紅三葉ISSR-PCR反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化

孟麗娟，趙桂琴

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 草業(yè)學(xué)院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省草業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室/中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070)

紅三葉ISSR-PCR反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化

孟麗娟，趙桂琴

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 草業(yè)學(xué)院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省草業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室/中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070)

采用正交試驗(yàn)設(shè)計，對影響紅三葉ISSR-PCR反應(yīng)較大的4個因素(TaqDNA 聚合酶、Mg2+、dNTP及引物)在4個水平上進(jìn)行篩選，建立并優(yōu)化了適合紅三葉ISSR分析的最佳反應(yīng)體系。在25 μL反應(yīng)體系中各反應(yīng)物的最適含量為40 ng模板DNA，10×PCR-buffer 2.5 μL，2.5 mmol/L Mg2+，2.5 UTaqDNA聚合酶，引物1 μmol/L，0.2 mmol/L dNTP。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，引物退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)35次；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。優(yōu)化體系的建立為采用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行紅三葉種質(zhì)資源遺傳多樣性分析提供了技術(shù)參考。

紅三葉；ISSR-PCR；正交優(yōu)化

紅三葉(Trifoliumpratense)為豆科三葉草屬多年生草本植物，生存5～8年。中國新疆、吉林、云貴高原、湖北鄂西山地都有野生分布，江淮流域、華南、西南和西北等地均有栽培，是長江流域以南及甘肅二陰區(qū)優(yōu)良的豆科牧草[1，2]。紅三葉生長速度快、再生力強(qiáng)、產(chǎn)草量高、草質(zhì)柔嫩多汁、適口性好、營養(yǎng)價值高，各種畜禽和魚類均喜食[3]。目前，三葉草遺傳多樣性研究主要采用RAPD[4，5]、SRAP[6]、SSR[7]等技術(shù)，而且大多集中于白三葉。對紅三葉種質(zhì)資源的研究主要集中在栽培技術(shù)[8]，株型結(jié)構(gòu)[9]，營養(yǎng)價值[10]，轉(zhuǎn)基因[11]，異黃酮[12]等方面，利用ISSR標(biāo)記研究紅三葉遺傳多樣性具有實(shí)際價值。

ISSR標(biāo)記是在微衛(wèi)星分子標(biāo)記基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種分子標(biāo)記[13]。該技術(shù)利用簡單重復(fù)序列(SSR)來設(shè)計引物，無需預(yù)先克隆和測序，操作簡單易行。ISSR引物序列長、退火溫度高、特異性和穩(wěn)定性增強(qiáng)，可檢測到更豐富的遺傳變異[14]。ISSR標(biāo)記結(jié)合了RAPD和SSR的優(yōu)點(diǎn)，具有模板需要量少，多態(tài)性豐富，無需試劑盒，結(jié)果記錄方便，試驗(yàn)成本低，操作簡單，試驗(yàn)穩(wěn)定性高等優(yōu)點(diǎn)而倍受青睞[15]，廣泛應(yīng)用于生物研究的各個領(lǐng)域。近年來，ISSR分子標(biāo)記技術(shù)已開始應(yīng)用于草種質(zhì)資源遺傳多樣性研究，在早熟禾(Poaannua)[16]、鵝觀草(Roegneriakamoji)[17]、燕麥(Avenasativa)[18]、披堿草(Elymusnutans)[19]、紫花苜蓿(Medicagosativa)[20]、昆侖錦雞兒(Caraganapolourensis)[21]、小花棘豆(Oxytropisglabra)[22]和扁蓄豆(Ruthenianmedic)[23]等牧草上均有報道。但由于ISSR-PCR是基于PCR 的一種標(biāo)記，其反應(yīng)條件易受到各因素濃度的影響，反應(yīng)體系不同也可產(chǎn)生不同的結(jié)果。為了確保ISSR分析結(jié)果的可靠性和重復(fù)性，進(jìn)行ISSR-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化非常必要。利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)，以國外引進(jìn)的10份紅三葉種質(zhì)為材料，以紅三葉基因組DNA為模板，采用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計[24]對ISSR-PCR反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，探討反應(yīng)體系中隨機(jī)引物、dNTP、TaqDNA聚合酶、Mg2+等的濃度以及反應(yīng)的退火溫度和循環(huán)次數(shù)等因子對紅三葉基因組的ISSR擴(kuò)增效果的影響，旨在建立一種用于紅三葉的ISSR-PCR反應(yīng)體系，為進(jìn)一步開展紅三葉遺傳多樣性研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試的10份紅三葉材料(表1)，均種植于甘肅省中部的榆中縣良種場，在生長期采集新鮮葉片，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 試驗(yàn)材料及來源Table1 The sampled materials and source

