酵母菌及其破碎液對紅曲色素及菌絲生長的影響

周 學 勤，王 嬋，王 紅 英

（1.大連工業(yè)大學 生物工程學院，遼寧 大連 116034；2.大連工業(yè)大學 食品學院，遼寧 大連 116034）

0 引 言

紅曲霉（Monascuspurpureus）的應(yīng)用在中國已有1 000多年的歷史，它是生產(chǎn)藥材、食品著色劑、紅曲米、紅曲酒的主要菌種［1］。紅曲色素作為天然色素，提取液中無黃曲霉素，安全無毒，可用于糖果、糕點、藥片、肉罐頭的染色［2－4］。中國食品發(fā)酵工業(yè)研究用紅曲紅色素代替?zhèn)鹘y(tǒng)的亞硝酸鹽對發(fā)酵香腸染色，用1.6 mg／g的紅曲色素形成的顏色接近于使用0.15 mg／g NaNO2產(chǎn)生的效果［5］。生產(chǎn)紅曲色素的傳統(tǒng)工藝是將紅曲霉固態(tài)發(fā)酵，此種方式耗糧多、周期長、勞動強度大、產(chǎn)率低且工藝煩瑣［6－8］。近年發(fā)展起來的液態(tài)發(fā)酵具有節(jié)約糧食、工藝簡單、生產(chǎn)周期短等優(yōu)點，但產(chǎn)量和色調(diào)偏低，工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)受到了制約。因此，提高紅曲色素產(chǎn)量及色調(diào)具有重要的意義［9－11］。

復合菌株發(fā)酵具有良好的發(fā)酵性能和穩(wěn)定性，可通過代謝產(chǎn)物等提高目標產(chǎn)物的得率［12－14］。朱振元等［15］將酵母發(fā)酵液及酵母細胞破碎液分別加入到紅曲霉液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)瓶中，提高了親水性色素和疏水性色素的產(chǎn)量；王偉平［16］將紅曲霉與啤酒酵母或米曲霉混合培養(yǎng)發(fā)酵，使得紅曲色素色價得到明顯提升。本實驗將酵母菌或酵母細胞破碎液加入紅曲霉液體培養(yǎng)瓶中，研究酵母及其細胞破碎液加入量、培養(yǎng)時間對紅曲色素產(chǎn)量、色調(diào)及紅曲霉菌絲體生長的影響。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 種

紅曲霉（M.purpureus）、啤酒酵母（Saccharomycescerevisiae），實驗室保藏菌種，由大連工業(yè)大學生物學院提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

麥芽汁固體培養(yǎng)基：用麥芽制成Bx 10°的麥芽汁，加入2%的瓊脂，pH 自然。

種子培養(yǎng)基：可溶性淀粉3%，硝酸鈉0.3%，酵母膏0.5%，磷酸二氫鉀0.1%，七水硫酸鎂0.05%，去離子水溶解，pH 自然。

基本培養(yǎng)基：葡萄糖2%，硫酸銨0.5%，磷酸二氫鉀0.1%，七水硫酸鎂0.05%，去離子水溶解，pH 6.0。

YEPD培養(yǎng)基：葡萄糖2%，蛋白胨2%，酵母膏1%，去離子水溶解，pH 6.0，121℃滅菌20min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖3%，硝酸鈉0.2%，磷酸氫二鉀0.1%，七水硫酸鎂0.05%，硫酸亞鐵0.001%，氯化鉀0.05%，去離子水溶解，pH 6.6。

1.2 方 法

1.2.1 紅曲霉的活化

將實驗室保藏的紅曲霉孢子粉用麥芽糖固體培養(yǎng)基二次活化培養(yǎng)后，得到純化的紅曲霉。

1.2.2 酵母菌及酵母細胞破碎液的制備

1.2.2.1 酵母菌的液體培養(yǎng)

將酵母菌接種于基本培養(yǎng)基（用于酵母菌對紅曲霉產(chǎn)紅色素的影響實驗）和YEPD 培養(yǎng)基（用于酵母破碎液對紅曲霉生產(chǎn)紅色素影響的實驗），35 ℃、170r／min的搖床中培養(yǎng)3d，計數(shù)。

1.2.2.2 酵母破碎液的制備

取上述酵母發(fā)酵液于7 000r／min條件下離心10min，收集菌體，稱濕重，用無菌水在無菌條件下沖洗幾次，加入適量的生理鹽水，用超聲波細胞破碎機（2s，2s，300 W，400 W）進行破碎。將破碎液在10 000r／min，4 ℃離心10min，取上清液，加入生理鹽水稀釋到500mL，備用。

