人胰腺癌吉西他濱耐藥細胞株的建立及其耐藥機制初步探討

人胰腺癌吉西他濱耐藥細胞株的建立及其耐藥機制初步探討

聶佳佳*熊光蘇吳叔明#

上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院消化內(nèi)科上海市消化疾病研究所(200001)

*Email: 351727335@qq.com

背景：吉西他濱是胰腺癌的一線化療藥物，但由于存在原發(fā)性和獲得性耐藥，其改善胰腺癌患者預后的作用并不明顯。因此，探討吉西他濱獲得性耐藥機制具有重要臨床意義。目的：建立人胰腺癌吉西他濱耐藥細胞株，初步探討胰腺癌對吉西他濱的耐藥機制。方法：在體外以0.5 μmol/L吉西他濱持續(xù)刺激人胰腺癌細胞株SW1990，獲得耐藥細胞株SW1990-0.5。以CCK-8實驗檢測SW1990-0.5細胞株的耐藥指數(shù)，細胞群體倍增實驗和劃痕實驗分別檢測親本和耐藥細胞株在體外的生長和侵襲能力，流式細胞術(shù)檢測細胞周期和細胞凋亡，real-time PCR檢測多藥耐藥相關(guān)基因MDR-1、MRP-1、BRCP和吉西他濱代謝相關(guān)酶基因dCK、RRM1、RRM2表達。結(jié)果：SW1990-0.5細胞株的耐藥指數(shù)為9.32。與親本細胞株相比，耐藥細胞株體外增殖能力減弱，體外侵襲能力無明顯變化；經(jīng)吉西他濱作用后，耐藥細胞株細胞周期無明顯變化，但細胞凋亡率顯著降低，MRP-1、BRCP、dCK mRNA表達降低，MDR-1、RRM1、RRM2 mRNA表達無明顯變化。結(jié)論：成功建立了穩(wěn)定的人胰腺癌吉西他濱耐藥細胞株SW1990-0.5；胰腺癌對吉西他濱獲得性耐藥可能與拮抗細胞凋亡和dCK表達下調(diào)有關(guān)。

關(guān)鍵詞胰腺腫瘤；吉西他濱；抗藥性，腫瘤；細胞凋亡

胰腺癌是最難治療且預后最差的惡性腫瘤之一，5年生存率不到4%[1]，其主要危險因素包括飲酒、吸煙、肥胖、糖尿病等[2]。由于早期癥狀不是很明顯，胰腺癌發(fā)現(xiàn)時多已為中晚期，大部分患者已不能接受外科手術(shù)切除治療，因此對于中晚期胰腺癌患者，化療為其主要治療手段。吉西他濱(gemci-tabine，2’-2’二氟脫氧胞嘧啶核苷)是1997年由美國食品藥品管理局(FDA)批準用于治療胰腺癌的一線化療藥物，然而由于胰腺癌對吉西他濱的原發(fā)性以及獲得性耐藥明顯，使用吉西他濱治療的胰腺癌患者生存率并無明顯改善[3-5]。本研究旨在建立人胰腺癌吉西他濱耐藥細胞株，通過了解其體外生長特性、生物學行為以及多藥耐藥相關(guān)基因和吉西他濱代謝相關(guān)酶基因表達，初步探討胰腺癌對吉西他濱的耐藥機制。

材料與方法

一、細胞株和主要試劑

人胰腺癌細胞株SW1990由上海市消化疾病研究所保存。胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限 公司)，DMEM培養(yǎng)基、0.25%胰酶(Gibco?, Thermo Fisher Scientific Inc.)，注射用鹽酸吉西他濱(美國禮來制藥)，CCK-8試劑盒(日本同仁化學研究所)，Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡雙染試劑盒(BD Biosciences)，總RNA 提取試劑RNAiso Plus、PrimeScriptTMRT試劑盒(Perfect Real Time)、SYBR?Premix Ex Taq(Perfect Real Time)(TAKARA BioInc.)。

二、實驗方法

1. 細胞培養(yǎng)和人胰腺癌吉西他濱耐藥細胞株的建立：將SW1990細胞置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，于37 ℃、5% CO2孵育箱中培養(yǎng)，細胞密度達到80%~90%時予以傳代，2~3 d傳代一次。取對數(shù)生長期細胞，PBS洗2次，0.25%胰酶消化，調(diào)整密度為5×104/mL，以1 mL/孔接種于6孔板，24 h后細胞密度達到30%~40%時，加入不同濃度(0、0.1、0.3、0.5、0.8、1.0 μmol/L)吉西他濱，其后每2~3 d加藥1次。1周后，含0.5 μmol/L吉西他濱的培養(yǎng)基中大部分細胞死亡，胰酶消化小部分存活細胞并移入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，持續(xù)加藥2個月，所得細胞命名為SW1990-0.5，停藥1周后進行后續(xù)實驗。后續(xù)實驗步驟均重復3次，實驗結(jié)果取均值。

