Faecalibacterium prausnitzii治療大鼠TNBS結(jié)腸炎的機制研究*

Faecalibacteriumprausnitzii治療大鼠TNBS結(jié)腸炎的機制研究*

湯愛榮1#曹萍2張濤1于成功1,3&

南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院消化科1(210008)

南京醫(yī)科大學(xué)鼓樓臨床醫(yī)學(xué)院消化科2南京鼓樓醫(yī)院集團儀征醫(yī)院消化科3

*基金項目：國家自然科學(xué)基金面上項目(81170359, 81470819)

#Email: tangairongno1@163.com

背景：NLRP3炎癥小體在炎癥性腸病中的作用受到廣泛關(guān)注。Faecalibacteriumprausnitzii(Fp)是一種具有抗炎作用的共生菌，研究顯示其對大鼠結(jié)腸炎具有防治作用。目的：探討Fp治療大鼠實驗性結(jié)腸炎的可能機制。方法：50只大鼠隨機分為對照組(n=10)和模型組(n=40)，模型組以5% TNBS和無水乙醇灌腸誘導(dǎo)結(jié)腸炎，造模24 h 后隨機分為PBS組、介質(zhì)組、Fp活菌組和Fp上清組，每天予相應(yīng)成分1 mL灌胃，連續(xù)7 d。第8天處死動物，評估結(jié)腸炎癥程度，以蛋白質(zhì)印跡法和real-time PCR檢測NLRP3炎癥小體組分NLRP3、ASC、caspase-1表達；分別以real-time PCR和ELISA法檢測結(jié)腸和血漿NLRP3炎癥小體下游效應(yīng)分子IL-1β、IL-18水平。結(jié)果：模型組大鼠存在不同程度的體質(zhì)量減輕、結(jié)腸縮短和結(jié)腸炎癥損傷，F(xiàn)p活菌組和Fp上清組上述表現(xiàn)較PBS組和介質(zhì)組明顯減輕。PBS組和介質(zhì)組結(jié)腸組織NLRP3、ASC、caspase-1蛋白和mRNA表達顯著高于對照組(P<0.05)，結(jié)腸和血漿IL-1β水平增高(P<0.05)，IL-18水平降低(P<0.05)。Fp活菌組和Fp上清組IL-18水平較PBS組和介質(zhì)組進一步降低(P<0.05)，其余參數(shù)增高趨勢均明顯改善(P<0.05)。結(jié)論：NLRP3炎癥小體參與介導(dǎo)TNBS大鼠結(jié)腸炎發(fā)生，而Fp可通過抑制NLRP3炎癥小體及其下游效應(yīng)分子而減輕結(jié)腸炎癥。

關(guān)鍵詞結(jié)腸炎；NLRP3炎癥小體；Faecalibacterium prausnitzii；白細胞介素1β；白細胞介素18

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease, IBD)的病因和發(fā)病機制復(fù)雜，目前主要觀點認為IBD是由腸道菌群與黏膜免疫之間失衡，導(dǎo)致腸道炎癥過度激活所致[1]。炎癥小體(inflammasomes)是由多種蛋白組成的功能復(fù)合物，參與多種遺傳性疾病和自身免疫性疾病的發(fā)生、發(fā)展[2]，目前研究最為深入的是由NLRP3(NACHT, LRR and PYD domains-containing protein 3)、銜接蛋白ASC和pro-caspase-1組成的NLRP3炎癥小體，NLRP3通過與ASC相互作用，激活炎癥小體中的caspase-1而發(fā)揮功能。關(guān)于NLRP3炎癥小體在IBD中的作用，目前觀點不一。Zaki等[3]的研究通過敲除小鼠NLRP3、ASC、caspase-1基因表達，證實NLRP3炎癥小體及其下游效應(yīng)分子白細胞介素-1β(IL-1β)、IL-18對葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎具有保護作用，其中起關(guān)鍵作用的是表達于結(jié)腸上皮細胞的NLRP3炎癥小體。而Bauer等[4]卻發(fā)現(xiàn)NLRP3炎癥小體可增加小鼠對DSS結(jié)腸炎的易感性。因此，其確切作用有待進一步研究。

