到100%，說明拉曼光譜技術(shù)結(jié)合PLS方法能夠正確預(yù)測內(nèi)蒙古、山西、黑龍江、甘肅四產(chǎn)地的黃芪飲片。

圖4　PLS判別模型對驗證集的預(yù)測結(jié)果

4討論

由圖1和表2可知，四個產(chǎn)地黃芪飲片拉曼光譜均含有520、605、638、853、975、1004、1057、1123、1206、1265、1338、1380、1458、1602、1655 cm-1等拉曼峰；其余拉曼峰如457、578、591、768、899、909、941、1081、1095、1104、1293、1409、1533、1630 cm-1等同時存在于兩地或三地的拉曼譜線中。比較不同產(chǎn)地黃芪同一拉曼譜峰位置對應(yīng)的拉曼強度發(fā)現(xiàn)，不同產(chǎn)地的黃芪飲片所含的同類生化物質(zhì)在組成比例上存在較大差異，即不同產(chǎn)地樣本所含的多糖類、蛋白質(zhì)類等生化物質(zhì)的含量高低不同。此外，不同產(chǎn)地黃芪飲片拉曼光譜譜峰位置也存在微小差異，這表明不同地區(qū)黃芪飲片所含化學(xué)物質(zhì)成分或結(jié)構(gòu)方面也存在一定差異。造成以上這些的原因可能是飲片種質(zhì)、生態(tài)自然環(huán)境(如氣候、地質(zhì)土壤中各種元素組成及含量等)、栽培加工以及質(zhì)量控制等多方面因素共同作用的結(jié)果[17-18]。

由于甘肅、內(nèi)蒙古、黑龍江產(chǎn)地的黃芪飲片拉曼光譜差異極小，因此我們使用PCA分析進(jìn)一步提取四個產(chǎn)地黃芪飲片的特征光譜信息。PCA散點圖中(圖2)，代表甘肅、內(nèi)蒙古、山西、黑龍江四地的數(shù)據(jù)散點各自聚在一起，尤其是前二者，也呈現(xiàn)較明顯的空間分布趨勢，即相同產(chǎn)地黃芪飲片樣本分布更加緊密，反映同一產(chǎn)地不同批次黃芪飲片樣本之間的成分相似性較高。

基于PCA分析的良好結(jié)果，我們采用PLS方法進(jìn)一步建立可用于判別黃芪飲片產(chǎn)地的判別模型。從判別結(jié)果來看(圖4)，該判別模型具有良好的黃芪飲片產(chǎn)地區(qū)分能力(區(qū)分正確率100%)，說明拉曼光譜結(jié)合PLS方法在黃芪飲片產(chǎn)地的快速鑒別方面具有極大潛力。后續(xù)工作中我們將進(jìn)一步擴大黃芪飲片的產(chǎn)地來源，同時加大各產(chǎn)地樣本數(shù)量，完善黃芪飲片的產(chǎn)地判別模型。

5結(jié)論

我們將具有高檢測靈敏度的拉曼光譜檢測技術(shù)與PCA、PLS統(tǒng)計分析技術(shù)相結(jié)合，應(yīng)用于黃芪飲片產(chǎn)地鑒別，建立的黃芪產(chǎn)地判別模型具有100%的區(qū)分正確率(80個樣品用于建模，20個樣品用于預(yù)測)。該方法有望進(jìn)一步推廣應(yīng)用于其他飲片產(chǎn)地鑒別及飲片真?zhèn)闻袆e，具有良好的應(yīng)用前景。

參考文獻(xiàn)

[1]國家藥典委員會.中國藥典·一部[S].2010版:283.

[2]張薔,高文遠(yuǎn),滿淑麗.黃芪中有效成分藥理活性的研究進(jìn)展[J].中國中藥雜志,2012,37(21):3 203-3 207.

[3]秦雪梅,李震宇,孫海峰,等.我國黃芪藥材資源現(xiàn)狀與分析[J].中國中藥雜志,2013,38(19):3 234-3 238.

[4]張磊,姜紅,聶磊,等.中藥黃芪鑒別方法的研究進(jìn)展[J].中藥材,2008,31(4):620-624.

[5]俞允,何雁,陳偉煒,等.拉曼光譜在中藥檢測中的研究進(jìn)展[J].江西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2013,25(2):85-88.

[6]蘇松柏,張永萍,張麗麗,等.拉曼光譜在中藥質(zhì)量控制中的應(yīng)用[J].中國實驗方劑學(xué)雜志,2011,17(8):284-286.