2. CCK-8實驗：取對數(shù)生長期SW1990和SW1990-0.5細胞，胰酶消化，制成單細胞懸液，調(diào)整密度為3×104/mL，以100 μL/孔接種于96孔板，24 h 后更換為含不同濃度(0、0.1、1.0、10、100、1 000 μmol/L)吉西他濱的完全培養(yǎng)基，每組設6個復孔，每2 d換液1次，96 h后更換為含10% CCK-8試劑的培養(yǎng)基100 μL，培養(yǎng)1.5 h，于酶標儀450 nm處讀取吸光度(A)值。細胞存活率=(加藥組A值-空白對照A值)/(對照組A值-空白組對照A值)×100%，分別繪制2株細胞的劑量-存活率曲線，計算50%抑制濃度(IC50)。SW1990-0.5細胞耐藥指數(shù)RI=IC50(SW1990-0.5)/IC50(SW1990)。

3. 細胞群體倍增實驗：取對數(shù)生長期SW1990和SW1990-0.5細胞，胰酶消化，制成單細胞懸液，調(diào)整密度為1×104/mL，以1 mL/孔接種于24孔板，置于37 ℃、5% CO2孵育箱中培養(yǎng)。連續(xù)9 d隔天取3個復孔計數(shù)活細胞并計算均值，以培養(yǎng)時間為橫軸、活細胞數(shù)為縱軸繪制細胞生長曲線，計算細胞群體培增時間[T=t×ln2/(lnNt-lnN0)×24，t：培養(yǎng)時間(h)，Nt：培養(yǎng)最后1 d活細胞數(shù)，N0：培養(yǎng)第1 d活細胞數(shù)]。

4. 劃痕實驗：用記號筆在6孔板背后以直尺均勻畫橫線，每一孔畫5條線，橫穿過孔，橫線間距 0.5~1 cm。取對數(shù)生長期SW1990和SW1990-0.5 細胞，胰 酶消化，制成單細胞懸液，調(diào)整密度為5×105/mL，以1 mL/孔接種于6孔板，24 h后細胞長滿100%。用黃槍頭以直尺盡量垂直于背后橫線劃痕，槍頭須垂直，不能傾斜。PBS洗3次，去除劃下的細胞，加入含吉西他濱(20 μmol/L)的無血清培養(yǎng)基，0 h取樣拍照，置于孵育箱中培養(yǎng)，24 h后取樣拍照，計算0 h劃痕寬度與24 h劃痕寬度的差值。

5. 流式細胞術(shù)檢測細胞周期：取對數(shù)生長期SW1990和SW1990-0.5細胞各1瓶，胰酶消化，鋪于培養(yǎng)皿，每組3個復孔。24 h后細胞密度達到40%~50%時，更換為含吉西他濱(20 μmol/L)的完全培養(yǎng)基，48 h后收集細胞，1 500×g4 ℃離心5 min，PBS洗1次，1 500×g4 ℃離心5 min，置于75%冰乙醇中-20 ℃固定24 h，2 000×g4 ℃離心5 min，PBS洗1次，1 500×g4 ℃離心5 min，棄上清液，加入RNA酶(10 mg/mL)10 μL，37 ℃孵育30 min，加入PI(250 μg/mL)，室溫避光孵育10~15 min，終體積300 μL，上流式細胞儀檢測。

6. 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡：取對數(shù)生長期SW1990和SW1990-0.5細胞各1瓶，胰酶消化，鋪于培養(yǎng)皿，設置加藥組和不加藥對照組，每組3個復孔。24 h后細胞密度達到40%~50%時，加藥組更換為含吉西他濱(20 μmol/L)的完全培養(yǎng)基，對照組換液，72 h后收集細胞，按試劑盒說明書操作，簡要步驟為：2 000×g4 ℃離心 5 min，結(jié)合緩沖液洗1次，2 000×g4 ℃離心 5 min，加入Annexin V-FITC 10 μL，室溫避光孵育20 min，加入PI 5 μL，終體積300 μL，上流式細胞儀檢測。

7. Real-time PCR：細胞培養(yǎng)和處理同細胞周期檢測。提取細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以之為模板行PCR擴增，檢測多藥耐藥相關(guān)基因MDR-1、MRP-1、BRCP mRNA和吉西他濱代謝相關(guān)酶基因脫氧胞苷激酶(dCK)、核苷酸還原酶(RR)M1、RRM2 mRNA表達。PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列和擴增片段長度見表1。PCR反應條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。以2-ΔΔCt法計算目的基因mRNA相對表達量，ΔΔCt=實驗組(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)-對照組(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)，實驗組和對照組分別為SW1990-0.5和SW1990細胞。

