miRNA與結(jié)核分枝桿菌感染的研究進(jìn)展

楊 靜 綜述，董 劍審校

(重慶市大足區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 402360)

·綜述·

miRNA與結(jié)核分枝桿菌感染的研究進(jìn)展

楊 靜 綜述，董 劍△審校

(重慶市大足區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 402360)

microRNA；結(jié)核分枝桿菌；結(jié)核病

microRNA(miRNA)是一類長度為19～22個(gè)核苷酸、在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)基因的表達(dá)起調(diào)控作用的單鏈非編碼RNA[1]。1993年起，Lee等[2]和Reinhart等[3]先后在秀麗隱桿線蟲中發(fā)現(xiàn)lin-4和let-7可以負(fù)向調(diào)控靶基因的表達(dá)，迄今，已有24 000多個(gè)miRNA被收錄并注釋，而且數(shù)量逐年遞增。研究表明，miRNA在細(xì)胞死亡與增殖、癌癥發(fā)生與發(fā)展和疾病轉(zhuǎn)歸中發(fā)揮著重要的作用。盡管現(xiàn)代醫(yī)學(xué)和診斷技術(shù)不斷進(jìn)步，結(jié)核病仍然是一個(gè)重大的挑戰(zhàn)。據(jù)世界衛(wèi)生組織(world health organization,WHO)最新統(tǒng)計(jì)，目前，全球結(jié)核感染者約占總?cè)丝诘?/3，每年有800多萬人發(fā)展為活動(dòng)性結(jié)核病，并有140多萬人死于該病。雖然結(jié)核分枝桿菌和宿主環(huán)境之間的相互作用已廣泛研究，但對(duì)相關(guān)RNA的了解仍然非常有限。闡明miRNA在結(jié)核分枝桿菌感染中扮演的角色，有助于更透徹地了解結(jié)核病的發(fā)生、發(fā)展，為制訂有效的控制策略提供新思路。

1 miRNA基因結(jié)構(gòu)、生物合成和基本功能

pri-miRNA在多種酶的剪切作用下生成具有生物活性的、長度約22個(gè)核苷酸的成熟miRNA。大多數(shù)miRNA基因位于基因間隔區(qū)，與靶基因相距大于1 kb，被稱為基因間miRNA，少部分被稱為內(nèi)含子miRNA的miRNA位于內(nèi)含子區(qū)域、蛋白編碼區(qū)或非編碼區(qū)[4]。基因間miRNA由RNA聚合酶Ⅱ或Ⅲ在獨(dú)立的啟動(dòng)子和調(diào)節(jié)子作用下轉(zhuǎn)錄而來，約50%的基因間miRNA緊鄰其他miRNA，形成miRNA集群[5]。內(nèi)含子miRNA可能與宿主基因的表達(dá)和剪接體剪切過程相關(guān)[6]?；蜷gmiRNA的轉(zhuǎn)錄由獨(dú)立的啟動(dòng)子啟動(dòng)編碼，生成幾kb長具有帽結(jié)構(gòu)和polyA尾的pri-miRNA，而內(nèi)含子miRNA的轉(zhuǎn)錄由宿主基因啟動(dòng)子控制，且必須從mRNA中被剪切出來并加工為成熟的miRNA[7]。

RNA聚合酶Ⅱ/Ⅲ在細(xì)胞核內(nèi)聚合游離堿基形成大于1 kb的pri-miRNA，pri-miRNA被RNase Ⅲ Drosha和雙鏈RNA結(jié)合蛋白Pasha剪切成約70個(gè)核苷酸組成的呈不完全莖環(huán)結(jié)構(gòu)的pre-miRNA[8]。pre-miRNA經(jīng)Ras相關(guān)核蛋白和exportin5輸送到細(xì)胞質(zhì)中后[9]，被Dicer剪切成約22個(gè)核苷酸長度的miRNA雙鏈。解旋酶打開miRNA雙鏈，其中，一條單鏈很快整合到miRISC復(fù)合體中，降解mRNA、阻遏翻譯或使mRNA脫腺苷酸化。

在植物、動(dòng)物和多種真核生物以及DNA病毒中均發(fā)現(xiàn)miRNA可以負(fù)向調(diào)控靶基因的表達(dá)。在植物和秀麗隱桿線蟲中觀察到的轉(zhuǎn)錄后抑制現(xiàn)象說明這種抑制并不是完全阻斷翻譯，而是miRNA對(duì)蛋白的合成進(jìn)行微調(diào)[10-11]。盡管假說推測(cè)miRNA整合到miRISC復(fù)合體中后，通過與靶mRNA的3′-UTR區(qū)互補(bǔ)結(jié)合而阻遏翻譯或使靶mRNA降解，從而干擾基因的表達(dá)[12]。但是，miRNA介導(dǎo)的調(diào)控并不需要miRNA全長與目標(biāo)結(jié)合區(qū)域完全匹配，只需要5′端的2～8位核苷酸稱為“種子區(qū)域”的堿基序列與mRNA完全配對(duì)即可。因此，一個(gè)miRNA可能影響多種蛋白質(zhì)的合成，多個(gè)miRNA也可能會(huì)同時(shí)靶向一個(gè)mRNA而達(dá)到增強(qiáng)翻譯抑制的效果。