[7]朱青霞,曹永兵,曹穎瑛,等.TLC-SERS法快速檢測降壓類中藥中非法添加的四種化學(xué)成分[J].光譜學(xué)與光譜分析,2014,34(4):990-993.

[8]馮尚源,陳榮,李永增,等.黨參煎劑表面增強拉曼光譜[J].中國激光,2010,37(1):121-124.

[9]陳偉煒，馮尚源，林文碩,等.白術(shù)煎劑表面增強拉曼光譜分析[J].光譜學(xué)與光譜分析,2009,29(9):2 450-2 452.

[10]黃浩,陳榮,陳偉煒,等.黃芪表面增強拉曼光譜研究[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2012,35(12):843-846.

[11]黃浩,侯俊玲,陳偉煒,等.澤瀉煎劑的拉曼光譜研究[J].福州大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2012,40(6):738-741.

[12]黃浩,陳偉煒,俞允,等.基于拉曼光譜技術(shù)的白芍藥湯劑的光譜特性分析[J].中國中藥雜志,2012,37(23):3 569-3 572.

[13]Zhao J, LIU H, MCLEAN D I, et al. Automated autofluorescence background subtraction algorithm for biomedical Raman spectroscopy[J].Appl. Spectrosc.,2007,61(11):1 225-1 232.

[14]周健,成浩,王麗鴛,等.基于杠桿率校正的PLS-DA法對正半巖武夷巖茶的識別研究[J].茶葉科學(xué),2009,29(1):34-40.

[15]許以明.拉曼光譜及其在結(jié)構(gòu)生物學(xué)中的應(yīng)用[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2005.

[16]F R多林希,W G佛特利,F F本特利.有機化合物的特征拉曼頻率[M].朱自瑩譯.北京:中國化學(xué)會,1980.

[17]郭蘭萍,黃璐琦,Christian W Huck.近紅外光譜技術(shù)及其在中藥道地性研究中的應(yīng)用[J].中國中藥雜志,2009,34(14):1 751-1 757.

[18]黃璐琦,陳美蘭,肖培根.中藥材道地性研究的現(xiàn)代生物學(xué)基礎(chǔ)及模式假說[J].中國中藥雜志,2004,29(6):5-7,121.

歡迎投稿!歡迎訂閱!

Discrimination of Radix Astragali seu Hedysari from Different Producing Areas Using Raman Spectroscopy

YU Yun1, HE Yan2, CHEN Rong3, HUANG Hao1, FENG Shang-yuan3, LIN Ju-qiang3, HUANG Zu-fang3, LI Yong-zeng3, CHEN Wei-wei1, LIN Duo1,LIN Jia3

1.CollegeofIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicine,FujianUniversityofTraditionalChineseMedicine,Fuzhou350122，China;

2.JiangxiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanchang330004,China;

3.CollegeofOptoelectronic-InformationalEngineering,FujianNormalUniversity,Fuzhou350007，China

Abstract:Objective:To discriminate Huangqi (Radix Astragali seu Hedysari) from different producing areas using Raman spectroscopy. Methods:The Raman spectroscopy of 100 batches of Huangqi from four producing areas of Inner Mongoli, Shanxi, Heilongjiang, and Gansu were measured and analyzed by principal component analysis (PCA) method to discriminate between samples from different producing areas. The discriminant model of producing areas based on partial least squares analysis (PLS) was establish and verified. Results:The differences between Raman spectra of Huangqi samples from five producing areas mainly displayed in the peak intensity of the spectrum, indicating that the biochemical substances contained in Huangqi from different areas have a significant difference in the composition ratio. The PCA could distinguish samples from different producing areas. In the 3-D scatter plot with PC1, PC2 and PC3 score as the three axes, five kinds of representative symbols for four different producing areas were effectively classified, without any overlap. Moreover, PLS discriminant model can correctly identify the producing areas of the Huangqi samples from Inner Mongoli, Heilongjiang, and Gansu. Conclusion:The results demonstrate that the combination of Raman spectroscopy technology, PCA and PLS can successfully identify origins of Huangqi, showing great potential of this method in the origin identification of other medicinal herbs.

Key words:Huangqi (Radix Astragali seu Hedysari); Raman spectroscopy; Principal Component Analysis (PCA); Partial Least Squares (PLS)

收稿日期：(2015-03-24)編輯：曾文雪

中圖分類號：R282.7

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目(61178090)；福建省自然科學(xué)基金項目(2013J01330)；陳可冀中西醫(yī)結(jié)合發(fā)展基金資助項目(CKJ2011010)。