1.2 試劑

TaqDNA 聚合酶、dNTPs、PCR Buffer、引物、MgCl2、Maker 均來自上海生工。ISSR引物參照加拿大哥倫比亞大學(xué)(UBC)提供的ISSR引物序列，由上海生物工程有限公司合成。

1.3 基因組DNA的提取與檢測

采用改良的CTAB法[25]提取紅三葉葉片總DNA，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)量，并用Gene Spec核酸檢測儀檢測DNA 質(zhì)量濃度。最后將樣品稀釋為20 ng/μL，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 ISSR-PCR正交試驗(yàn)設(shè)計

在PCR反應(yīng)體系建立過程中，dNTP濃度、引物濃度、Mg2+濃度以及TaqDNA聚合酶用量、退火溫度和循環(huán)次數(shù)等均影響PCR擴(kuò)增結(jié)果。針對TaqDNA聚合酶用量、Mg2+濃度、dNTP濃度、引物濃度等4個主要因素，選用L16(44)正交表[26]，設(shè)計PCR各反應(yīng)成分的因素水平(表2)及正交試驗(yàn)(表3)。反應(yīng)體系總體積為25 μL，除上述4個變化因素外，每管包括10×PCR Buffer 2.5 μL，模板DNA 2 μL。采用篩選的最佳引物UBC841作為固定引物，用1號紅三葉種質(zhì)的DNA作為固定模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增條件的優(yōu)化，初始反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，引物退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)35次；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。PCR擴(kuò)增完成后，取8 μL擴(kuò)增產(chǎn)物在1.7%的瓊脂糖凝膠上電泳，在1×TBE 緩沖液中電泳約1 h(電壓為100 V)，檢測后置于UVP 紫外凝膠成像系統(tǒng)中觀察拍照。

表2 ISSR-PCR反應(yīng)的因素與水平Table2 Factors and levels of ISSR-PCR reaction

1.5 退火溫度和循環(huán)次數(shù)的確定

根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果找出最佳處理，應(yīng)用最佳處理從20條引物中篩選出多態(tài)性豐富的引物。根據(jù)所選引物的理論退火溫度Tm[Tm=4(G+C)+2(A+T)]，對每個引物的退火溫度進(jìn)行梯度試驗(yàn)，設(shè)定退火溫度為47～57 ℃，由PCR擴(kuò)增儀自動生成8個溫度梯度。即47.0、47.7、48.9、50.7、53.0、54.9、56.2、57.0 ℃。用基礎(chǔ)反應(yīng)程序篩選引物的最佳退火溫度。根據(jù)最佳反應(yīng)體系和最適退火溫度對循環(huán)次數(shù)進(jìn)行3個梯度試驗(yàn)。即30、35、40次，每個梯度設(shè)2個重復(fù)。

1.6 優(yōu)化體系穩(wěn)定性檢測

隨機(jī)篩選其他ISSR引物，對優(yōu)化確定的紅三葉ISSR-PCR反應(yīng)體系、退火溫度及循環(huán)次數(shù)進(jìn)行擴(kuò)增，對優(yōu)化體系的穩(wěn)定性進(jìn)行檢測。

表3 ISSR-PCR正交試驗(yàn)設(shè)計方案Table3 Orthogonal design[L16(44)]for ISSR-PCR reaction

2 結(jié)果與分析

2.1 紅三葉基因組DNA的提取與檢測

提取高質(zhì)量的紅三葉基因組DNA是ISSR擴(kuò)增成功與否的關(guān)鍵，試驗(yàn)采用了改進(jìn)的CTAB法提取DNA。所提取DNA無色透明，可溶性好，譜帶清晰，無拖帶現(xiàn)象，表明DNA并未發(fā)生降解，點(diǎn)樣孔無熒光出現(xiàn)，蛋白質(zhì)、酚類和其他雜質(zhì)較少，符合PCR要求(圖1)。

圖1 10個紅三葉品系基因組DNA電泳圖Fig.1 Electrophoresis of genetic DNA of 10 red clover accessions