Faecalibacteriumprausnitzii(F.prausnitzii, Fp)是從克羅恩病(CD)患者腸道菌群中鑒定得到的一種具有抗炎作用的共生菌[5]，前期研究顯示Fp活菌及其培養(yǎng)上清液對三硝基苯磺酸(TNBS)誘導(dǎo)的大鼠結(jié)腸炎具有防治作用，且上清液的作用優(yōu)于活菌[6]。本研究旨在探討NLRP3炎癥小體在結(jié)腸炎發(fā)生、發(fā)展中的作用，以及Fp活菌及其上清液治療大鼠實驗性結(jié)腸炎的可能機制。

材料與方法

一、實驗動物、菌株和主要試劑

SPF級雄性6~8周齡Sprague-Dawley大鼠50只，體質(zhì)量160~200 g，由南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院實驗動物中心提供，飼養(yǎng)于二級動物房。Fp(ATCC 27766，美國模式菌種保藏中心)，TNBS(Sigma-Aldrich Co.)，兔抗大鼠NLRP3抗體(Novus Biologicals, Inc)，兔抗大鼠ASC抗體、小鼠抗大鼠caspase-1抗體(Santa Cruz Biotechnology, Inc.)，TRIzol?試劑(Thermo Fisher Scientific Inc.)， PrimeScriptTM逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Perfect Real Time)、SYBR?Premix Ex Taq Ⅱ(Perfect Real Time)(TAKARA BIO INC.)，大鼠IL-1β、IL-18 ELISA試劑盒(Abnova Corporation.)。

二、方法

1. 細菌培養(yǎng)和灌胃液制備：將Fp活菌凍干粉解凍，于厭氧箱中將混懸液接種至LYHBHI培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)。取生長至對數(shù)期末的菌液離心，將上清液凍干，每100 mL上清液可制成3.7 g凍干粉，-80 ℃保存?zhèn)溆?。使用時取3.7 g凍干粉加去離子水20 mL溶解，離心后PBS重懸2次，以PBS調(diào)整濃度至1×109CFU/mL，作為灌胃液。

2. 動物模型制備：50只大鼠隨機分為對照組(n=10)和模型組(n=40)。動物禁食、不禁水24 h，模型組以5% TNBS 100 mg/kg和無水乙醇(體積比1∶1)灌腸誘導(dǎo)結(jié)腸炎[7]，對照組予等體積0.9% NaCl溶液灌腸。造模24 h后，將模型組隨機分為模型對照組(PBS組)、培養(yǎng)基治療組(介質(zhì)組)、Fp活菌治療組(Fp活菌組)和Fp上清液治療組(Fp上清組)，每組10只，每天予相應(yīng)成分1 mL灌胃，對照組予PBS灌胃，連續(xù)7 d。實驗過程中每天記錄大鼠體質(zhì)量、糞便性狀、便血情況、精神狀態(tài)和活動、進食情況。第8天以氯胺酮和地西泮麻醉大鼠，腹主動脈取血后處死，取回盲部至肛門口段全結(jié)腸，測量長度后沿縱軸剪開，擦凈糞便，取炎癥明顯部位用于組織學(xué)評分，其余部分-80 ℃保存待測。

3. 糞便性狀評分：參照Wirtz等[8]采用的評分標(biāo)準(zhǔn)：糞便成形計0分；半成形但未黏附肛門計1分；半成形但黏附肛門計2分；稀便且黏附肛門計3分。

4. 結(jié)腸炎癥大體評分：參照Butzner等[9]采用的評分標(biāo)準(zhǔn)：無損傷計0分；局部充血、無潰瘍計1分；1處潰瘍，不伴充血或腸壁增厚計2分；1處潰瘍伴有炎癥計3分；≥2處潰瘍伴有炎癥計4分；有一處損傷范圍≥1 cm計5分；損傷范圍≥2 cm，每增加1 cm評分增加1分(6~10分)。黏連評分：不黏連周圍組織計0分；少量黏連、可以分離計1分；大面積黏連計2分?？偡譃閮身椩u分之和。

5. 結(jié)腸炎癥組織學(xué)評分：參照Dashdorj等[10]采用的評分標(biāo)準(zhǔn)。炎癥細胞浸潤評分：固有層未見炎癥細胞數(shù)量增加計0分；固有層炎癥細胞數(shù)量增加計1分；炎癥細胞浸潤黏膜下層計2分；炎癥細胞浸潤全層計3分。組織損傷程度評分：黏膜未見損傷計0分；散在淋巴上皮損傷計1分；黏膜糜爛計2分；廣泛黏膜損壞或腸壁全層損壞計3分?？偡譃閮身椩u分之和。