三、統(tǒng)計學分析

結(jié)果

一、SW1990-0.5細胞耐藥指數(shù)

SW1990和SW1990-0.5細胞的劑量-存活率曲線見圖1，吉西他濱對親本和耐藥細胞株的IC50分別為 0.94 μmol/L 和8.76 μmol/L，SW1990-0.5細胞的耐藥指數(shù)為9.32。

二、細胞群體倍增實驗

SW1990和SW1990-0.5細胞的生長曲線見圖2，兩株細胞群體倍增時間分別為(40.31±0.54) h和(45.94±0.51) h (t=-13.26,P<0.05)，表明與親本細胞株相比，耐藥細胞株體外增殖能力明顯減弱。

三、劃痕實驗

SW1990和SW1990-0.5細胞0 h與24 h時的劃痕寬度差值分別為(387.62±30.79) μm和(451.77±33.96) μm，耐藥細胞株雖大于親本細胞株，但差異無統(tǒng)計學意義(t=2.43,P>0.05)，表明與親本細胞株相比，耐藥細胞株的體外侵襲能力無明顯變化。

四、細胞周期分布

經(jīng)吉西他濱(20 μmol/L)作用48 h，SW1990和SW1990-0.5細胞的G0/G1期比率分別為(66.42±0.05)%和(61.27±0.02)%(t=1.76,P=0.15)，S期比率分別為(18.26±0.10)%和(19.65±0.07)%(t=-0.20,P=0.85)，G2/M期比率分別為(15.33±0.05)%和(19.09±0.05)%(t=-0.90,P=0.42)，表明與親本細胞株相比，耐藥細胞株經(jīng)吉西他濱作用后細胞周期無明顯變化。

五、細胞凋亡情況

經(jīng)吉西他濱(20 μmol/L)作用72 h，SW1990和SW1990-0.5細胞的凋亡率分別(20.50±3.66)%和(12.30±1.50)%(t=0.02,P<0.05)，表明與親本細胞株相比，耐藥細胞株可拮抗由吉西他濱誘導的細胞凋亡(圖3)。

表1　Real-time PCR引物序列和擴增片段長度

圖1　SW1990和SW1990-0.5細胞劑量-存活率曲線

圖2　SW1990和SW1990-0.5細胞生長曲線

圖3吉西他濱處理72 h后SW1990和SW1990-0.5細胞凋亡流式細胞圖

六、多藥耐藥相關(guān)基因和吉西他濱代謝相關(guān)酶基因表達

經(jīng)吉西他濱作用48 h，相對于SW1990細胞，SW1990-0.5細胞多藥耐藥相關(guān)基因MDR-1、MRP-1、BRCP mRNA相對表達量分別為0.72±0.30(P>0.05)、0.60±0.19(P<0.05)和0.37±0.01(P<0.05)，吉西他濱代謝相關(guān)酶基因dCK、RRM1、RRM2 mRNA相對表達量分別為0.50±0.07(P<0.05)、1.04±0.12(P>0.05)和1.30±0.66(P>0.05)。與親本細胞株相比，耐藥細胞株經(jīng)吉西他濱處理后，MRP-1、BRCP、dCK mRNA表達顯著降低，MDR-1、RRM1、RRM2 mRNA表達無明顯變化。

討論

胰腺癌是一種惡性程度較高的消化系統(tǒng)腫瘤，化療為其主要治療手段。吉西他濱是胰腺癌的主要化療藥物，但由于存在原發(fā)性和獲得性耐藥，其改善胰腺癌患者預后的作用并不明顯。因此，探討吉西他濱獲得性耐藥機制具有重要臨床意義。人胰腺癌細胞株SW1990起源于胰腺癌轉(zhuǎn)移至脾臟的細胞，常用于建立胰腺癌耐藥細胞株[6-8]。建立胰腺癌耐藥細胞株的方法主要包括間歇濃度遞增法和持續(xù)誘導法，本研究采用持續(xù)誘導法建立人胰腺癌吉西他濱耐藥細胞株，對上述問題進行了初步探討。