2 miRNA與結(jié)核分枝桿菌感染

結(jié)核病發(fā)生、發(fā)展確切的分子機(jī)制尚未完全清楚，這是控制結(jié)核病的主要難點(diǎn)之一。結(jié)核分枝桿菌生長緩慢等特性，使其難以診治，且多耐藥和泛耐藥結(jié)核分枝桿菌的出現(xiàn)給世界范圍內(nèi)衛(wèi)生安全帶來極大的威脅。一般情況下，宿主基因復(fù)雜的調(diào)控對(duì)疾病的發(fā)展至關(guān)重要，因此，深入了解miRNA調(diào)控真核基因表達(dá)的功能將為疾病的診斷及治療提供新思路。

存在于組織、血清和血漿以及其他體液中的miRNA能有效抵抗內(nèi)源性RNase的分解而以穩(wěn)定形式存在。Fu等[13]首次把循環(huán)miRNA作為研究對(duì)象，采用miRNA芯片揭示了miRNA與活動(dòng)性肺結(jié)核的相關(guān)性。該研究表明，與正常人相比，肺結(jié)核患者血清中有92個(gè)miRNA變化顯著，其中，59個(gè)miRNA表達(dá)下調(diào)，33個(gè)miRNA表達(dá)上調(diào)；當(dāng)用qRT-PCR驗(yàn)證時(shí)，miR-29a和miR-93*表達(dá)上調(diào)不僅存在于血清中，痰液標(biāo)本中二者表達(dá)也增多。隨后的研究中，活動(dòng)性肺結(jié)核患者的痰液上清中差異表達(dá)的miRNA也被篩選出。與健康人相比，結(jié)核病患者痰液中發(fā)現(xiàn)95個(gè)差異表達(dá)的miRNA，其中miR-3179和miR-147過表達(dá)，miR-19b-2*表達(dá)受到抑制。因此，有望把循環(huán)miRNA作為疾病診斷的生物標(biāo)志物和治療的靶標(biāo)。

在卡介苗感染的小鼠巨噬細(xì)胞中，miR-21表達(dá)顯著上調(diào)，miR-142-3p表達(dá)顯著下調(diào)，miR-203在24 h內(nèi)表達(dá)下調(diào)，24 h后表達(dá)上調(diào)，說明這些miRNA可能通過調(diào)控免疫相關(guān)基因在巨噬細(xì)胞抗結(jié)核分枝桿菌的免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要的作用[14]。此外，結(jié)核分枝桿菌感染人巨噬細(xì)胞后，結(jié)核分枝桿菌脂質(zhì)及菌體可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞miR-125b表達(dá)上調(diào)和miR-155表達(dá)下調(diào)，伴隨TNF-α表達(dá)下降[15]。然而，恥垢分枝桿菌脂質(zhì)及菌體可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞miR-125b表達(dá)下調(diào)和miR-155表達(dá)上調(diào)，伴隨TNF-α表達(dá)增加。2種不同分枝桿菌引起TNF-α生物合成的差異，可以理解為miR-125b的靶標(biāo)為TNF-α的mRNA，而miR-155則通過延長TNF-α mRNA的半衰期，從而間接增強(qiáng)TNF-α的表達(dá)[16]。因此，結(jié)核分枝桿菌引起的miR-125b高表達(dá)，阻斷TNF-α的生物合成，使結(jié)核分枝桿菌顛覆宿主免疫，并增加其毒力。通過研究結(jié)核分枝桿菌感染后miRNA參與調(diào)控宿主細(xì)胞免疫反應(yīng)的機(jī)制，有利于結(jié)核病的早期診斷和治療。

近期研究發(fā)現(xiàn)[17]，在結(jié)核分枝桿菌感染的樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中，表達(dá)上調(diào)的miR-99b能夠抑制IL-6、IL-12和IL-1β等前炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，敲減樹突狀細(xì)胞中的miR-99b導(dǎo)致TNF-α及前炎性細(xì)胞因子表達(dá)增加，且結(jié)核分枝桿菌存活率降低。因此，研究并利用miR-99b作為結(jié)核病診斷的生物標(biāo)志物或治療手段具有重要意義。

