隱孢子蟲病診斷和治療研究進(jìn)展

劉彩霞，趙繼學(xué)，尹繼剛

隱孢子蟲是細(xì)胞內(nèi)寄生原蟲，主要感染宿主小腸上皮細(xì)胞，可引起人獸共患隱孢子蟲病。該病主要在隱孢子蟲的卵囊階段通過糞-口途徑傳播，飲用受污染的水、食入不干凈的食物或是直接接觸感染的人或動物均能導(dǎo)致感染。

隱孢子蟲病的臨床癥狀常為霍亂樣腹瀉，免疫功能正常的宿主表現(xiàn)為腸胃不適、腹瀉、腹痛、體液大量丟失及發(fā)熱等，一般發(fā)病后7～14 d 可自愈。但是對于免疫功能低下的宿主，尤其是未斷奶的動物和營養(yǎng)不良的兒童，此病可能引起持續(xù)性腹瀉，甚至導(dǎo)致死亡。隱孢子蟲病的治療方法有限，目前尚無可用于預(yù)防的疫苗，發(fā)病率在世界范圍內(nèi)呈逐年上升態(tài)勢，大規(guī)模隱孢子蟲病的暴發(fā)也引起了公眾對該病的廣泛關(guān)注。本文對隱孢子蟲病的實驗室診斷以及治療研究進(jìn)展作一綜述。

1 實驗室診斷

及時準(zhǔn)確的診斷對于有效管理感染人群，制訂相關(guān)的預(yù)防措施尤為關(guān)鍵。根據(jù)所檢測樣本的不同，隱孢子蟲病的實驗室診斷方法包括直接檢測蟲體（或抗原/核酸）和間接檢測蟲體2 個方面。

1.1 直接檢測蟲體（或抗原/核酸）

1.1.1 檢測糞便中的隱孢子蟲卵囊 是最常規(guī)的一種檢測手段，常用方法有如下幾種。

1.1.1.1 抗酸染色法 該法是最常規(guī)的一種檢測方法。微小隱孢子蟲卵囊為圓形，大小為4～6 μm，內(nèi)含4 個子孢子，有一厚壁卵殼。通過抗酸染色很容易辨別。常用的染色方法有改良金胺酚抗酸染色法、萋-尼氏抗酸染色法及番紅染色法等。為了提高檢出率，鏡檢之前須要對糞便樣本進(jìn)行富集，在給出陰性結(jié)論之前至少要檢測3 份樣本。

抗酸染色法的特異度和靈敏度均低于直接免疫熒光法（direct immunofluorescence assay,DFA）、聚合酶鏈反應(yīng)法（polymerase chain reaction,PCR）和酶聯(lián)免疫吸附測定法（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）。該方法的優(yōu)點在于能夠檢測到當(dāng)前感染，而PCR 和ELISA 不能區(qū)分當(dāng)前感染和既往感染。該方法還能檢測到其他原蟲，如環(huán)孢子蟲和等孢球蟲等。缺點在于對人員的要求較高，而且需要必要的設(shè)備，如顯微鏡。

1.1.1.2 DFA 即隱孢子蟲卵囊與熒光標(biāo)記的單克隆抗體反應(yīng)后用熒光顯微鏡觀察。該方法與抗酸染色法相比，具有很高的靈敏度和特異度，被很多實驗室認(rèn)為是診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”。須要注意的是，糞便樣本在檢測前須經(jīng)過福爾馬林滅活和濃縮處理。檢測食物、水和環(huán)境樣本時，可能會與藻類發(fā)生交叉反應(yīng)，須要通過相差顯微鏡觀察卵囊內(nèi)容物和子孢子以及通過細(xì)胞核染料來加以確認(rèn)。該方法適用于暴發(fā)疫情監(jiān)測。該方法的缺點在于不能區(qū)分感染蟲種和基因型。Reboredo-Fernández 等[1]收集了32 份無脊椎動物樣本，用DFA 檢測到含有卵囊陽性率為12.5%。

1.1.2 檢測小腸液或腸組織活體組織標(biāo)本中的隱孢子蟲 過去由于抗酸染色法和抗原檢測方法不成熟而采用該法，現(xiàn)在已不常用。由于腸道寄生蟲感染的不均一性，通常會遇到假陰性的情況。

