巨尾桉胞質EuCuZnSOD基因的克隆與原核表達

趙艷玲, 周利建

(華僑大學 化工學院， 福建 廈門 361021)

巨尾桉胞質EuCuZnSOD基因的克隆與原核表達

趙艷玲, 周利建

(華僑大學 化工學院， 福建 廈門 361021)

通過克隆巨尾桉的細胞質EuCuZnSOD基因,構建原核表達載體pET-CuZnSOD，并研究該基因的功能.測序結果表明：基因序列長度為459 bp；152個編碼氨基酸,蛋白相對分子質量為15.2 ku.在28 ℃條件下,1 mmol·L-1異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導4 h,轉化菌株的超氧化物歧化酶(SOD),總酶活比對照組平均高19.9%.結果表明：克隆獲得的巨尾桉細胞質EuCuZnSOD的重組基因表達產物具有SOD酶活性,GenBank注冊號為JX138573.

巨尾桉;EuCuZnSOD基因； 銅鋅超氧化物歧化酶; 克隆; 原核表達.

桉樹在我國造紙木漿生產上具有重要地位,但是低溫限制了桉樹的種植范圍,盲目北移推廣種植遭受重大經濟損失.過去的桉樹抗寒性研究主要集中在優(yōu)樹選育、抗寒鍛煉和抗寒生理生化機制等,隨著現(xiàn)代生物技術的發(fā)展,通過基因工程手段定向增加樹木抗寒能力已成為可能.超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)是體內氧自由基清除反應的第1個酶類,催化超氧負離子轉變成O2和H2O2.植物細胞主要含有3 種類型的SOD:CuZnSOD,MnSOD和FeSOD[1].CuZnSOD(簡稱CSD)是3 種歧化酶中質量分數(shù)最豐富的一種,是活性氧清除酶系統(tǒng)中最重要的酶,分布于植物的葉綠體、細胞質、質外體、過氧化物酶體和細胞核[2],與植物的非生物脅迫如旱[3]、鹽堿[4]、重金屬[5]、低溫[6],以及生物侵襲[7-8]等多種氧化應激反應密切相關.在桉樹抗寒性與保護酶的關系方面,國內主要研究SOD活性,SOD活性是桉樹本身遺傳因子所決定的,可作為篩選桉樹抗寒性的一個生理指標.研究發(fā)現(xiàn):造成巨尾桉幼苗低溫傷害的主要原因是體內活性氧代謝的失調[9].尾巨桉幼苗在低溫脅迫下SOD的活性先升高,后降低,隨低溫脅迫時間的延長酶活性下降[10],桉樹的不同種類應對低溫逆境時，其SOD的活性變化差異明顯[11],低溫脅迫處理后,耐寒的鄧恩桉比尾葉桉的SOD活性高[12].桉樹個體內的SOD活性隨時間不斷變化,耐寒能力強的桉樹,SOD低溫反應較敏感[13].綜上所述:SOD的活性越高,表明桉樹對低溫脅迫的抵抗能力越強.但是，桉樹的CuZnSOD基因至今未有成功克隆，GenBank中只注冊成功一段長390 bp的mRNA部分序列.本文成功克隆了巨尾桉的EuCuZnSOD基因,通過該基因的原核表達確定了EuCuZnSOD基因的功能,為進一步探討桉樹的抗寒性機理提供了物質基礎.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與植物材料 pET-32a(+),E.coliJM109,BL21(DE3),巨尾桉植株為本實驗室保存;pMD18-T Vector購自大連Takara有限公司.

1.1.2 試劑 PrimeScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit,聚合酶鏈式反應(PCR)體系等均購自大連Takara公司;其他試劑購自上海生工公司；引物由廈門精聚公司合成.