1.2.3 紅曲霉的液態(tài)發(fā)酵

刮取活化后的紅曲霉的孢子粉于種子培養(yǎng)基中32 ℃、170r／min培養(yǎng)3d后，形成菌球大小均勻，直徑約2mm 的菌球，挑取10個紅曲霉菌球加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，于32℃、170r／min的搖床中培養(yǎng)24h。

1.2.4 紅曲霉與酵母菌及細胞破碎液的共同培養(yǎng)

向100mL紅曲霉發(fā)酵液中分別加入不同量的酵母菌及細胞破碎液，編號見表1。于30 ℃、170r／min培養(yǎng)6d，每隔1d測定一次，分別做3組平行實驗。

表1 酵母菌及破碎液的添加量Tab.1 Addictive amount of Saccharomyces cerevisiae and its lysate mL

1.2.5 紅曲霉產(chǎn)紅色素色價的測定

1.2.5.1 胞外色價

將發(fā)酵液在4 000r／min條件下離心10min，取上清液1mL加入9mL 的75%酒精，搖勻，以75%酒精作對照，測定510和410nm 的OD 值。胞外色素色價（U／mL）＝OD 值×稀釋倍數(shù)［17］。

1.2.5.2 胞內(nèi)色價

發(fā)酵液過濾后的菌絲體經(jīng)60℃烘干至恒重，將菌體于研缽中充分研磨，以75%乙醇定容至10mL，60 ℃浸提30min，每隔10min搖勻1次。取1mL該浸提液，加入9mL的75%酒精搖勻，以75%乙醇作空白對照，測定510 和410nm的OD 值。胞內(nèi)紅色素色價（U／mL）＝OD 值×稀釋倍數(shù)／菌體重［18］。

1.2.6 菌絲體干重

將發(fā)酵液離心、過濾，于90℃烘干5h，稱重。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌對紅曲霉產(chǎn)色素及菌體生長的影響

在相同條件下對加入了不同酵母菌量（105個／mL）的紅曲霉進行搖床培養(yǎng)，每隔24h在510及410nm 波長處對胞外及胞內(nèi)色素色價進行測量，并稱量菌體干重。

2.1.1 酵母菌對紅曲霉產(chǎn)胞外色素的影響

從圖1可以看出，與照組相比，添加酵母菌與紅曲霉共同培養(yǎng)沒有改變紅曲霉色素生產(chǎn)曲線的基本模式，隨發(fā)酵時間的延長色素產(chǎn)量增加。胞外色素在紅曲霉與酵母混合后5d，第3組效果最好，紅色素（510nm）產(chǎn)量為2.58 U／mL，比空白組提高了41.75%。如圖2 所示，胞外黃色素（420nm）產(chǎn)量也是第3組達到最大，為2.37U／mL，比空白組提高了78.19%。

圖1 酵母菌對紅曲霉產(chǎn)胞外紅色素的影響Fig.1 Effects of Saccharomyces cerevisiae on production of extracellular red pigment from Monascus purpureus

圖2 酵母菌對紅曲霉產(chǎn)胞外黃色素的影響Fig.2 Effects of Saccharomyces cerevisiae on extracellular yellow pigment of Monascus purpureus

2.1.2 酵母菌對紅曲霉產(chǎn)胞內(nèi)色素的影響

從圖3、4可以看出，隨發(fā)酵時間的延長，色素產(chǎn)量逐漸增加。胞內(nèi)色素在紅曲霉與酵母混合后5d達到最大值，第3組效果最好，紅色素產(chǎn)量為1 185.42U／g，比空白組提高了21.24%；黃色素產(chǎn)量為1 296.32U／g，比空白組提高了34.57%。

根據(jù)實驗結(jié)果推測，酵母菌與紅曲霉共同培養(yǎng)時，酵母菌產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶作用于真菌的細胞壁多糖的主要成分幾丁質(zhì)，成為紅曲霉細胞提高色素產(chǎn)量的刺激因子，增加細胞壁的通透性，從而提高色素產(chǎn)量；其次，可能是紅曲霉的細胞壁受到水解酶類水解時，菌體會與紅曲霉產(chǎn)生競爭作用，使紅曲霉生長受到自我保護，會大量產(chǎn)生疏水類物質(zhì)（如色素）抑制生長。當發(fā)酵培養(yǎng)接近尾聲時，培養(yǎng)基內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)消耗殆盡，菌株會以紅色素為營養(yǎng)物質(zhì)，消耗色素。

圖3 酵母菌對紅曲霉產(chǎn)胞紅內(nèi)色素的影響Fig.3 Effects of Saccharomyces cerevisiae on intracellular red pigment of Monascus purpureus