注：1～10為10個紅三葉種質(zhì)的DNA電泳檢測，順序與表1一致

2.2 ISSR反應(yīng)體系的正交優(yōu)化

按表3設(shè)計的16個處理進(jìn)行PCR反應(yīng)后，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.7%瓊脂糖凝膠電泳(圖2)。從ISSR-PCR擴(kuò)增結(jié)果可以直觀看出，在16個處理組合中，由于引物、dNTP、Mg2+、TaqDNA 聚合酶4大影響因素濃度組合的不同，擴(kuò)增效果存在明顯的差異。第1、4、7、11組合無條帶；第2、5、6、12、15組合擴(kuò)增效果較差，譜帶弱且多態(tài)性低；第3、9、10、14、16組合擴(kuò)增譜帶較多，但部分信號較弱，且條帶不清晰；第8、13組合擴(kuò)增譜帶清晰，多態(tài)性高(圖2)。最佳組合應(yīng)選擇特異性強(qiáng)、譜帶多態(tài)性高、譜帶清晰且譜帶較穩(wěn)定的組合。根據(jù)譜帶數(shù)、特異性和經(jīng)濟(jì)性的原則，確定8號組合為最佳組合。由此得出，紅三葉ISSR-PCR反應(yīng)體系中，總體積25 μL的最佳反應(yīng)體系為：TaqDNA聚合酶2.5 U，dNTP 0.2 mmol/L，Mg2+2.5 mmol/L，引物1.0 μmol/L。

圖2 正交設(shè)計ISSR-PCR反應(yīng)體系擴(kuò)增Fig.2 The amplification result of ISSR-PCR with orthogonal design

注：M為Marker ，1～16為表3的處理組合編號

2.3 引物篩選和退火溫度的確定

根據(jù)正交設(shè)計試驗(yàn)結(jié)果，選擇8號處理組合，對20條引物進(jìn)行初步篩選和復(fù)篩，最終將擴(kuò)增條帶清晰、多態(tài)性豐富、重復(fù)性好的5條引物用于全部樣品的擴(kuò)增和不同引物退火溫度的篩選。ISSR-PCR反應(yīng)中，退火溫度的高低直接影響引物與模板DNA的特異性結(jié)合。引物的堿基構(gòu)成不同，適宜的退火溫度就不同。因此，確定不同引物的最佳退火溫度非常必要。為了得到重復(fù)性好、分辨率高的擴(kuò)增譜帶，根據(jù)所選引物堿基組成估算理論退火溫度Tm[Tm=4(G+C)+2(A+T)]，在理論退火溫度上下設(shè)置8個梯度，在梯度PCR儀上進(jìn)行退火溫度篩選。從20條引物中篩選出5條適宜紅三葉ISSR分析的引物及最佳的退火溫度(表4)。

表4 ISSR引物序列和最佳退火溫度Table4 ISSR primer sequences and suiTableannealing temperature

采用最佳反應(yīng)體系對引物UBC841進(jìn)行溫度梯度PCR試驗(yàn)。退火溫度較低時，擴(kuò)增條帶較弱，47.7 ℃和48.9 ℃時擴(kuò)增條帶相同，但50.7 ℃時擴(kuò)增的條帶最清晰，最穩(wěn)定。53.0 ℃和54.9 ℃時擴(kuò)增特異帶減少， 隨著退火溫度的提高，擴(kuò)增條帶明顯減少(圖3)。故引物UBC841的最佳退火溫度為50.7 ℃ 。由于ISSR引物較長，可適當(dāng)提高退火溫度以提高擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。

2.4 循環(huán)次數(shù)對ISSR擴(kuò)增的影響

循環(huán)次數(shù)對擴(kuò)增產(chǎn)物量有明顯的影響。循環(huán)次數(shù)太少，產(chǎn)物量較低；循環(huán)次數(shù)太多，則達(dá)到反應(yīng)平臺后，循環(huán)不會使產(chǎn)物量增加，反而引起非特異性擴(kuò)增。因此，選擇適宜的循環(huán)次數(shù)將會獲得良好的擴(kuò)增效果。在確立了以上各影響因素最適條件的基礎(chǔ)上，分別試驗(yàn)了不同循環(huán)次數(shù)(30、35、40)對擴(kuò)增結(jié)果的影響。所有的循環(huán)次數(shù)都可擴(kuò)增出譜帶，30個循環(huán)時，部分譜帶較弱，產(chǎn)率低；35個循環(huán)時，擴(kuò)增譜帶強(qiáng)弱合適，清晰穩(wěn)定；40個循環(huán)時，擴(kuò)增譜帶少，部分帶型較弱或缺失(圖4)。因此，試驗(yàn)的循環(huán)次數(shù)確定為35次。

圖3 引物UBC841退火溫度對擴(kuò)增結(jié)果的影響Fig.3 Effect of annealing temperature of UBC 851 primer on amplification pattern