1.1.3 檢測糞便中的隱孢子蟲抗原

1.1.3.1 ELISA 該方法不須要在檢測前富集樣本，靈敏度高于抗酸染色法，自動化程度高，可在短時間內(nèi)對大量樣本進(jìn)行篩查。而且對操作人員的技術(shù)要求低。用該方法檢測，必須設(shè)立對照。

1.1.3.2 側(cè)流免疫層析法（immunochromatographic lateral flow,ICLF） ICLF 試紙條是由樣品墊結(jié)合物釋放墊、檢測線、對照線、硝酸纖維素膜和吸收墊組成。ICLF 是一種快速檢測方法，對實驗條件要求較低，操作步驟簡單，但是與其他免疫學(xué)檢測方法相比靈敏度較低。Chalmers 等[2]用熒光定量PCR 檢測259 份糞便樣本，確定了152 份陽性樣本，包括80份人隱孢子蟲（C.homnis）、68 份微小隱孢子蟲（C.parvum）、2 份貓隱孢子蟲（C.felis）、1 份泛在隱孢子蟲（C.ubiquitum）和1 份火雞隱孢子蟲（C.meleagridis）樣本，再用于測試其他檢測方法，其中ELISA 的靈敏度為91.4%，DFA 的靈敏度為92.1%，而免疫熒光顯微鏡法的靈敏度為97.4%，ICLF 靈敏度為84.9%。本法適合于對AIDS 患者、兒童和暴發(fā)流行疫情的檢測或監(jiān)測。通常ELISA 和ICLF 檢測隱孢子蟲時，也可以同時檢測其他相關(guān)病原（如賈第蟲和溶組織內(nèi)阿米巴）[3-4]。

1.1.4 分子生物學(xué)方法

1.1.4.1 PCR 該法若用于檢測糞便中的卵囊，糞便須儲存于重鉻酸鉀或凍存以檢測DNA。防腐劑能夠抑制PCR 反應(yīng)，因此必須洗去，但如果防腐劑進(jìn)入卵囊，將影響PCR 檢測。常用的靶基因有18S 核糖體DNA、卵囊璧蛋白基因和糖蛋白GP60 基因等。其中巢氏PCR 和熒光定量PCR 具有更高的靈敏度。熒光定量PCR 可以對樣品中的卵囊數(shù)定量，從而確定樣本對環(huán)境的污染程度[5]。PCR 不僅可以作為檢測病原體核酸的手段，還可以作為區(qū)分不同蟲種和同一蟲種內(nèi)不同基因型的工具，這在暴發(fā)疫情的傳染源追溯上具有重要意義。由于DNA 穩(wěn)定性好，以DNA 為模板建立的PCR 不能確定樣本中蟲體的活力和感染特性，而以RNA 為模板的反轉(zhuǎn)錄PCR（reverse transcription-PCR,RT-PCR）可以彌補這一缺點。

1.1.4.2 RT-PCR 由于RNA 在蟲體死后很快降解，因此RT-PCR 可以評價蟲體的活力和感染性。最常采用的靶基因是熱休克蛋白70 基因，在蟲體受到熱應(yīng)激時，該基因高效穩(wěn)定表達(dá)，這樣提高了檢測的靈敏度，還能準(zhǔn)確定量蟲體的活力和感染性。

1.1.4.3 環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification,LAMP） 該技術(shù)的靈敏度高于巢氏PCR。研究顯示在巢氏PCR 檢測為陰性的樣本中，有約1/3 的樣本為LAMP 陽性[6]。因此，該方法適用于檢測健康人或動物的低水平感染。

1.2 間接檢測蟲體

1.2.1 診斷方法 包括ELISA、蛋白質(zhì)印跡法（Western-blot）和多重微珠免疫法（multiplex microbead immunoassay,MIA）等。

1.2.1.1 ELISA 是最常用的方法，其操作簡便易行，適用于大規(guī)模流行病學(xué)監(jiān)測。Lee 等[7]從位于韓國4 個不同地區(qū)的醫(yī)院采集微小隱孢子蟲病患者血清，制備粗抗原用ELISA 對隱孢子蟲感染率進(jìn)行了調(diào)查。檢測的2394 份樣本中，特異性IgG、IgM 和IgA 抗體陽性率分別為34%、26%和56%。