1.2 實驗方法

1.2.1 巨尾桉EuCuZnSOD的克隆 用Trizol法提取巨尾桉總RNA()，根據(jù)Takara公司的反轉錄試劑盒說明書反轉錄總RNA,通過生物信息技術分析植物CuZnSOD基因的保守區(qū)域,設計引物 FSOD: 5′ATGGTGAA- GGCCGTTGCCGTCC 3′,RSOD:5′TTAGCCTTGCAGACCAATAATAC 3′,應用降落PCR 擴增目的基因,反應程序為:94 ℃變性2 min;然后94 ℃,30 s,65～56 ℃退火45 s (每個循環(huán)降低1 ℃),72 ℃延伸60 s，共10個循環(huán);之后,94 ℃,30 s,55 ℃,45 s,72 ℃,60 s,共20個循環(huán);最后72℃延伸5 min.玻璃奶回收試劑盒(美國Promega公司)回收目的片段與pMD18-T Vector連接.重組載體轉化JM109感受態(tài),篩選陽性質粒.通過Sac I/BamH I雙酶切驗證陽性克隆子,命名為pMD-CSD,送上海生工生物工程股份有限公司雙向測序,將測序結果提交至NCBI.

1.2.2 原核表達載體pET-CuZnSOD的構建 將pMD-CSD和pET-32a(+)質粒用BamH I和Sac I雙酶切后,回收目的片段,并連接,轉化BL21感受態(tài),篩選陽性克隆菌株,Sac I/BamH I雙酶切驗證,命名為pET-CuZnSOD.

1.2.3EuCuZnSOD蛋白原核表達 將含有pET-CuZnSOD的BL21菌株、含有pET-32a(+)的BL21菌株及空菌株BL21,分別接種于5 mL LB培養(yǎng)基中(50 μg·mL-1Amp),37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜;以1∶50量各接種兩瓶共6瓶50 mL LB培養(yǎng)基中( 50 μg·mL-1Amp),37 ℃振蕩培養(yǎng)至D(600)為0.4,添加1 mmol·L-1的異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導,不加IPTG為空白對照組,37 ℃誘導4 h后取1 mL菌液離心,收集菌體,加100 μL的蛋白上樣緩沖液,沸水5 min,吸取10 μL上樣,質量分數(shù)為15% SDS-PAGE電泳分析,經考馬斯亮藍R250染色,脫色分析.

1.2.4 IPTG對EuCuZnSOD蛋白原核表達的影響 同節(jié)1.2.3,挑單菌落,37 ℃振蕩培養(yǎng),轉接5瓶,培養(yǎng)至D(600)為0.4,分別添加IPTG至終濃度為0,0.5,1.0,1.5,2.0 mmol·L-1,培養(yǎng)5 h后分別取1 mL菌液,同節(jié)1.2.3方法處理,對質量分數(shù)為12%的SDS-PAGE電泳分析.

1.2.5 誘導時間對EuCuZnSOD蛋白原核表達的影響 同節(jié)1.2.3,挑單菌落,37 ℃和28℃條件下分別振蕩培養(yǎng),轉接培養(yǎng)至D(600)為0.4,添加IPTG 1 mmol·L-1,分別培養(yǎng)0,1,2,3,4,5,6 h,每隔1 h取1 mL菌液離心,對質量分數(shù)為2% 的SDS-PAGE電泳分析.

1.2.6 NBT法檢測SOD蛋白酶活性 同上,挑單菌落搖菌,添加IPTG 1 mmol·L-1,培養(yǎng)至3 h,不含載體的空白菌株平行處理做對照組.超氧化物歧化酶(SOD)活性的測定采用氮藍四唑(NBT)法,已知活性單位以抑制NBT光化還原的50%為一個酶活性單位表示,SOD活性為

z(SOD)=(AC，K-AE)×16 067V/(1/2×AC,K×W×Vt) .

上式中：z為總活性(nKat);AC，K為對照組管的吸光度;AE為樣品管的吸光度;V為樣品總體積(mL);Vt為測定時樣品用量(mL);W為樣品鮮質量(g).