顆粒溶素是迄今為止發(fā)現(xiàn)的能夠直接殺滅結(jié)核分枝桿菌的一種抗菌肽，已有研究證實(shí)顆粒溶素?zé)o論在細(xì)胞水平還是在小鼠體內(nèi)都表現(xiàn)出良好的抗結(jié)核分枝桿菌活性[18-19]。然而，結(jié)核病患者體內(nèi)顆粒溶素的表達(dá)卻顯著下降，成功治療后則持續(xù)回升[20-21]。表明在機(jī)體受到結(jié)核分枝桿菌感染后，某種機(jī)制抑制體內(nèi)顆粒溶素的表達(dá)，使其不能有效發(fā)揮滅菌作用。前期研究證實(shí)miR-218可以負(fù)向調(diào)控巨噬細(xì)胞中顆粒溶素的表達(dá)，且敲減miR-218能增加顆粒溶素的表達(dá)量，因此，進(jìn)一步研究miR-218對(duì)顆粒溶素的調(diào)控機(jī)制會(huì)為結(jié)核病的診斷和治療提供新思路[22]。

另有研究表明，在PPD刺激后的活動(dòng)性肺結(jié)核患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中檢測(cè)到高表達(dá)的miR-155和miR-155*[23]，且結(jié)核分枝桿菌特異性分泌抗原ESAT-6在miR-155的誘導(dǎo)和其后續(xù)影響中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，可以抑制Bach1和SHIP1的表達(dá)[24]。已知Bach1對(duì)血紅素加氧酶1(結(jié)核分枝桿菌休眠的活化劑)的轉(zhuǎn)錄起阻遏作用，而SHIP1抑制絲氨酸/蘇氨酸激酶AKT(結(jié)核分枝桿菌的存活所需)的激活。因此，miR-155對(duì)機(jī)體固有免疫和抗結(jié)核分枝桿菌感染的調(diào)節(jié)是至關(guān)重要的，關(guān)注miR-155及其在機(jī)體感染結(jié)核分枝桿菌后介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)能為結(jié)核病的診斷和治療提供新方向。

3 miRNA在診斷和治療中的作用

近幾年，研究者發(fā)現(xiàn)多種miRNA參與了結(jié)核病的發(fā)生、發(fā)展，考慮到結(jié)核病對(duì)全球公共衛(wèi)生造成的影響及其難以診治的問題，仍需進(jìn)一步研究以篩選出能高效診斷和治療結(jié)核病的miRNA。與健康對(duì)照組相比，結(jié)核病患者外周血單個(gè)核細(xì)胞[23]、血清[13]和痰液中均可檢測(cè)出表達(dá)水平發(fā)生改變的miRNA，在不同miRNA中，miR-29a、miR-155、miR-155*、miR-125b、miR-3179a和miR-147可能是結(jié)核病診斷的潛在生物標(biāo)志物。

如果miRNA可以作為結(jié)核病診斷的標(biāo)志物，那么，這些miRNA是結(jié)核病特有，還是與其他疾病共享，至少要考慮那些病理相似，但病因不同的疾病。最近一項(xiàng)研究將結(jié)核病患者全血miRNA與病理類似的結(jié)節(jié)病患者的全血miRNA表達(dá)譜進(jìn)行比較，結(jié)果表明患病個(gè)體與健康人的miRNA表達(dá)有顯著差異，但是結(jié)核病和結(jié)節(jié)病的miRNA表達(dá)譜高度相似[25]。因此，在尋找差異表達(dá)miRNA的同時(shí)，要著重篩選那些病理相似或密切相關(guān)病原體(如分枝桿菌屬)引起疾病的miRNA生物標(biāo)志物。

4 展望

miRNA是新興基礎(chǔ)生物學(xué)研究應(yīng)用于創(chuàng)新治療領(lǐng)域的一個(gè)代表者。機(jī)體感染結(jié)核分枝桿菌以后，miRNA表達(dá)的改變及其參與調(diào)節(jié)機(jī)體抗結(jié)核分枝桿菌感染的信號(hào)通路，為結(jié)核病的研究提供了新思路。近年來，關(guān)于miRNA的研究正如火如荼，發(fā)現(xiàn)更多相關(guān)miRNA并闡明其參與機(jī)體調(diào)控結(jié)核分枝桿菌感染的機(jī)制，更好地診斷和治療結(jié)核病帶來新希望。

[1]Bartel DP.MicroRNAs:genomics,biogenesis,mechanism,and function[J].Cell,2004,116(2):281-297.

[2]Lee RC,Feinbaum RL,Ambros V.The C.elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14[J].Cell,1993,75(5):843-854.

[3]Reinhart BJ,Slack FJ,Basson M,et al.The 21-nucleotide let-7 RNA regulates developmental timing in Caenorhabditis elegans[J].Nature,2000,403(6772):901-906.

[4]Kim VN,Nam JW.Genomics of microRNA[J].Trends Genet,2006,22(3):165-173.

[5]Lee Y,Jeon K,Lee JT,et al.MicroRNA maturation:stepwise processing and subcellular localization[J].EMBO J,2002,21(17):4663-4670.

