鎘脅迫對(duì)4種草坪草抗逆生理特性的影響

陳 偉，張苗苗，宋陽陽，張德罡

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 草業(yè)學(xué)院／草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室／甘肅省草業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室／中－美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070；2.蘭州城市學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

隨著工業(yè)化進(jìn)程的不斷加快，環(huán)境污染成為日益突出的生態(tài)問題之一。重金屬在土壤中的不斷積累與富集也對(duì)環(huán)境造成嚴(yán)重危害。Cd是毒性很強(qiáng)的一種重金屬，也是農(nóng)田受污染最普遍的重金屬之一，被聯(lián)合國環(huán)境規(guī)劃局和國際勞動(dòng)衛(wèi)生重金屬委員會(huì)認(rèn)定為重點(diǎn)環(huán)境污染物，被美國毒物管理委員會(huì)列為第6位危害人體健康的有毒物質(zhì)［1］。Cd在自然界中主要來自巖石和礦物中的本底值，巖石圈中Cd的含量在0.1～0.2 mg／kg［2］，不會(huì)對(duì)人體及生態(tài)系統(tǒng)構(gòu)成危害。但是隨著采礦、冶煉和電鍍工業(yè)的不斷發(fā)展，大量含Cd廢水排入河流。同時(shí)，某些磷肥含有大量的Cd，在使用過程中會(huì)造成Cd在土壤中的累積。另外，由于Cd在生物體內(nèi)遷移性比較強(qiáng)，在人體中累積達(dá)到一定程度，會(huì)造成慢性中毒［3－5］。

重金屬對(duì)植物產(chǎn)生脅迫后，植物會(huì)發(fā)生一系列生理生化反應(yīng)來抵御這種逆境。以4種草坪草種為對(duì)象，通過盆栽試驗(yàn)研究了Cd2＋對(duì)草坪草脯氨酸含量、MDA含量和抗氧化酶活性等抗逆生理特性的影響，探討草坪草對(duì)Ca2＋耐受能力，為研究草坪草抗重金屬脅迫機(jī)制和篩選抗性草種提供數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

供試草種：草地早熟禾 （Poa pratensis）品種百斯特（Barrister），多年生黑麥草（Lolium perenne）品種首相（Premier），高羊茅（Festuca elata）品種銳步（Barrera），白三葉（Trifolium repens）品種海發(fā)（Haifa），由百綠公司提供。供試金屬離子：3CdSO4·8H2O分析純?cè)噭?/p>

1.2 重金屬離子處理梯度設(shè)置

重金屬離子以溶液形式加入到培養(yǎng)皿中，重金屬離子濃度依據(jù)中華人民共和國國家土壤環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（GB15618－2008）3級(jí)土壤環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)量進(jìn)行配制［6］，結(jié)合預(yù)試驗(yàn)結(jié)果設(shè)置Cd2＋濃度，其濃度梯度依次為Cd2＋（1，50，100，150 mg／kg）。同時(shí)設(shè)置對(duì)照處理。

1.3 試驗(yàn)方法

將供試種子棄去雜質(zhì)和有蟲蝕及成熟度較低的種子，用0.1%KMn O4溶液浸泡15 min，用自來水沖洗數(shù)次，至無紅色為止，再用去離子水沖洗3次，用濾紙將水吸干。直接播入以蛭石為基床、直徑12 cm花盆，發(fā)芽方法按GB／T 2930.4－2001，待草坪草幼苗長(zhǎng)出2片展開葉時(shí)按照1株／cm2的標(biāo)準(zhǔn)剔除多余幼苗，根據(jù)培養(yǎng)基70%持水量每天注入Hoagland’s營養(yǎng)液并將重金屬無機(jī)鹽溶液按梯度施入，當(dāng)幼苗長(zhǎng)出第4片葉時(shí)進(jìn)行生長(zhǎng)發(fā)育指標(biāo)的測(cè)定。

1.4 草坪草抗逆生理指標(biāo)測(cè)定

1.4.1 脯氨酸含量測(cè)定 采用酸性茚三酮法［7］。

單位鮮重樣品中脯氨酸含量＝（x×5／2）／（樣重×106）×100%

MDA含量測(cè)定采用硫代巴比妥酸法，稱取各供試草坪草葉片材料1 g，加入2 m L 10%的三氯乙酸（TCA），研磨，最后用TCA定容10 m L。

MDA（μmol／L）＝6.45×D532nm－0.56×D450nm

酶的提取：取0.1 g葉片與預(yù)冷研缽中，加入1 mL酶提取液以50 mmol／L pH 7.8的磷酸緩沖液配制，含有0.1 mmol／L EDTA、質(zhì)量濃度為0.3%Triton X－100和質(zhì)量濃度為4%聚乙烯聚吡咯烷酮（PVPP），在冰浴上研磨成勻漿，加酶提取液使終體積為5 mL。在冷凍離心機(jī)中4℃下，10 000 r／min，離心20 min，取上清液用于酶活力測(cè)定。