6. 蛋白質(zhì)印跡法：取凍存結(jié)腸組織約100 mg，RIPA裂解液提取總蛋白，BSA法測定蛋白濃度。取總蛋白上樣，行SDS-PAGE電泳，濕法轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉，加入NLRP3、ASC或caspase-1抗體孵育16 h，洗滌后加入抗兔或抗小鼠二抗孵育2 h，洗滌后曝光，ImageJ軟件分析條帶灰度值，目的蛋白相對表達量以其條帶灰度值與內(nèi)參條帶灰度值的比值表示。

7. Real-time PCR：TRIzol?試劑抽提結(jié)腸組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以之為模板行real-time PCR。NLRP3引物：F 5’-GCT AAG AAG GAC CAG CCA GA-3’, R 5’-CCA GCA AAC CTA TCC ACT CC-3’；ASC引物：F 5’-TTG CTG GAT GCT CTG TAT GG-3’, R 5’-CCA AGT AGG GCT GTG TTT GC-3’；caspase-1引物：F 5’-TGA AAG ACA AGC CCA AGG TT-3’, R 5’-GGT GTT GAA GAG CAG AAA GCA -3’；IL-1β引物：F 5’-GCC AAC AAG TGG TAT TCT CCA-3’, R 5’-TGC CGT CTT TCA TCA CAC AG-3’；IL-18引物：F 5’-ATA TCG ACC GAA CAG CCA AC-3’, R 5’-CAT CCT TCC ATC CTT CAC AGA-3’；內(nèi)參β-actin引物：F 5’-TGT CAC CAA CTG GGA CGA TA-3’, R 5’- GGG GTG TTG AAG GTC TCA AA -3’。PCR反應(yīng)體系：cDNA 2 μL、SYBR?Premix Ex Taq Ⅱ 10 μL、上下游引物各0.4 μL、ROX Reference Dye Ⅱ 0.4 μL和去離子水6.8 μL，共20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)。2-△△Ct法計算目的基因mRNA相對表達量。

8. 血漿IL-1β、IL-18水平測定：參照相應(yīng)大鼠IL-1β、IL-18 ELISA試劑盒說明書進行操作。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié)果

一、一般情況

造模24 h后，對照組大鼠未見明顯異常，模型組大鼠出現(xiàn)血便、稀水樣便，精神狀態(tài)差，活動、進食減少，體質(zhì)量減輕。第4天起，F(xiàn)p活菌組和Fp上清組大鼠體質(zhì)量較PBS組和介質(zhì)組明顯增加，精神狀態(tài)好轉(zhuǎn)，活動、進食增加，糞便性狀逐漸轉(zhuǎn)為糊狀、不成形便，上清組體質(zhì)量改善優(yōu)于活菌組(P<0.05)(表1)。

二、結(jié)腸長度

四組模型組大鼠結(jié)腸長度均較對照組顯著縮短(P<0.05)，F(xiàn)p活菌組和Fp上清組縮短程度較PBS組和介質(zhì)組明顯改善(P<0.05)(圖1A)。

三、結(jié)腸炎癥大體和組織學(xué)評分

四組模型組大鼠結(jié)腸肉眼可見不同程度的充血、糜爛或潰瘍形成，且與周圍組織有不同程度的黏連，光學(xué)顯微鏡下炎癥細胞浸潤和組織損傷明顯，F(xiàn)p活菌組和Fp上清組上述表現(xiàn)較PBS組和介質(zhì)組明顯減輕(P<0.05)(圖1B、1C)。

表1　各組大鼠體質(zhì)量變化和糞便性狀評分比較(±s)

表1　各組大鼠體質(zhì)量變化和糞便性狀評分比較(±s)

組別例數(shù)體質(zhì)量變化(kg)糞便性狀評分第1天第2天第3天第4天第5天第6天第7天對照組1061.30±16.02*0.30±0.48*0.10±0.32*0.20±0.42*0.00±0.00*0.10±0.32*0.00±0.00*0.00±0.00*PBS組1021.40±3.863.00±0.003.00±0.002.00±0.001.70±0.823.00±0.002.00±0.001.40±0.84介質(zhì)組1021.60±4.253.00±0.003.00±0.002.80±0.421.90±0.321.80±0.421.60±0.701.70±0.82Fp活菌組1037.20±8.95*#3.00±0.002.90±0.322.10±0.570.90±0.99*0.20±0.42*0.50±0.97*0.30±0.48*Fp上清組1053.00±10.15*3.00±0.002.80±0.421.80±0.63△0.70±0.95*0.50±0.71*0.20±0.42*0.20±0.42*