2 結果與分析

2.1 巨尾桉EuCuZnSOD的克隆

用Trizol試劑提取總RNA,反轉錄成cDNA后,經PCR擴增,獲得一條大約500 bp的條帶，如圖1所示.圖1中：M為蛋白Marker．PCR產物與pMD-18T連接,命名為pMD-CSD,SacI/BamHI雙酶切驗證具有一條500 bp左右的條帶,表明連接成功，如圖2所示.圖2中：M為蛋白Marker．經上海生工生物工程股份有限公司雙向測序后,基因序列長度為459 bp,編碼152個氨基酸,蛋白相對分子質量為15.2 ku,等電點為6.42.經生物信息學分析(數(shù)據(jù)未列出),克隆得到的巨尾桉EuCuZnSOD為胞質CuZnSOD,是非跨膜性親水性穩(wěn)定非分泌蛋白,無規(guī)則卷曲和β-折疊是其蛋白質二級結構的主要元件.

與之前在GenBank中注冊成功的一段長為390 bp的mRNA部分序列比對，兩片段的相似性是79%，在NCBI中Blast發(fā)現(xiàn)：與樹棉的細胞質CuZnSOD的相似性最高是90%,申請GenBank注冊,基因注冊號為JX138573.

2.2 原核表達載體pET-CuZnSOD的構建

采用外源基因原核表達法研究該克隆基因片段的功能.瓊脂糖凝膠回收的雙酶切EuCuZnSOD片段與pET-32a(+)連接,命名為pET-CuZnSOD,SacI/BamHI雙酶切篩選陽性克?。Y果表明：在459 bp處有目的條帶，如圖3所示.圖3中：M為蛋白Marker．由圖3可知：EuCuZnSOD原核表達載體構建成功.

圖1 巨尾桉EuCuZnSOD cDNA序列擴增 圖2 pMD-CSD SacI/BamHI雙酶切電泳圖 圖3 原核表達載體pET-CuZnSODSac I/BamH I雙酶切電泳圖

2.3 EuCuZnSOD重組蛋白的表達分析

以含有pET-CuZnSOD的BL21菌株、空菌株和含有質粒pET32a(+)的菌株研究目的蛋白的表達.pET-32a(+)載體的N端部分相對分子質量大約為20 ku,巨尾桉EuCuZnSOD基因完整的閱讀框架為459 bp,編碼152個氨基酸,理論上可表達為15.2 ku的蛋白,加上表達系統(tǒng)的融合蛋白部分,預期表達產物大約35 ku.實驗結果表明：經過1 mmol·L-1的IPTG誘導后,SDS-PAGE圖譜顯示在蛋白相對分子質量29.0 ku以上有一條明顯的蛋白差異帶，如圖4所示．圖4中：M為蛋白Marker;1為未誘導的空菌株;2為誘導的空菌株;3為未誘導的含pET-32a(+)的菌株;4為誘導的含pET-32a(+)的轉化菌株;5為未誘導的含pET-CuZnSOD的轉化菌株;6為誘導的含pET-CuZnSOD的轉化菌株,箭頭所示為表達的融合蛋白條帶位置.由圖4可知：目標蛋白可以在大腸桿菌中表達.

2.4 不同IPTG濃度誘導對重組蛋白EuCuZnSOD表達的影響

通過研究IPTG 0.5～2.0 mmol·L-14個濃度梯度對重組蛋白誘導表達的影響,篩選最佳的IPTG誘導濃度.誘導4 h的EuCuZnSOD蛋白表達量，如圖5所示．圖5中：M為蛋白Marker;1～5分別為0，0.5，1.0，1.5，2.0 mmol·L-1誘導4 h的蛋白表達；箭頭所示為表達的融合蛋白條帶.由圖5可知：所有濃度的IPTG均誘導出目的蛋白條帶,重組蛋白表達量無明顯變化,說明0.5～2.0mmol·L-1的IPTG濃度對目的蛋白的表達沒有影響.