1.2.1.2 Western-blot 是篩查和診斷隱孢子蟲病的有效方法，很多實驗室以該方法作為“金標(biāo)準(zhǔn)”。Al-Braikan 和Al-Rabia[8]收集了130 份成年人（18～30 歲）血清樣本，制備15～17 kDa 與27 kDa 隱孢子蟲抗原，用Western-blot 分析隱孢子蟲的感染情況。15 kDa 抗原陽性率為8.5%，27 kDa 抗原陽性率為23.8%，34.6%人血清樣本與2 種抗原都發(fā)生反應(yīng)。Shayan 等[9]收集437 份牛血清樣本，其中犢牛264份，牛173 份，用p23 基因擴增后連接pGEX-5X-2載體表達(dá)重組蛋白質(zhì)用于識別血清抗體，Westernblot 檢測結(jié)果顯示，2 組樣本感染微小隱孢子蟲血清陽性率分別為33%和37%。以上結(jié)果說明Western-blot 可用于隱孢子蟲病的檢測。該方法的缺點在于所需抗原和時間較多，不適合大規(guī)模的流行病學(xué)調(diào)查。

1.2.1.3 MIA 該法是近年來新開發(fā)的免疫學(xué)檢測技術(shù)，具有比ELISA 更高的靈敏度（因為抗原與微珠結(jié)合更容易被抗體捕獲），具有所需樣本體積小、省時省力和成本低的優(yōu)點，彌補了ELISA 的不足，而且容易準(zhǔn)確定量。Du 等[10]用重組蛋白Cp23、SA35和SA40 與微粒子偶聯(lián)，建立MIA 用于檢測隱孢子蟲特異性抗體，結(jié)果顯示此方法靈敏度較高，且發(fā)現(xiàn)兒童新近感染率高，而成人的既往感染率高。

1.2.2 診斷抗原 包括天然蟲體抗原和重組抗原。

1.2.2.1 天然蟲體抗原 隱孢子蟲全蟲抗原是血清學(xué)檢測方法中廣泛應(yīng)用的診斷抗原。Kaushik 等[11]純化隱孢子卵囊，超聲處理后反復(fù)凍融制備全蟲抗原，通過建立ELISA 比較感染隱孢子蟲的HIV 陽性和陰性患者血清中特異性IgG、IgM 和IgA 抗體與微小隱孢子蟲可溶性全蟲抗原的免疫反應(yīng)。結(jié)果顯示，全蟲抗原檢測特異性抗體IgG 的靈敏度比IgM 和IgA 抗體高，并且證明隱孢子蟲特異性抗體反應(yīng)可能與疾病的癥狀沒有必然聯(lián)系。Jenkins 等[12]用全蟲抗原與重組Cp41 抗原作對照，檢測人血清樣本，檢測結(jié)果一致。由于該抗原制備費時費力，不同批次之間不容易標(biāo)準(zhǔn)化，近年來多用重組表達(dá)的抗原代替天然蟲體抗原。

1.2.2.2 重組抗原

1.2.2.2.1 CP23 抗原（又稱P23、P27 或27 kDa 抗原） 該抗原是隱孢子蟲最主要的免疫識別抗原之一。CP23 是一種表面膜蛋白質(zhì)，最初被報道為一種單獨的抗原，后續(xù)的實驗發(fā)現(xiàn)它屬于一個分子量相近的蛋白質(zhì)家族，該家族共包含5 個分子量為23～27 kDa 的蛋白質(zhì)（包括CP23），這5 個抗原均能被單克隆抗體C6B6 所識別，意味著這5 個蛋白質(zhì)既擁有共同的蛋白質(zhì)骨架也有部分結(jié)構(gòu)的改變[13]。Perryman 等[14]也對P23 中的一段多肽進(jìn)行了序列分析，并推測該蛋白質(zhì)分子量約為11.2 kDa（GenBank登錄號為U34390）。但是，在Western-blot 分析中，該蛋白質(zhì)的條帶出現(xiàn)在23 kDa 位置，因此該蛋白質(zhì)被命名為CP23，分析原因可能是由于該蛋白的糖基化性質(zhì)造成了分子量上的差異。