SOD活性的測(cè)定采用氮藍(lán)四唑（NBT）法測(cè)定，POD活性的測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

運(yùn)用Excel整理數(shù)據(jù)、制作相關(guān)圖表，用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cd2＋脅迫對(duì)草坪草脯氨酸含量的影響

Cd2＋脅迫下4種草坪草脯氨酸含量均顯著高于對(duì)照（圖1），且隨離子濃度的升高而升高。其中，高羊茅和草地早熟禾脯氨酸含量在不同濃度Cd2＋脅迫下差異顯著（P＜0.05）；多年生黑麥草在Cd2＋濃度為0～100 mg／kg處理時(shí)脯氨酸含量差異顯著（P＜0.05），但是在Cd2＋濃度為100 mg／kg和150 mg／kg處理下脯氨酸含量差異不顯著。Cd2＋濃度為0，1和50 mg／kg時(shí)，白三葉脯氨酸含量差異顯著，但是，隨著離子濃度的升高，白三葉脯氨酸含量差異不顯著（P＜0.05）。

圖1 Cd2＋脅迫下草坪草脯氨酸含量Fig.1 Effect of Cd2＋ on proline content of turfgrass

2.2 Cd2＋脅迫對(duì)草坪草MDA含量的影響

Cd2＋各濃度處理下，4種草坪草 MDA含量隨著離子濃度的升高而不斷增加（圖2），均與對(duì)照差異顯著（圖2）。其中，高羊茅和草地早熟禾 MDA含量在Cd2＋各濃度處理之間差異顯著（P＜0.05）；多年生黑麥草在Cd2＋濃度為1 mg／kg，50 mg／kg時(shí)其 MDA含量差異不顯著，在100，150 mg／kg時(shí)其 MDA含量差異顯著；白三葉 MDA含量在Cd2＋濃度為0，1，50，100 mg／kg時(shí)差異顯著，但是100和150 mg／kg處理下其MDA含量差異不顯著（P＜0.05）。

圖2 Cd2＋脅迫下草坪草MDA含量Fig.2 Effect of Cd2＋ on MDA content of turfgrass

2.3 Cd2＋脅迫對(duì)草坪草抗氧化酶活性的影響

隨Cd2＋濃度增加，草地早熟禾SOD活性均與對(duì)照差異顯著（P＜0.05），且有隨著離子濃度的升高有逐漸升高的趨勢(shì)；Cd2＋處理多年生黑麥草、高羊茅和白三葉，低濃度時(shí)其SOD活性變化不大，與對(duì)照差異不顯著，但隨著Cd2＋離子濃度的升高，SOD活性上升，在Cd2＋濃度為150 mg／kg時(shí)，供試草坪草SOD活性達(dá)到最大值（表1）。

表1 Cd2＋脅迫下草坪草SOD的活性Table 1 Effect of Cd2＋on SOD activity of 4 turfgrasses

Cd2＋脅迫對(duì)草坪草POD活性會(huì)產(chǎn)生不同程度的影響（表2）。其中，Cd2＋處理下高羊茅和草地早熟禾POD活性急劇上升，在低濃度處理下顯著高于對(duì)照，而且隨著離子濃度的升高而逐漸升高；Cd2＋濃度為1 mg／kg時(shí)，多年生黑麥草和白三葉POD活性與對(duì)照差異不顯著，稍有升高，當(dāng)Cd2＋達(dá)到50 mg／kg及更高時(shí)，2種草坪草POD活性急劇升高，顯著高于對(duì)照，且隨著離子濃度的升高而不斷升高。

表2 Cd2＋脅迫下草坪草POD活性Table 2 Effect of Cd2＋on POD activity of 4 turfgrasses

3 討論與結(jié)論

脯氨酸是植物蛋白的組成之一，一方面作為細(xì)胞內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，起著調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透平衡、增強(qiáng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和組織氧自由基產(chǎn)生的重要作用［8］；另一方面由于脯氨酸具有偶極性，其疏水端與蛋白質(zhì)聯(lián)結(jié)，而親水端與水分子相結(jié)合，從而使蛋白質(zhì)束縛更多的水，防止在滲透脅迫條件下蛋白質(zhì)脫水，增強(qiáng)了細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性［9，10］。研究表明，在逆境條件下，植物為了防御傷害，維持正常的生理生化功能，體內(nèi)必然相應(yīng)地產(chǎn)生一系列物質(zhì)代謝變化，游離脯氨酸含量的大量積累就是這些變化之一［8，11］。從試驗(yàn)結(jié)果可以看出，不同濃度Cd2＋處理對(duì)4種草坪草都產(chǎn)生了一定程度的脅迫。其中，高羊茅和草地早熟禾脯氨酸含量在不同濃度Cd2＋脅迫下差異顯著，多年生黑麥草在Cd2＋濃度為0，50，100 mg／kg處理時(shí)脯氨酸含量差異顯著，但是在Cd2＋濃度為100和150 mg／kg處理下脯氨酸含量差異不顯著，說明Cd2＋脅迫對(duì)多年生黑麥草有一定影響，但是當(dāng)Cd2＋濃度達(dá)到較高水平時(shí)多年生黑麥草脯氨酸含量差異不顯著；白三葉在Cd2＋濃度為0，1，50 mg／kg脯氨酸含量差異顯著，在50，100，150 mg／kg處理差異不顯著，可能是白三葉對(duì)Cd2＋較高濃度脅迫反應(yīng)不敏感，對(duì)Cd2＋有較強(qiáng)耐受性，也可能情況剛好相反，Cd2＋較低濃度處理就已經(jīng)達(dá)到白三葉能夠耐受的最大范圍，從而導(dǎo)致不能正常分泌脯氨酸。

