活血解毒方對糖尿病大鼠視網膜病變的影響研究

何 潔，郝改梅，武志黔，韓 靜，吳 晏，薛曉興，李玉波，王 偉

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·專題研究·

活血解毒方對糖尿病大鼠視網膜病變的影響研究

何 潔，郝改梅，武志黔，韓 靜，吳 晏，薛曉興，李玉波，王 偉

目的 觀察活血解毒方對糖尿病大鼠視網膜中轉化生長因子-β2(TGF-β2)、Smad2及基質金屬蛋白酶9(MMP-9)、基質金屬蛋白酶2(MMP-2)、Ⅳ型膠原表達的影響，從TGF-β/Smads信號轉導通路調控基質代謝的角度探討活血解毒方改善糖尿病大鼠視網膜病變的可能作用機制。方法 SPF級雄性SD大鼠12只，大鼠適應性喂養(yǎng)1周后，按照隨機數字表法選取8只大鼠以65 mg/kg的劑量一次性腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)，誘導糖尿病模型。剩余4只作為正常組注射等量的檸檬酸鈉溶液。1周后尾靜脈采血檢測血糖，以禁食12 h血糖≥16.7 mmol/L為糖尿病模型造模成功。將8只糖尿病模型大鼠按照拉丁方設計，分為模型組和活血解毒方組，各4只。活血解毒方組給予活血解毒方7.70 g/kg，1次/d，正常組和模型組予以等體積純凈水，持續(xù)16周。采用Real-time PCR法檢測大鼠視網膜中TGF-β2mRNA及Smad2 mRNA的表達；Western blotting檢測MMP-9、MMP-2蛋白的表達；免疫組織化學法檢測Ⅳ型膠原的表達。結果 3組大鼠視網膜中TGF-β2mRNA、Smad2 mRNA表達比較，差異均有統(tǒng)計學意義(F=6.232，P=0.034；F=9.518，P=0.014)，其中模型組和活血解毒方組視網膜中TGF-β2mRNA、Smad2 mRNA表達水平均高于正常組；活血解毒方組視網膜中TGF-β2mRNA、Smad2 mRNA表達水平均低于模型組(P<0.05)。3組大鼠視網膜中MMP-9、MMP-2蛋白表達比較，差異均有統(tǒng)計學意義(F=17.387，P=0.001；F=8.593，P=0.008)，其中模型組和活血解毒方組視網膜中MMP-9、MMP-2蛋白表達均高于正常組(P<0.05)；活血解毒方組視網膜中MMP-9、MMP-2蛋白表達均低于模型組(P<0.05)。正常組大鼠視網膜中Ⅳ型膠原表達低，呈淡棕色；模型組：視網膜Ⅳ型膠原表達升高，呈深棕褐色；活血解毒方組：視網膜Ⅳ型膠原表達呈淡褐色，較模型組表達降低。結論 活血解毒方可能通過下調TGF-β2mRNA及Smad2 mRNA的表達，干預TGF-β/Smads信號轉導通路調控基質代謝，使MMP-9、MMP-2、Ⅳ型膠原的表達下調，從而改善糖尿病視網膜病變。

糖尿病視網膜病變；活血解毒方；TGF-β/Smads信號轉導通路；基質代謝

何潔，郝改梅，武志黔，等.活血解毒方對糖尿病大鼠視網膜病變的影響研究[J].中國全科醫(yī)學，2015，18(5)：507-512.[www.chinagp.net]