體質(zhì)量變化=最后1 d體質(zhì)量-初期體質(zhì)量

*與PBS組和介質(zhì)組比較，P<0.05；△與介質(zhì)組比較，P<0.05；#與Fp上清組比較，P<0.05

四、結(jié)腸組織NLRP3、ASC、caspase-1蛋白表達

PBS組和介質(zhì)組結(jié)腸組織中的NLRP3、ASC、caspase-1蛋白相對表達量顯著高于對照組(P<0.05)，F(xiàn)p活菌組和Fp上清組此種增高趨勢明顯改善(P<0.05)(圖2)。

五、結(jié)腸組織NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β、IL-18 mRNA表達

PBS組和介質(zhì)組結(jié)腸組織中的NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β mRNA相對表達量顯著高于對照組(P<0.05)，F(xiàn)p活菌組和Fp上清組此種增高趨勢明顯改善(P<0.05)，上清組IL-1β表達降低更為明顯(P<0.05)；PBS組和介質(zhì)組IL-18 mRNA相對表達量顯著低于對照組(P<0.05)，F(xiàn)p活菌組和Fp上清組較PBS組和介質(zhì)組進一步降低(P<0.05)(圖3)。

六、血漿IL-1β、IL-18水平

各組血漿IL-1β、IL-18水平與結(jié)腸組織中的IL-1β、IL-18 mRNA表達水平基本一致。PBS組和介質(zhì)組IL-1β水平顯著高于對照組(P<0.05)，F(xiàn)p活菌組和Fp上清組此種增高趨勢明顯改善(P<0.05)；PBS組和介質(zhì)組IL-18水平顯著低于對照組(P<0.05)，F(xiàn)p活菌組和Fp上清組較PBS組和介質(zhì)組進一步降低，但組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(表2)。

*與PBS組和介質(zhì)組比較，P<0.05；ns：P>0.05

圖1各組大鼠結(jié)腸長度(A)以及結(jié)腸炎癥大體(B)和組織學(xué)(C)評分

*與PBS組和介質(zhì)組比較，P<0.05；ns：P>0.05

*與PBS組和介質(zhì)組比較，P<0.05；#Fp活菌組與Fp上清組比較，P<0.05；ns：P>0.05

組別例數(shù)IL-1βIL-18對照組10318.0±57.2*46.93±24.91*PBS組101612.0±1063.017.05±12.62介質(zhì)組101436.0±1080.017.05±8.48Fp活菌組10552.7±106.4*10.85±5.94Fp上清組10376.7±92.67*9.05±3.00

*與PBS組和介質(zhì)組比較，P<0.05

討論

近年來，隨著IBD發(fā)病率的不斷增高，其病因和發(fā)病機制的研究逐漸深入，并發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)/Th17失衡在IBD的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。在免疫學(xué)發(fā)病機制方面，NLRP3炎癥小體在IBD中的作用受到廣泛關(guān)注，其作為炎癥調(diào)節(jié)的中心，通過激活pro-caspase-1成為caspase-1，繼而促進下游效應(yīng)分子IL-1β、IL-18成熟和分泌，發(fā)揮炎癥調(diào)節(jié)作用[11]。目前觀點認為NLRP3炎癥小體在IBD中的作用具有兩面性，原因在于其下游效應(yīng)分子的功能。IL-1β的主要功能是促進炎癥細胞分化并向炎癥部位聚集，同時促進炎癥因子分泌而參與機體防御。研究顯示IL-1β參與了結(jié)腸炎時腸上皮細胞的修復(fù)和上皮屏障的重建，IL-1β-/-小鼠對DSS結(jié)腸炎的易感性增加[12]，而IBD患者的腸上皮細胞和黏膜固有層IL-1β表達又明顯高于對照者[13]。pro-IL-1β只有在受到相關(guān)刺激后才能產(chǎn)生并活化[14]，表明IL-1β水平穩(wěn)定在結(jié)腸穩(wěn)態(tài)中起關(guān)鍵作用。另一NLRP3炎癥小體效應(yīng)分子IL-18又稱干擾素-γ誘導(dǎo)因子(IGIF)，可由Kupffer細胞、單核細胞、樹突細胞、巨噬細胞、腸上皮細胞等多種細胞分泌，能與其他因子協(xié)同調(diào)節(jié)T細胞分化，促進細胞因子分泌，激活NF-κB、MAPK等多種炎癥調(diào)節(jié)通路，發(fā)揮炎癥調(diào)節(jié)作用。正常生物體內(nèi)存在完善的IL-18自身調(diào)節(jié)系統(tǒng)[15]，IL-18過度激活或抑制與炎癥性和自身免疫性疾病的發(fā)生密切相關(guān)[16]。關(guān)于IL-18在腸道病變中的作用，有研究顯示IL-18-/-或NLRP3炎癥小體組分缺失致IL-18表達下調(diào)的小鼠對DSS結(jié)腸炎的易感性增加，結(jié)腸炎癥重于野生型小鼠，死亡率高[3，17]；然而另有研究發(fā)現(xiàn)IBD患者結(jié)腸炎癥組織IL-18表達上調(diào)，提示其參與了炎癥的啟動和維持[18]。體內(nèi)IL-1β和IL-18均以非活性前體形式存在，需經(jīng)轉(zhuǎn)化酶或caspase-1裂解才能轉(zhuǎn)化為活性形式，但正常人和大鼠體內(nèi)存在IL-18儲備，能促進腸上皮細胞再生，維持腸黏膜屏障的完整性，此種具有保護功能的IL-18主要由腸上皮細胞內(nèi)的NLRP3炎癥小體產(chǎn)生[14]。