圖4 酵母菌對紅曲霉產(chǎn)胞內(nèi)黃色素的影響Fig.4 Effects of Saccharomyces cerevisiae on intracellular yellow pigment of Monascus purpureus

2.1.3 酵母菌對紅曲霉生長的影響

從圖5可以看出，添加酵母菌沒有改變紅曲霉生長曲線的基本模式，菌體質(zhì)量在紅曲霉與酵母混合后4d達到最大值，也是第3組菌體質(zhì)量達到最大值，為0.26g，比空白組提高了100%。

圖5 酵母菌對紅曲霉菌絲生長的影響Fig.5 Effects of Saccharomyces cerevisiae on mycelial growth of Monascus purpureus

2.2 酵母破碎液對紅曲霉產(chǎn)色素及菌體生長的影響

2.2.1 酵母破碎液對紅曲霉產(chǎn)胞外色素的影響

從圖6、7可以看出，添加酵母破碎液沒有改變紅曲霉色素生產(chǎn)曲線的基本模式，色素隨發(fā)酵時間的延長產(chǎn)量有所增加。胞外色素在紅曲霉與酵母破碎液混合后5d達到最大值，第2組效果最好，胞外紅色素產(chǎn)量為4.43 U／mL，比空白組提高了55.99%；胞外黃色素產(chǎn)量為4.03U／mL，比空白組提高了48.71%。

圖6 酵母破碎液對紅曲霉產(chǎn)胞外紅色素的影響Fig.6 Effects of Saccharomyces cerevisiae lysate on extracellular red pigment of Monascus purpureus

圖7 酵母破碎液對紅曲霉產(chǎn)胞外黃色素的影響Fig.7 Effects of Saccharomyces cerevisiae lysate on extracellular yellow pigment of Monascus purpureus

2.2.2 酵母破碎液對紅曲霉產(chǎn)胞內(nèi)色素的影響

從圖8、9可以看出，胞內(nèi)色素在紅曲霉與酵母破碎液混合后5d達到最大值，第2組效果最好，胞內(nèi)紅色素產(chǎn)量為1 043.25 U／g，比空白組提高20.87%；胞內(nèi)黃色素產(chǎn)量為1 003.68U／g，比空白組提高了23.88%。

酵母細胞破碎液促進了紅曲霉紅色素產(chǎn)量的增加，可能是破碎液中的幾丁質(zhì)酶對紅曲霉的刺激作用，也可能是酵母細胞破碎液中含有紅曲色素合成途徑中紅色素的前體反應(yīng)的酶的催進物，具體是哪種成分催進了次級代謝產(chǎn)物紅色素的合成有待進一步研究。

圖8 酵母破碎液對紅曲霉產(chǎn)胞內(nèi)紅色素的影響Fig.8 Effects of Saccharomyces cerevisiae lysate on intracellular red pigment of Monascus purpureus

圖9 酵母破碎液對紅曲霉產(chǎn)胞內(nèi)黃色素的影響Fig.9 Effects of Saccharomyces cerevisiae lysate on intracellular yellow pigment of Monascus purpureus

2.2.3 酵母細胞破碎液對紅曲霉生長的影響

如圖10所示，菌體質(zhì)量在紅曲霉與酵母混合后5d達到最大值。添加的酵母破碎液量為培養(yǎng)液體積的4%時效果最好，菌體質(zhì)量為0.41g，比空白組提高了19.35%。

圖10 酵母破碎液對紅曲霉菌絲生長的影響Fig.10 Effects of Saccharomyces cerevisiae lysate on mycelial growth of Monascus purpureus

2.3 酵母菌及其細胞破碎液對紅曲紅色素色調(diào)的影響

紅曲紅色素一般為多種色素的混合物，主要含紅色素和黃色素，兩者比值即為色調(diào)，色調(diào)也是評價紅色素質(zhì)量的指標之一。若紅多于黃，即色調(diào)大于1，則顏色感官為深紅；反之，黃多于紅，即色調(diào)小于1，則顏色呈橙紅或橙黃色［18］。

取5d時每組的紅色素色調(diào)進行比較，如表2所示，胞內(nèi)外紅曲色素色調(diào)均隨著酵母菌加入量的增大而減小，分析可能是因為酵母菌與紅曲霉競爭營養(yǎng)物質(zhì)，給紅曲霉造成了生產(chǎn)黃色素比紅色素更適宜的營養(yǎng)環(huán)境，從而使紅色素色調(diào)降低。而酵母細胞破碎液對紅色素色調(diào)的影響并不顯著，色調(diào)幾乎保持在1.00，表示紅色素色調(diào)的影響與酵母菌產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物無關(guān)。

表2 酵母菌及其細胞破碎液對紅曲色素色調(diào)的影響Tab.2 Effects of Saccharomyces cerevisiae and its lysate on hue of red pigment