國內(nèi)外研究表明吉西他濱耐藥可能與多藥耐藥相關(guān)基因表達改變有關(guān)，如MDR-1表達上調(diào)，與吉西他濱代謝酶dCK表達下調(diào)、RR表達上調(diào)等亦存在一定關(guān)聯(lián)[9-13]，但胰腺癌對吉西他濱的主要耐藥機制仍不清楚。本研究篩選出的針對0.5 μmol/L濃度吉西他濱的人胰腺癌耐藥細胞株SW1990-0.5，耐藥指數(shù)并不是很高(9.32)，體外侵襲能力與親本細胞株無明顯差異，僅體外增殖能力明顯減弱。與親本細胞株相比，耐藥細胞株對吉西他濱誘導的細胞凋亡的拮抗能力增強，MRP-1、BRCP、dCK mRNA表達下調(diào)，提示胰腺癌對吉西他濱獲得性耐藥可能與拮抗細胞凋亡和dCK表達下調(diào)有關(guān)。迄今為止，眾多研究均未明確吉西他濱耐藥與MRP-1、BRCP表達間的關(guān)系，MDR-1、RR表達在本研究建立的耐藥細胞株中則未見明顯變化，與既往研究結(jié)果不符，因此胰腺癌對吉西他濱的獲得性耐藥機制尚需深入探討。本研究建立的穩(wěn)定人胰腺癌吉西他濱耐藥細胞株，為進一步的耐藥機制研究提供了有利的工具。

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(2015-02-10收稿；2015-02-14修回)

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書訊：《實用臨床肝病學》(第2版)發(fā)行征訂

由池肇春教授主編的《實用臨床肝病學》(第2版)現(xiàn)已由人民軍醫(yī)出版社出版發(fā)行。該書為第2版，由全國20多個醫(yī)療單位、醫(yī)學院校和肝病研究院(中心)的知名專家教授集體執(zhí)筆撰寫，在第1版的基礎(chǔ)上作了大量的去舊添新，內(nèi)容新穎實用，文字流暢，在保持第1版一流水平的基礎(chǔ)上呈現(xiàn)出新的面貌和活力。全書分上、下兩卷，共80萬字，上卷為總論，共17章，介紹了肝病診治基礎(chǔ)、現(xiàn)狀和進展，下卷為各論，共16章，分別介紹了各種肝病的病因、發(fā)病機制、鑒別診斷、治療和預防，可供消化科、感染科、腫瘤科、影像科等相關(guān)學科醫(yī)師學習參考。欲了解當代肝病的診治、進展和現(xiàn)狀，請閱讀本書。每冊定價19元，全國新華書店發(fā)行，也可直接從人民軍醫(yī)出版社發(fā)行部郵購，聯(lián)系電話：13810020390，網(wǎng)址http://www.pmmp.com.cn/bookshop/where_buy.htm

Establishment of Gemcitabine-resistant Human Pancreatic Cancer Cell Subclone and Preliminary Exploration of the Resistance MechanismNIEJiajia,XIONGGuangsu,WUShuming.DepartmentofGastroenterologyandHepatology,RenJiHospital,SchoolofMedicine,ShanghaiJiaoTongUniversity;ShanghaiInstituteofDigestiveDisease,Shanghai(200001)

Correspondence to: WU Shuming, Email: wushuming@vip.sina.com

Background: Gemcitabine is the first-line drug for chemotherapy of pancreatic cancer. However, owing to the inherent and acquired resistance, gemcitabine does not change obviously the prognosis of patients with pancreatic cancer. Exploration of the mechanism of acquired resistance to gemcitabine is of great clinical importance. Aims: To establish a gemcitabine-resistant human pancreatic cancer cell subclone and to explore preliminarily the resistance mechanism. Methods: Human pancreatic cancer cell line SW1990 was stimulated continuously with 0.5 μmol/L gemcitabineinvitroto establish the gemcitabine-resistant subclone SW1990-0.5. The resistance index of SW1990-0.5 cells was counted by CCK-8 assay. Proliferation and invasion of SW1990 and SW1990-0.5 cells were detected by cell doubling time assay and scratch wound healing assayinvitro; cell cycle and cell apoptosis were detected by flow cytometry; expressions of multidrug-resistance related genes (MDR-1, MRP-1, and BRCP) and gemcitabine metabolic enzyme related genes (dCK, RRM1, and RRM2) were determined by real-time PCR. Results: The resistance index of SW1990-0.5 cells was 9.32. Compared with the parental SW1990 cells, the proliferation capacity but not the invasion capacity of SW1990-0.5 cellsinvitrowas reduced. When treated with gemcitabine, the cell cycle of SW1990-0.5 cells was similar to that of parental cells, whereas the cell apoptosis was significantly inhibited; expressions of MRP-1, BRCP and dCK mRNA were down-regulated, while expressions of MDR-1, RRM1 and RRM2 mRNA did not change. Conclusions: A stable gemcitabine-resistant human pancreatic cancer cell subclone SW1990-0.5 was successfully established. Inhibition of cell apoptosis and down-regulation of dCK expression might contribute to the acquired resistance to gemcitabine of pancreatic cancer.

Key wordsPancreatic Neoplasms;Gemcitabine;Drug Resistance, Neoplasm;Apoptosis

通信作者#本文，Email: wushuming@vip.sina.com

DOI:10.3969/j.issn.1008-7125.2015.06.004