本實驗中TNBS結(jié)腸炎模型大鼠結(jié)腸組織中的NLRP3炎癥小體組分NLRP3、ASC、caspase-1蛋白和mRNA表達水平均顯著高于對照組，結(jié)腸組織IL-1β mRNA表達和血漿IL-1β水平同步升高，與之前報道的結(jié)腸炎組織NLRP3炎癥小體水平升高相一致[19]，因此可以認為NLRP3炎癥小體參與介導(dǎo)了結(jié)腸炎的形成。然而，本實驗發(fā)現(xiàn)結(jié)腸炎模型大鼠結(jié)腸組織IL-18 mRNA表達和血漿IL-18水平均低于對照組，與Zaki等[3]發(fā)現(xiàn)的DSS小鼠結(jié)腸炎模型結(jié)腸組織和血漿IL-18水平升高不符。在結(jié)腸炎動物模型中，IL-1β水平與疾病活動度和病情進展密切相關(guān)[13]；上皮源性IL-18在結(jié)腸炎早期階段起保護作用，而固有層單核細胞源性IL-18則與慢性結(jié)腸炎癥有關(guān)，IL-18拮抗劑可緩解結(jié)腸炎癥[20]。Lopetuso等[21]的研究顯示，非活動性CD患者結(jié)腸上皮中IL-18呈高表達，隨著疾病的進展，其表達逐漸降低，但該研究并未在潰瘍性結(jié)腸炎患者中觀察到類似現(xiàn)象，由此推測IL-18在結(jié)腸炎中的作用和表達水平在某種程度上取決于疾病階段及其嚴重程度。綜上推斷，本實驗中結(jié)腸炎模型大鼠結(jié)腸組織和血漿IL-18水平降低可能是由于模型動物疾病處于早期和活動期，腸上皮細胞大量損傷，故腸上皮細胞源性IL-18產(chǎn)生極少，血源性IL-18則可能尚未完全啟動，最終導(dǎo)致結(jié)腸 組織和血漿IL-18低于正常水平。因此，關(guān)于NLRP3炎癥小體及其下游效應(yīng)分子在IBD中的具體作用機制，尚待進一步研究。