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糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病最嚴重和最常見的微血管并發(fā)癥之一，是工作年齡人群主要的致盲原因[1]。研究表明，TGF-β/Smads信號轉導通路可調控基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)的表達[2]。TGF-β/Smads信號轉導通路在DR的病理過程中發(fā)揮著十分復雜的作用，能夠調控細胞外基質(extracellulamatrix，ECM)的代謝，其中轉化生長因子-β2(transforming growth factor-β2，TGF-β2)作為TGF-β的亞型之一，主要在視網膜組織中表達，Smad2蛋白是TGF-β下游信號的重要轉導分子[3]。MMPs是參與ECM代謝的重要酶類[4]，MMP-2、MMP-9是MMPs分布最廣的兩種亞型，能夠降解Ⅳ型膠原等多種蛋白[5]，而Ⅳ型膠原是基底膜的主要成分之一[6]?；钛舛痉接晒砑鸷忘S連等中藥組成，具有滋陰清熱、活血化瘀的功效，是臨床經驗方。有研究發(fā)現，活血解毒方對糖尿病微血管病變有明顯的改善作用，但其確切的作用機制尚不十分明確[7-11]。本實驗通過檢測TGF-β2、Smad2及MMP-9、MMP-2、Ⅳ型膠原在糖尿病大鼠視網膜中的表達，從TGF-β/Smads信號轉導通路調控基質代謝的角度探討活血解毒方影響糖尿病大鼠視網膜病變的可能機制。

1 資料與方法

1.1 動物 SPF級雄性SD大鼠30只，周齡7周，體質量160～190 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號SCXK(京)2012-0001。SD大鼠在北京中醫(yī)藥大學實驗動物中心SPF實驗室飼養(yǎng)，室內溫度20～25 ℃、相對濕度50%～60%、換氣次數10～15次/h，12 h/d光照維持，晝夜循環(huán)。造模前對大鼠進行眼部及全身狀況檢查，以排除原發(fā)疾患，并檢測血糖，確保造模前大鼠血糖值均正常。大鼠自由攝食飲水，顆粒飼料喂養(yǎng)，每周監(jiān)測體質量，每4周檢測血糖。動物模型建立前，18只大鼠死亡，共入選12只大鼠。

1.2 藥品與試劑 活血解毒方由鬼箭羽和黃連等組成，由北京中醫(yī)藥大學中藥學院制備，使用時制備成0.77 g/ml水溶液。鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)，Sigma S0130，北京創(chuàng)信生物公司分裝。RIPA裂解液C1053、磷酸酶抑制劑P1260、HRP標羊抗兔C1309、HRP標羊抗小鼠C1308、30%丙烯酰胺溶液B1000、TEMED、4×分離膠緩沖液B1004、4×濃縮膠緩沖液B1003、封閉專用脫脂奶粉P1622、膜再生液P1650、10×電泳緩沖液B1005、10×電轉緩沖液B1006、10×封閉洗滌緩沖液B1009、PVDF膜P2120、superECL Plus超敏發(fā)光液P1010、X線暗盒E1101等均為北京普利萊基因技術有限公司生產。Anti-MMP-9 antibody ab119906、Anti-MMP-2 antibody ab37150、Anti-GAPDH antibody ab8245、Anti-collagenⅣ antibody ab6586，abcam，艾博抗(上海)貿易有限公司。Total RNA提取試劑盒0960602、qPCR試劑盒0960212，北京曠博生物技術有限公司。PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司北京合成部合成。免疫組化檢測試劑盒(兔鼠通用型)GK500705、抗原修復液GT100411，基因科技(上海)有限公司?？贵w稀釋液，DakoCA9013，美國。

1.3 儀器 Optium Xceed“安妥超越”血糖儀與Optium試紙(雅培糖尿病護理有限公司)，反轉錄儀(伯樂C1000)，Real-time PCR儀(AB公司)，小型轉印儀(伯樂)，BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)(7218R04420，美國)，眼科手術剪、顯微鑷(蘇州器械廠)，OLYMPUS顯微鏡(TH-200)。

1.4 方法

1.4.1 動物模型的建立、分組與給藥 大鼠適應性喂養(yǎng)1周后，禁食12 h，STZ溶解于0.1 mmol/L檸檬酸鈉溶液(冰盒中新鮮配制，pH 4.5)，按隨機數字表法選取8只大鼠以65 mg/kg的劑量一次性腹腔注射STZ，誘導糖尿病模型。剩余4只作為正常組注射等量的檸檬酸鈉溶液。1周后尾靜脈采血檢測血糖，以禁食12 h血糖≥16.7 mmol/L為糖尿病模型造模成功。第19周進行電鏡檢查，確定糖尿病模型大鼠確已發(fā)生病變，判斷標準：視網膜毛細血管基底膜增厚且不連續(xù)，內皮細胞線粒體腫脹，空泡樣變；膜盤間隙增寬；外核層細胞排列不規(guī)則，核染色質分布不均。將8只糖尿病模型大鼠按照拉丁方設計，分為模型組和活血解毒方組，各4只，分組原則為組間體質量和血糖值均有可比性?；钛舛痉浇M給予活血解毒方7.70 g/kg(相當于臨床用藥量的7倍灌胃)，1次/d，正常組和模型組予以等體積純凈水，持續(xù)16周。