圖4 pET-CuZnSOD在E.coli BL21表達的SDS-PAGE電泳圖 圖5 不同IPTG濃度對重組蛋白EuCuZnSOD表達的影響

2.5 不同培養(yǎng)時間對重組蛋白EuCuZnSOD表達的影響

通過檢測重組菌在不同時間表達EuCuZnSOD蛋白量確定最佳誘導時間.37 ℃和28 ℃條件下重組菌在1 h既有蛋白表達,如圖6所示.圖6中：M為蛋白Marker;1～7分別為0，1，2，3，4，5，6 h誘導的表達蛋白；箭頭所示為表達的融合蛋白條帶.由圖6可知：重組蛋白的37 ℃條件下的最佳誘導時間為3 h，28 ℃條件下在4 h重組蛋白的表達量達到最高水平.

(a) 37 ℃ (b) 28 ℃

2.6 巨尾桉EuCuZnSOD酶活檢測

圖7 SOD酶活性

因為大腸桿菌具有CuZnSOD酶,酶活性的測定方法是相同的,所以研究采用測定轉化菌株總SOD酶活性的變化,驗證誘導表達的巨尾桉EuCuZnSOD蛋白是否具有生物學功能.37 ℃培養(yǎng)條件下,轉化菌株的SOD總酶活反而比對照組低,可能是表達蛋白在此溫度下形成包涵體所致,而包涵體中的蛋白無酶活性,可能也影響了菌株本身的SOD酶活性.培養(yǎng)溫度的選擇是影響外源基因在大腸桿菌中表達的重要因素之一,外源蛋白大部分以活性存在的誘導溫度是25～37 ℃,降低誘導溫度,減慢細胞的生長速度,酶蛋白具有足夠的時間進行正確的折疊[14-18].實驗結果表明：在28 ℃培養(yǎng)條件下,轉化菌株的SOD總酶活比對照組平均高19.9%.說明在該溫度條件下獲得的外源表達產物存在可溶性蛋白，具有一定的酶活性.

3 結束語

成功克隆了巨尾桉的EuCuZnSOD基因,通過原核表達技術證明該基因具有生物學功能,但是該基因在巨尾桉中的時空表達特點以及在不同的脅迫環(huán)境下的表達模式需要進一步的研究.通過基因工程手段獲得過量表達EuCuZnSOD的桉樹植株,可能會提高桉樹的抗寒能力以及綜合抵抗各種逆境的能力,今后的研究目標和內容是培育出適應范圍更廣的桉樹,為桉樹定向培育研究提供物質基礎和技術支持.

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(責任編輯： 陳志賢 英文審校： 劉源崗)

Cloning and Expression of the Cytosolic Copper/Zinc Superoxide Dismutase Gene inEucalyptusgrandis×E.ophylla

ZHAO Yanling, Zhou Lijian

(College of Chemical Engineering, Huaqiao University, Xiamen 361021, China)

Copper Zinc superoxide dismutases are avital antioxidant enzymes that catalyze the disproportionation of superoxide anion to oxygen (O2) and hydrogen peroxide (H2O2) to guard cells against superoxide toxicity. The cytosolicCuZnSODgene was cloned fromEucalyptusgrandis×E.ophylla(GenBank Accession Number: JX138573).The cDNA nucleotide sequence analysis revealed that an open reading frame contains 459 bp nucleotide coding for 152 residues (15.2 ku). The full-length gene is amplified to construct expression vetorpET-CuZnSOD. The Escherichia coli is induced by 1 mmol·L-1IPTG in 28 ℃ for 4 hours and enzyme activity assay result shows that enzyme activity has increased 19.9% than the control in 28 ℃

eucalyptus grandis; copper/Zinc-superoxide dismutases; clone; prokaryotic expression

1000-5013(2015)06-0693-05

10.11830/ISSN.1000-5013.2015.06.0693

2015-01-05

趙艷玲(1978-)，女，助理研究員，博士，主要從事植物分子生物學的研究.E-mail:zhaoyl@hqu.edu.cn.

國家自然科學基金資助項目(31300497)

Q 943.2

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