Fp已被證實是一種具有抗炎作用的共生菌，對大鼠結(jié)腸炎具有防治作用[5-6]，前期研究發(fā)現(xiàn)Fp活菌及其上清液能通過抑制炎癥因子IL-17、IL-23等以及調(diào)節(jié)Treg/Th17比例緩解TNBS誘導(dǎo)的大鼠結(jié)腸炎，且上清液的作用優(yōu)于活菌，可能與上清液中含有以丁酸鹽為主的細菌產(chǎn)物有關(guān)。上述結(jié)果表明Fp活菌及其上清液能通過調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)發(fā)揮抗炎作用。本實驗中Fp活菌組和Fp上清組大鼠體質(zhì)量變化、糞便性狀、結(jié)腸長度以及結(jié)腸炎癥大體和組織學(xué)評分均較PBS組和介質(zhì)組明顯改善，證實Fp活菌及其上清液能緩解大鼠結(jié)腸炎癥，在改善體質(zhì)量方面，上清液的作用優(yōu)于活菌。此外，F(xiàn)p活菌及其上清液處理還能明顯抑制結(jié)腸炎模型大鼠結(jié)腸 組織中的NLRP3炎癥小體組分NLRP3、ASC、caspase-1表達上調(diào)，同時降低結(jié)腸組織和血漿中的IL-1β、IL-18水平，其中上清液降低結(jié)腸組織IL-1β水平的作用優(yōu)于活菌，表明Fp活菌及其上清液可能通過抑制NLRP3炎癥小體及其下游效應(yīng)分子緩解TNBS誘導(dǎo)的大鼠結(jié)腸炎。

綜上所述，NLRP3炎癥小體作為固有免疫的調(diào)節(jié)平臺，參與介導(dǎo)TNBS大鼠結(jié)腸炎發(fā)生，而Fp活菌及其上清液可通過抑制NLRP3炎癥小體形成及其下游效應(yīng)分子的激活而減輕結(jié)腸炎癥。抑制NLRP3炎癥小體激活有望成為IBD新的治療靶點，而Fp則可能成為IBD治療領(lǐng)域的新成員。關(guān)于Fp作用于炎癥小體的具體機制，仍有待進一步研究。

參考文獻

1 Ahmed J, Reddy BS, M?lbak L, et al. Impact of probiotics on colonic microflora in patients with colitis: a prospective double blind randomised crossover study[J]. Int J Surg, 2013, 11 (10): 1131-1136.

2 Shaw PJ, McDermott MF, Kanneganti TD. Inflammasomes and autoimmunity[J]. Trends Mol Med, 2011, 17 (2): 57-64.

3 Zaki MH, Boyd KL, Vogel P, et al. The NLRP3 inflammasome protects against loss of epithelial integrity and mortality during experimental colitis[J]. Immunity, 2010, 32 (3): 379-391.

4 Bauer C, Duewell P, Mayer C, et al. Colitis induced in mice with dextran sulfate sodium (DSS) is mediated by the NLRP3 inflammasome[J]. Gut, 2010, 59 (9): 1192-1199.

5 Sokol H, Pigneur B, Watterlot L, et al.Faecalibacteriumprausnitziiis an anti-inflammatory commensal bacterium identified by gut microbiota analysis of Crohn disease patients[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2008, 105 (43): 16731-16736.

6 Qiu X, Zhang M, Yang X, et al.Faecalibacteriumprausnitziiupregulates regulatory T cells and anti-inflammatory cytokines in treating TNBS-induced colitis[J]. J Crohns Colitis, 2013, 7 (11): e558-e568.

7 Foligné B, Nutten S, Steidler L, et al. Recommendations for improved use of the murine TNBS-induced colitis model in evaluating anti-inflammatory properties of lactic acid bacteria: technical and microbiological aspects[J]. Dig Dis Sci, 2006, 51 (2): 390-400.

8 Wirtz S, Neufert C, Weigmann B, et al. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation[J]. Nat Protoc, 2007, 2 (3): 541-546.

9 Butzner JD, Parmar R, Bell CJ, et al. Butyrate enema therapy stimulates mucosal repair in experimental colitis in the rat[J]. Gut, 1996, 38 (4): 568-573.

10Dashdorj A, Jyothi KR, Lim S, et al. Mitochondria-targeted antioxidant MitoQ ameliorates experimental mouse colitis by suppressing NLRP3 inflammasome-mediated inflammatory cytokines[J]. BMC Med, 2013, 11: 178.

11Zaki MH, Lamkanfi M, Kanneganti TD. The Nlrp3 inflammasome: contributions to intestinal homeostasis[J]. Trends Immunol, 2011, 32 (4): 171-179.

12Bersudsky M, Luski L, Fishman D, et al. Non-redundant properties of IL-1α and IL-1β during acute colon inflammation in mice[J]. Gut, 2014, 63 (4): 598-609.

13Aguilera M, Darby T, Melgar S. The complex role of inflammasomes in the pathogenesis of Inflammatory Bowel Diseases - lessons learned from experimental models[J]. Cytokine Growth Factor Rev, 2014, 25 (6): 715-730.