注：M為Marker，1～8為退火溫度47.0 ℃、47.7 ℃、48.9 ℃、50.7 ℃、53.0 ℃、54.9 ℃、56.2 ℃、57.0 ℃

2.5 ISSR-PCR反應(yīng)體系的穩(wěn)定性檢測

通過對反應(yīng)體系、退火溫度、循環(huán)次數(shù)和程序的優(yōu)化，建立了適合紅三葉ISSR分子標(biāo)記的最優(yōu)體系。即25 μL 體系中，2.5 μL 10×PCR buffer，TaqDNA 聚合酶2.5 U，0.2 mmol/L dNTP，2.5 mmol/L Mg2+，1 μmol/L引物和模板DNA 2 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，引物退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)35次；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。

圖4 循環(huán)次數(shù)對擴(kuò)增結(jié)果的影響Fig.4 Effect of cycle number on amplification

注：M為Marker，1～3為循環(huán)次數(shù)，分別為30，35和40

利用正交試驗(yàn)優(yōu)化的反應(yīng)體系、最適退火溫度和最佳循環(huán)次數(shù)，選擇其他引物UBC851對10份紅三葉種質(zhì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以檢測所優(yōu)化的ISSR-PCR反應(yīng)體系的穩(wěn)定性和可靠性。結(jié)果表明，引物UBC851在10份紅三葉種質(zhì)上擴(kuò)增出的條帶清晰、明亮、重復(fù)性好、多態(tài)性豐富(圖5)。說明該反應(yīng)體系適合于紅三葉種質(zhì)資源的ISSR-PCR反應(yīng)，可用于紅三葉遺傳多樣性分析和研究。

圖5 紅三葉種質(zhì)DNA的ISSR 擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 ISSR amplification results of red clover

注：M為Marker，1～10與表1的序號一致

3 討論

ISSR結(jié)合了RAPD和SSR的優(yōu)點(diǎn)，重復(fù)性好、穩(wěn)定性高、快速靈敏，但是擴(kuò)增條件和擴(kuò)增程序變化及物種不同會對ISSR擴(kuò)增圖譜產(chǎn)生較大的影響[27]，尤其是體系中TaqDNA聚合酶，Mg2+，dNTP及引物濃度相互影響，這與文獻(xiàn)[15]所研究的內(nèi)容一致。因此，為了獲得重復(fù)性好、可靠性高的ISSR譜帶，保證試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性并找到合適紅三葉的最佳反應(yīng)程序，同時兼顧節(jié)約成本和縮短試驗(yàn)周期，對紅三葉進(jìn)行引物的篩選、ISSR-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化及退火溫度和循環(huán)次數(shù)的確定十分必要?？紤]各因素之間的相互作用，采用正交設(shè)計方法確定了紅三葉ISSR-PCR的最佳反應(yīng)體系，并對結(jié)果的可靠性和穩(wěn)定性進(jìn)行了驗(yàn)證。與以往的單因素PCR優(yōu)化設(shè)計相比，正交設(shè)計試驗(yàn)兼顧各因素間的交互作用，省時省力，能夠較快地獲得最優(yōu)的水平組合[24]，避免了單因素試驗(yàn)顧此失彼、試驗(yàn)規(guī)模大的不足[28]。

在ISSR-PCR反應(yīng)體系中，影響PCR擴(kuò)增反應(yīng)的各種因素(TaqDNA聚合酶、Mg2+、dNTP和引物等)同樣影響ISSR-PCR的擴(kuò)增效果。TaqDNA聚合酶的種類以及用量直接影響擴(kuò)增反應(yīng)成功與否。不同廠家或不同批次的酶活性有一定的差異，選擇同一廠家同一批次的酶，可保證在試驗(yàn)過程中試驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性。找出適合試驗(yàn)的用量，以2.5 U/25.0 μL為最佳用量。Mg2+濃度是影響ISSR-PCR結(jié)果的一個重要因素。游離Mg2+是激活TaqDNA聚合酶的必要因子，Mg2+濃度過低對酶的活化作用不夠，過高易螯合dNTPs，使dNTPs消耗殆盡，無延伸反應(yīng)，造成擴(kuò)增失敗。此外，Mg2+還影響引物與模板的結(jié)合，從而導(dǎo)致PCR結(jié)果的改變[29]。試驗(yàn)優(yōu)化的Mg2+濃度為2.5 mmol/L。dNTPs是ISSR-PCR反應(yīng)的基本原料，dNTPs濃度過高，會導(dǎo)致PCR錯配，從而出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增；過高會導(dǎo)致擴(kuò)增不完全，條帶少，產(chǎn)物弱。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果可知，最為理想的dNTP濃度是0.2 mmol/L。引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，引物濃度要適量，濃度過低時擴(kuò)增產(chǎn)物少、條帶弱，過高會出現(xiàn)非特異性條帶。結(jié)果表明，在25 μL的反應(yīng)體系中，引物濃度為1 μmol/L時擴(kuò)增效果最好。雖然模板DNA濃度是ISSR-PCR反應(yīng)體系的影響因素之一，但I(xiàn)SSR-PCR反應(yīng)對DNA模板濃度的要求范圍較寬，相關(guān)試驗(yàn)[30]也證明了模板濃度對PCR擴(kuò)增結(jié)果影響不敏感。因此，未對模板DNA的濃度進(jìn)行梯度試驗(yàn)，直接采用模板DNA的濃度為40 ng/μL，取得了較為理想的結(jié)果。