3 結(jié) 論

混菌之間可互利共棲，產(chǎn)生協(xié)同作用，提高產(chǎn)率［19］。酵母菌與紅曲霉混合培養(yǎng)可使紅曲霉產(chǎn)色素量增加，在混菌培養(yǎng)5d、菌液加入量為12mL（培養(yǎng)液體積的4%）時，色素產(chǎn)量達到最大值，比紅曲霉單獨培養(yǎng)胞外紅色素和胞內(nèi)紅色素分別提高了41.75%和21.24%，菌體干重提高了100%。酵母細胞破碎液也可使紅曲霉產(chǎn)色素量增加，在共同培養(yǎng)5d，加入量為4mL（培養(yǎng)液體積的4%）時達到最大值，比紅曲霉單獨培養(yǎng)胞外紅色素和胞內(nèi)紅色素分別提高了55.99%和20.87%，菌體干重提高了19.35%。此外，實驗還研究了酵母菌及其破碎液對紅色素色調(diào)的影響，表明色調(diào)變化與酵母菌代謝產(chǎn)物無關(guān)。

酵母菌及其破碎液能增加紅曲色素產(chǎn)量，若能在規(guī)模化生產(chǎn)中應(yīng)用，將能產(chǎn)生可觀的效益。

［1］FENG Yanli，SHAO Yanchun，CHEN Fusheng.Monascuspigments［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，2012，96（6）：1421－1440.

［2］周立平.紅曲研究生產(chǎn)現(xiàn)狀與進展［J］.釀酒科技，2003（4）：34－35.

［3］丘振宇，王亞琴，許喜林.紅曲霉的特點及應(yīng)用研究［J］.食品工業(yè)科技，2006（12）：186－188.

［4］朱效剛，許贛榮.紅曲的保健功能及產(chǎn)品開發(fā)趨勢［J］.食品研究與開發(fā)，2005，26（3）：128－130.

［5］郭紅珍，楊潞芳.紅曲霉的研究進展［J］.中國食品添加劑，2003（3）：22－24.

［6］衣珊珊，沈昌，韓永斌，等.紅曲色素形成機理及提高色價的途徑［J］.食品科學，2005，26（7）：256－260.

［7］夏書華，劉穎.有關(guān)紅曲色素的提取及提高色價的研究［J］.北京農(nóng)學院學報，1999，14（1）：44－48.

［8］邢淑婕，劉開華.培養(yǎng)條件對紅曲霉產(chǎn)紅曲紅色素及桔霉素影響的研究［J］.中國食品添加劑，2010（1）：112－115.

［9］方元超，楊柳.紅曲霉研究進展綜述［J］.四川食品與發(fā)酵，1999（1）：5－10.

［10］郭紅珍，王秋芬，馬立芝.不同培養(yǎng)條件對紅曲霉產(chǎn)紅曲色素的研究［J］.食品科學，2008，29（1）：215－218.

［11］吳大康.液態(tài)發(fā)酵法生產(chǎn)紅曲色素的研究［J］.中國調(diào)味品，1991（12）：12－18.

［12］牛麗亞，黃占旺，肖招燕.雙菌混合發(fā)酵產(chǎn)物穩(wěn)定性的研究［J］.中國飼料，2009（5）：14－16.

［13］唐潔，王海燕，徐巖.釀酒酵母和異常畢赤酵母混菌發(fā)酵對白酒液態(tài)發(fā)酵效率和風味物質(zhì)的影響［J］.微生物學通報，2012，39（7）：921－930.

［14］覃莉，王志，陳雄，等.酵母菌醋酸菌混菌發(fā)酵高產(chǎn)醋酸工藝研究［J］.中國釀造，2012，31（1）：144－147.

［15］朱振元，滿金浩，劉安軍.酵母細胞影響紅曲霉次生代謝產(chǎn)物的研究［J］.現(xiàn)代食品科技，2009，25（2）：136－140.

［16］王偉平.啤酒酵母或米曲霉與紫紅曲霉混合發(fā)酵對紅色素的影響［J］.中國釀造，2006（7）：28－29.

［17］夏書華，劉穎.有關(guān)紅曲色素的提取及提高色階的研究［J］.北京農(nóng)學院學報，1999，14（1）：44－48.

［18］梁志洲，徐民俊，胡海燕，等.酵母破碎液對紅曲霉紅色素生產(chǎn)能力的影響［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2011，37（3）：37－40.

［19］徐穎宣，徐爾尼，馮乃憲，等.微生物混菌發(fā)酵應(yīng)用研究進展［J］.中國釀造，2008（9）：1－4.