細(xì)胞膜是植物細(xì)胞的保護(hù)組織，各種逆境脅迫對(duì)細(xì)胞的危害首先作用于細(xì)胞膜［12］。重金屬是細(xì)胞脂質(zhì)過氧化的誘導(dǎo)劑，當(dāng)重金屬處理植物時(shí)，細(xì)胞內(nèi)自由基產(chǎn)生和消除之間的平衡受到破壞，導(dǎo)致大量活性氧自由基產(chǎn)生，進(jìn)而引發(fā)膜中不飽和脂肪酸產(chǎn)生過氧化反應(yīng)，破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能［13，14］。不飽和脂肪酸所發(fā)生的一系列活性氧反應(yīng)的產(chǎn)物丙二醛（MDA）成為反應(yīng)細(xì)胞膜損傷程度的重要指標(biāo)［8，15］。在重金屬離子脅迫下，細(xì)胞膜受到傷害，胞內(nèi)離子和有機(jī)物大量外滲，外界有毒物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞，最終導(dǎo)致植物體內(nèi)一系列生理生化過程失調(diào)［13］。大量研究證明，重金屬離子濃度越高，丙二醛累積越多［16－20］。

結(jié)果表明，Cd2＋對(duì)4種草坪草細(xì)胞膜影響較大，草坪草MDA含量隨著離子濃度的升高而不斷增加，且與對(duì)照差異顯著；其中，高羊茅和草地早熟禾MDA含量在Cd2＋各濃度處理之間差異顯著；多年生黑麥草在Cd2＋濃度為1，50 mg／kg時(shí)其MDA含量差異不顯著，在50，100和150 mg／kg時(shí)其 MDA含量差異顯著，說明多年生黑麥草細(xì)胞膜對(duì)一定濃度的Cd2＋脅迫有相應(yīng)的耐受性，但是隨著離子濃度的升高，對(duì)細(xì)胞膜的脅迫影響越大；白三葉MDA含量在Cd2＋濃度為0，1，50，100 mg／kg時(shí)差異顯著，但100和150 mg／kg處理下其MDA含量差異不顯著，這是在這一濃度處理下，對(duì)白三葉細(xì)胞膜的影響已經(jīng)超出了植物所能耐受的最大范圍，細(xì)胞正常生理代謝受到影響，植物已喪失了基本的代謝功能，也可能是草坪草細(xì)胞逐漸適應(yīng)了高濃度重金屬離子處理，誘導(dǎo)了植物體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)酶類活性增加或抗氧化物質(zhì)積累，從而促進(jìn)了植物清除超氧離子自由基的能力，從而在重金屬離子高濃度處理下其MDA含量不再繼續(xù)升高。

SOD是一種重要的活性氧防御酶，在消除超氧物自由基、減輕脂質(zhì)過氧化作用和膜傷害方面起著重要作用［21］。POD是植物體內(nèi)清除活性氧傷害的酶保護(hù)系統(tǒng)，清除超氧自由基，控制膜脂的過氧化作用，保護(hù)細(xì)胞膜的正常代謝［22］。SOD和POD酶活性的變化與植物體內(nèi)氧化脅迫有關(guān)系［23，24］。

Cd2＋對(duì)草地早熟禾抗氧化酶活性影響均較大；Cd2＋處理對(duì)多年生黑麥草、高羊茅和白三葉抗氧化酶系統(tǒng)表現(xiàn)出低濃度影響較小，高濃度影響較大的趨勢(shì)，出現(xiàn)這種情況的原因可能是Cd2＋在低濃度時(shí)產(chǎn)生輕微刺激作用，在低濃度時(shí)對(duì)草坪草的正常生理代謝功能影響不大，但是當(dāng)濃度達(dá)到一定程度后，反而會(huì)對(duì)植物機(jī)體造成一定程度的傷害，從而造成抗氧化酶活性的升高來對(duì)抗脅迫反應(yīng)。

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