PCR反應(yīng)中，退火溫度和循環(huán)次數(shù)對擴(kuò)增結(jié)果都有一定的影響。退火溫度的高低直接影響引物與模板的特異性結(jié)合。退火溫度較低時雖然能保證模板與引物穩(wěn)定結(jié)合，但也會產(chǎn)生錯誤擴(kuò)增[31]。退火溫度過高時，引物與模板結(jié)合差，PCR產(chǎn)物少。由于不同的引物有其適宜的退火溫度，若選用不同的引物還需通過試驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化[26]。因此，對篩選出的5條引物逐個進(jìn)行退火溫度梯度試驗(yàn)，確定每個引物的最適退火溫度。該試驗(yàn)所用引物UBC841和UBC851的最適退火溫度分別為50.7 ℃和54.9 ℃。循環(huán)次數(shù)直接影響到PCR反應(yīng)產(chǎn)量的多少。從理論原則上，循環(huán)次數(shù)與擴(kuò)增產(chǎn)物量成正比關(guān)系，但實(shí)際上循環(huán)次數(shù)過多會增加非特異擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)量和復(fù)雜性，從而導(dǎo)致條帶彌散、帶間模糊[32]。采用35個循環(huán)就能達(dá)到良好的擴(kuò)增效果，在一定程度上節(jié)約了試驗(yàn)時間。

4 結(jié)論

對ISSR反應(yīng)影響較大的4個因素進(jìn)行了優(yōu)化，建立了紅三葉ISSR-PCR的最優(yōu)反應(yīng)體系。在25 μL體系中，包含40 ng模板DNA，10×PCR-buffer 2.5 μL，2.5 mmol/L Mg2+，2.5 UTaqDNA聚合酶，引物1 μmol/L，0.2 mmol/L dNTP。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，引物退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)35次；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。

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Establishment and optimization of ISSR-PCR amplification system for red clover

MENG Li-juan1,ZHAO Gui-qin1

(CollegeofPrataculturalScience,GansuAgriculturalUniversity/KeyLaboratoryofGrasslandEcosystem，MinistryofEducation/PrataculturalEngineeringLaboratoryofGansuProvince/Sino-U.S.CentersforGrazinglandEcosystemSustainability,Lanzhou730070,China)

With a orthogonal design,the paper studied four main factors(TaqDNA polymerase,Mg2+,premier and dNTP)at four level that infulence ISSR-PCR amplification system for red clover and finally established an optimal reaction system.In the amplification system with 25 μL solution,the appropriate containing of reactants were 40 ng template DNA,10×PCR-buffer 2.5 μL,2.5 mmol/L Mg2+,2.5 UTaqDNA polymerase,1 μmol/L premier and 0.2 mmol/L dNTP.The optimized reaction program was 94 ℃ for 5min,followed by 35 cycles of 94 ℃ for 30 s,annealing 30 s,1 min at 72 ℃ and a final extension at 72 ℃ for 7 min,then preservation at 4 ℃.The establishment of the optimized amplification system provides a technical references for the analysis of genetic diversity of red clover with ISSR markers.

red clover；ISSR-PCR；orthogonal optimization

2014-10-15；

2015-03-23

農(nóng)業(yè)部牧草種質(zhì)資源保護(hù)項目(2013014)和甘肅高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)項目(2012009)資助

孟麗娟(1990-)，女，甘肅鎮(zhèn)原人，在讀碩士。 E-mail：menglijuan01180026@163.com 趙桂琴為通訊作者。

S 541；Q 75

A

1009-5500(2015)02-0021-06