14Jin C, Flavell RA. Molecular mechanism of NLRP3 inflammasome activation[J]. J Clin Immunol, 2010, 30 (5): 628-631.

15Monteleone G, Trapasso F, Parrello T, et al. Bioactive IL-18 expression is up-regulated in Crohn’s disease[J]. J Immunol, 1999, 163 (1): 143-147.

16Sedimbi SK, H?ggl?f T, Karlsson MC. IL-18 in inflammatory and autoimmune disease[J]. Cell Mol Life Sci, 2013, 70 (24): 4795-4808.

17Takagi H, Kanai T, Okazawa A, et al. Contrasting action of IL-12 and IL-18 in the development of dextran sodium sulphate colitis in mice[J]. Scand J Gastroenterol, 2003, 38 (8): 837-844.

18Lochner M, F?rster I. Anti-interleukin-18 therapy in murine models of inflammatory bowel disease[J]. Pathobiology, 2002-2003, 70 (3): 164-169.

19Villani AC, Lemire M, Fortin G, et al. Common variants in the NLRP3 region contribute to Crohn’s disease susceptibility[J]. Nat Genet, 2009, 41 (1): 71-76.

20Bamias G, Corridoni D, Pizarro TT, et al. New insights into the dichotomous role of innate cytokines in gut homeostasis and inflammation[J]. Cytokine, 2012, 59 (3): 451-459.

21Lopetuso LR, Chowdhry S, Pizarro TT. Opposing functions of classic and novel il-1 family members in gut health and disease[J]. Front Immunol, 2013, 4: 181.

(2015-02-12收稿；2015-03-09修回)

Mechanism ofFaecalibacteriumprausnitziiin Treating TNBS-induced Colitis in RatsTANGAirong1,CAOPing2,ZHANGTao1,YUChenggong1,3.1DepartmentofGastroenterology,theAffiliatedDrumTowerHospitalofNanjingUniversityMedicalSchool,Nanjing(210008);2DepartmentofGastroenterology,theDrumTowerClinicalMedicalCollegeofNanjingMedicalUniversity,Nanjing;3DepartmentofGastroenterology,YizhengHospital,DrumTowerHospitalGroupofNanjing,Nanjing

Correspondence to: YU Chenggong, Email: chenggong_yu@nju.edu.cn

Background: NLRP3 inflammasome attracts widespread attention in study of inflammatory bowel disease.Faecalibacteriumprausnitzii(Fp) is an anti-inflammatory commensal bacterium that has preventive and therapeutic effects on rat colitis. Aims: To explore the underlying mechanism of Fp in treating experimental colitis in rats. Methods: Fifty rats were randomly divided into two groups, 10 in control group and 40 in model group. Rats in model group were administered intrarectally with 5% TNBS and dehydrated alcohol to induce experimental colitis. Twenty-four hours afterwards, the model rats were further divided into four groups and administered intragastrically with PBS, culture medium, live Fp and Fp supernatant 1 mL per day, respectively, for 7 days. On day 8, all the rats were sacrificed for evaluation of colonic inflammation. Expressions of the constituents of NLRP3 inflammasome (NLRP3, ASC, and caspase-1) were assessed by Western blotting and real-time PCR; levels of IL-1β and IL-18, the downstream effectors of NLRP3 inflammasome, in colon and plasma were measured by real-time PCR and ELISA, respectively. Results: Weight loss, reduced colon length and colonic inflammatory injury were observed in model rats. These manifestations were ameliorated in live Fp and Fp supernatant groups than those in PBS and culture medium groups. In PBS and culture medium groups, expressions of NLRP3, ASC, and caspase-1 protein and mRNA in colonic tissue were significantly higher than those in control group (P<0.05), the colonic and plasma levels of IL-1β were increased (P<0.05), and IL-18 levels were decreased (P<0.05). In live Fp and Fp supernatant groups, IL-18 level showed a further reduction as compared with PBS and culture medium groups (P<0.05), but the increasing trend for other parameters was reduced (P<0.05). Conclusions: NLRP3 inflammasome participates in the development of TNBS-induced colitis in rats. Fp might alleviate colonic inflammation by inhibiting NLRP3 inflammasome and its downstream effectors.

Key wordsColitis;NLRP3 Inflammasome;Faecalibacterium prausnitzii;Interleukin-1beta;Interleukin-18

通信作者&本文，Email: chenggongyu@nju.edu.cn

DOI:10.3969/j.issn.1008-7125.2015.06.003