重組CP23 作為診斷抗原得到了廣泛應(yīng)用。Priest 等[13]用重組的CP23 抗原建立的ELISA 與天然抗原檢測具有很好的相關(guān)性，證實該方法可用于流行病學(xué)監(jiān)測。Borad 等[15]表達(dá)純化CP23 重組蛋白質(zhì)將其作為抗原，使用ELISA 檢測孟加拉國5 歲以下感染隱孢子蟲腹瀉兒童血清中IgG、IgA 和IgM抗體，以未感染隱孢子蟲腹瀉組作對照，結(jié)果顯示試驗組血清中3 種抗體水平顯著高于對照組，并發(fā)現(xiàn)急性腹瀉兒童血清中IgA 和IgM 水平顯著高于遷延性腹瀉病例。該抗原作為診斷抗原的缺點是不能區(qū)分是否近期感染，因為即使患者癥狀恢復(fù)后相當(dāng)一段時間，抗體仍保持高水平。

1.2.2.2.2 CP15/17 抗原 該組抗原為子孢子表膜抗原，大小為15～17 kDa,溶于Triton-X 114。這些抗原與人類感染隱孢子蟲產(chǎn)生的IgG、IgA 和IgM 抗體反應(yīng)，識別15、17、27 kDa 抗原的單克隆抗體，也可以與隱孢子蟲的表面抗原發(fā)生特異性反應(yīng)，這些結(jié)果說明在隱孢子蟲的感染階段15、17、27 kDa 抗原是重要的抗體靶標(biāo)[16]。該蛋白質(zhì)通常與27 kDa 抗原共同用于隱孢子蟲病的檢測。Chalmers 等[17]用15、17、27 kDa 蛋白質(zhì)作為抗原，用Western-blot檢測人類感染隱孢子蟲陽性血清，每60 d 檢測1 次。結(jié)果顯示15/17 kDa 抗原復(fù)合物比27 kDa 抗原反應(yīng)強烈，但是181～240 d 后幾乎檢測不到抗體反應(yīng)；27 kDa 抗原反應(yīng)雖然較弱，但是在感染較長時間后仍能檢測到IgG 抗體反應(yīng)。Priest 等[18]純化了重組抗原rCp27/GST 與rCp17/GST 重組抗原并偶聯(lián)微粒子，用MIA 檢測了隱孢子蟲與賈第蟲感染率，結(jié)果約40%采集于隱孢子蟲暴發(fā)流行的血清樣品能夠被17 kDa 和27 kDa 抗原所識別，至少有60%采集于賈第蟲暴發(fā)流行的血清樣品能夠被多種賈第蟲抗原所識別。

1.2.2.2.3 CP41 抗原 該抗原位于卵囊壁，2005年Kjos 等[19]擴增CP41 基因，連接pTrcHis 載體后在大腸埃希菌表達(dá)了多聚組氨酸融合蛋白質(zhì)，與制備的微小隱孢子蟲全蟲抗原同時用ELISA 檢測了192名健康成年人血清，結(jié)果全蟲抗原與重組CP41 抗原檢測IgM 抗體一致率為79%，檢測IgG 抗體一致率為88%，回歸分析表明二者具有很高的相關(guān)性，表明CP41 重組蛋白質(zhì)可代替蟲體抗原應(yīng)用于隱孢子蟲感染的檢測。

1.2.2.2.4 SA35 與SA40 蛋白 Tosini 等[20]構(gòu)建了微小隱孢子蟲基因組文庫，用兔抗微小隱孢子蟲血清篩選得到3 個陽性克隆sa20、sa35 和sa40，其中sa35 和sa40 序列定位于第7 號染色體，而sa20 序列定位于第6 號染色體，其中sa40 與GP900 的同源性很高，而GP900 是強免疫原性的蛋白質(zhì)，推斷sa40 與sa35 在宿主體內(nèi)引起IgG 抗體應(yīng)答反應(yīng)。大腸埃希菌表達(dá)重組蛋白質(zhì)，Western-blot 檢測結(jié)果表明，sa35 和sa40 與兔抗隱孢子蟲血清和感染隱孢子蟲的人血清有特異性反應(yīng)。這些結(jié)果表明，sa35 和sa40 可能成為診斷隱孢子蟲病的檢測抗原。這2 種抗原能夠被新近感染者的血清所識別。