[6]Lagos-Quintana M,Rauhut R,Lendeckel W,et al.Identification of novel genes coding for small expressed RNAs[J].Science,2001,294(5543):853-858.

[7]Lee Y,Kim M,Han J,et al.MicroRNA genes are transcribed by RNA polymerase Ⅱ[J].EMBO J,2004,23(20):4051-4060.

[8]Denli AM,Tops BB,Plasterk RH,et al.Processing of primary microRNAs by the Microprocessor complex[J].Nature,2004,432(7014):231-235.

[9]Bohnsack MT,Czaplinski K,Gorlich D.Exportin 5 is a RanGTP-dependent dsRNA-binding protein that mediates nuclear export of pre-miRNAs[J].RNA,2004,10(2):185-191.

[10]Grishok A,Sinskey JL,Sharp PA.Transcriptional silencing of a transgene by RNAi in the soma of C.elegans[J].Genes Dev,2005,19(6):683-696.

[11]Baulcombe D.RNA silencing in plants[J].Nature，2004,431(7006):356-363.

[12]O′Donnell KA,Wentzel EA,Zeller KI,et al.c-Myc-regulated microRNAs modulate E2F1 expression[J].Nature,2005,435(7043):839-843.

[13]Fu Y,Yi Z,Wu X,et al.Circulating microRNAs in patients with active pulmonary tuberculosis[J].J Clin Microbiol,2011,49(12):4246-4251.

[14]張兆波,魏軍,湯建中,等.BCG對(duì)小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞miR-203、miR-142-3p、miR-21表達(dá)的影響[J].中國免疫學(xué)雜志,2013，29(2):125-129.

[15]Rajaram MV,Ni B,Morris JD,et al.Mycobacterium tuberculosis lipomannan blocks TNF biosynthesis by regulating macrophage MAPK activated protein kinase 2 (MK2) and microRNA miR-125b[J].Proc Natl Acad Sci USA,2011,108(42):17408-17413.

[16]Tili E,Michaille JJ,Cimino A,et al.Modulation of miR-155 and miR-125b levels following lipopolysaccharide/TNF-alpha stimulation and their possible roles in regulating the response to endotoxin shock[J].J Immunol,2007,179(8):5082-5089.

[17]Singh Y,Kaul V,Mehra A,et al.Mycobacterium tuberculosis controls microRNA-99b(miR-99b)expression in infected murine dendritic cells to modulate host immunity[J].J Biol Chem,2013,288(7):5056-5061.

[18]Yang C,He YL,Zhang L,et al.GLS/IL-12-modified Mycobacterium smegmatis as a novel anti-tuberculosis immunotherapeutic vaccine[J].Int J Tuberc Lung Dis,2009,13(11):1360-1366.

[19]Yi Z,Yang C,Li J,et al.Recombinant M.smegmatis vaccine targeted delivering GLS/IL-12 into macrophags can induce specific cellular immunity against M.tuberculosis in BALB/c mice[J].Vaccine,2007,25(4):638-648.

[20]Di Liberto D,Buccheri S,Caccamo N,et al.Decreased serum granulysin levels in childhood tuberculosis which reverse after therapy[J].Tuberculosis,2007,87(4):322-328.

[21]Sahiratmadja E,Alisjahbana B,Buccheri S,et al.Plasma granulysin levels and cellular interferon-gamma production correlate with curative host responses in tuberculosis,while plasma interferon-gamma levelscorrelate with tuberculosis disease activity in adults[J].Tuberculosis(Edinb),2007,87(4):312-321.

[22]楊靜,楊春,何永林,等.GLS 3′-非編碼區(qū)-熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒的構(gòu)建及其活性鑒定[J].免疫學(xué)雜志,2013,29(1):33-37.

[23]Wu J,Lu C,Diao N,et al.Analysis of microRNA expression profiling identifies miR-155 and miR-155*as potential diagnostic markers for active tuberculosis:a preliminary study[J].Hum Immunol,2012,73(1):31-37.

[24]Kumar R,Halder P,Sahu SK,et al.Identification of a novel role of ESAT-6-dependent miR-155 induction during infection of macrophages with Mycobacterium tuberculosis[J].Cell Microbiol,2012,14(10):1620-1631.

[25]Maertzdorf J,Weiner J 3rd,Mollenkopf HJ,et al.Common patterns and disease related signatures in tuberculosis and sarcoidosis[J].Proc Natl Acad Sci USA,2012,109(20):7853-7858.

楊靜(1988-)，檢驗(yàn)師，碩士，主要從事結(jié)核感染與免疫的研究?！?/p>

,Tel:(023)43780101;E-mail:dongyjian@163.com。

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.08.044

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1671-8348(2015)08-1132-03

2014-10-19

2014-12-25)