1.2.2.2.5 CpP2 Priest 等[21]確定了一個大小為15～17 kDa 的新蛋白質(zhì)——微小隱孢子蟲60S 酸性核糖體蛋白P2（CpP2），建立了重組蛋白質(zhì)CpP2-ELISA檢測人血清樣本，與Western-blot 相比，其靈敏度為89%，特異度為92%。

2 治 療

尋求針對隱孢子蟲病特別是AIDS 患者隱孢子蟲病令人滿意的治療方案，一直是眾多研究的目標(biāo)。過去嘗試采用的治療方案包括：大環(huán)內(nèi)酯類抗生素、氨基糖苷類如巴龍霉素、離子載體類如馬杜拉霉素、利福昔明、奧曲肽以及免疫治療方法[22]。盡管一些藥物被證實具有一些療效，主要是大環(huán)內(nèi)酯類的螺旋霉素和克拉霉素、氨基糖苷類的巴龍霉素、離子載體類藥物拉沙里菌素和馬杜拉霉素，但研究結(jié)果缺乏一致性，治療效果依賴于機體免疫功能的恢復(fù)。在不治療的情況下，大多數(shù)免疫功能正常的患者在2 周內(nèi)康復(fù)。對于免疫缺陷患者，治療的目的在于減輕癥狀和免疫系統(tǒng)重建。治療手段主要包括如下幾個方面。

2.1 抗蟲化學(xué)藥物治療

2.1.1 硝唑尼特 該藥已被美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)用于免疫功能正常的人群，它能夠影響隱孢子蟲的代謝過程。已證實該藥對感染隱孢子蟲的兒童腹瀉有效。一項來自贊比亞的研究發(fā)現(xiàn)，用藥前后腹瀉程度和糞便中的卵囊數(shù)差異明顯，但對其他患者延長療程是否有效有待證實[23]。另一項來自埃及的研究發(fā)現(xiàn)，該藥能夠降低1～11 歲兒童的腹瀉程度和卵囊排出量[24]。但對于AIDS 患者來說，該藥的療效不確切。

2.1.2 常山酮內(nèi)酯 該藥可用于犢牛隱孢子蟲病的預(yù)防，可以減輕癥狀，并降低對環(huán)境的污染。動物實驗表明，該藥可用于治療羔羊的隱孢子蟲病，能夠明顯降低卵囊排出量，減輕癥狀，降低致死率（治療劑量100 μg/kg）[25]。

2.1.3 阿奇霉素 可作為免疫缺陷患者的輔助治療藥物。

2.2 減少腸蠕動的藥物 這一類藥物能夠通過降低腸蠕動，促進(jìn)小腸吸收從而減輕腹瀉，包括洛哌丁胺及其衍生物。

2.3 電解質(zhì)補充 通過口服和靜脈補充電解質(zhì)溶液（含鈉、鉀和鈣離子等），可以補充體液的大量流失，保持體液的平衡。

2.4 對AIDS 患者抗病毒治療的協(xié)同作用 對于AIDS 患者，高效抗反轉(zhuǎn)錄病毒療法能夠降低體內(nèi)的病毒載量，激發(fā)機體免疫反應(yīng)。

2.5 蛋白酶抑制劑 半胱氨酸蛋白酶和絲氨酸蛋白酶已證實參與隱孢子蟲卵囊的脫囊過程，與蟲體的侵入相關(guān)[26]。體外模型和小鼠模型已證實蛋白酶抑制劑可以抑制蟲體的侵入和保護小鼠抵抗致死劑量蟲體的攻擊[27]，有望成為新型的抗蟲藥物。

3 展 望

目前，對隱孢子蟲感染的檢測和診斷面臨挑戰(zhàn)，將不同的診斷方法和不一致的分型技術(shù)應(yīng)用于臨床、獸醫(yī)和環(huán)境監(jiān)測等不同的領(lǐng)域，以及對不同國家和地區(qū)間進(jìn)行檢測，其結(jié)果不具有可比性。標(biāo)準(zhǔn)化的診斷和分型技術(shù)，可以在國家和世界范圍內(nèi)將來自人、動物和環(huán)境的數(shù)據(jù)更好地對接，這將有助于暴發(fā)疫情的傳染源追溯，更好地研究隱孢子蟲的傳播與流行。隨著功能基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)的迅速發(fā)展，相信在不久的將來會有更多、更有效的藥物應(yīng)用于隱孢子蟲病的臨床治療。

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