1.4.2 檢測指標及方法

1.4.2.1 Real-time PCR法檢測TGF-β2mRNA及Smad2 mRNA在視網膜組織的表達 Trizol一步法提取總RNA。反轉錄反應體系：總RNA 3 μg，OligodT 1 μl，dNTP 2 μl，5×Buffer 4 μl，反轉錄酶1 μl，加入經DEPC處理的無菌水至20 μl；反應條件：42 ℃ 1 h，70 ℃ 5 min終止反應。反應結束后，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。從GenBank獲得目的基因mRNA的全長序列，利用引物和探針設計軟件Primer 5.0設計引物序列。經過Blast分析，引物序列具有特異性。以GAPDH為內對照進行Real-time PCR反應。引物序列：GAPDH上游5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′，下游5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′；TGF-β2上游5′- CTCCATACAGTCCCAGGTGC-3′，下游5′-GCAAGCGAAA GACCCTGAAC-3′；Smad2上游5′-ATGTCGTCCATCTTGCCATTC-3′，下游5′-AACCGTCCTGTTTTCTTTAGCTT-3′。反應體系：cDNA 1 μl，Mix 5 μl，引物0.8 μl，Rox 0.2 μl，加DEPC水至10 μl。反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)。反應結束后，讀取每份樣品中目的基因的Ct值，并與其內參基因的Ct值相減得出相對Ct值，以第一個相對Ct值為基線，將后面的相對Ct值與其進行減法運算，得出n值后進行相對運算，運算法則為1/2^n。

1.4.2.2 Western blotting檢測MMP-9、MMP-2蛋白在視網膜組織的表達 將所取的單眼視網膜加入RIPA裂解液約200 μl，在冰上用高速組織分散器勻漿，4 ℃ 10 000 r/min離心10 min后，轉移上清液至EP管中，BCA法測定蛋白質含量。蛋白與5 μl上樣緩沖液混勻，沸水浴煮10 min后點樣于質量分數10%聚丙烯酰胺凝膠進行SDS-PAGE電泳，先80 V穩(wěn)壓電泳待樣品跑出濃縮膠調電壓至120 V，剪取與凝膠大小一致的PVDF膜及6張濾紙，浸于電轉液中，待電泳結束，按(正極)3層濾紙→PVDF→凝膠→3層濾紙(負極)的順序做好“三明治夾”，300 mA直流電轉1.5 h。然后將PVDF膜取出至于平皿中，50 g/L脫脂奶粉37 ℃封閉1 h后，分別加入一抗MMP-9(1∶500)和MMP-2(1∶250)，4 ℃反應過夜。TBST漂洗3次，10 min/次，分別加入1∶500稀釋的羊抗小鼠IgG-HRP和1∶250的羊抗兔IgG-HRP，室溫搖床作用2 h，TBST漂洗3次，10 min/次。加入ECL顯影液顯影，用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)照相并進行光密度分析。同法檢測GAPDH內參照蛋白，通過目的基因與內參基因條帶的光密度比值作為MMP-9和MMP-2蛋白的相對含量分析。

1.4.2.3 免疫組織化學法檢測Ⅳ型膠原在視網膜組織的表達 用4%多聚甲醛溶液(4 ℃保存)固定大鼠眼球，48 h以后經脫水、石蠟包埋、切片，采用二步法進行免疫組織化學染色。石蠟切片脫蠟，梯度酒精脫水；流水漂洗10 min，抗原微波修復；PBS洗3次(5 min/次)，3% H2O2封閉15 min，流水沖洗5 min，PBS洗3次(5 min/次)；滴加一抗collagenⅣ 1∶400，4 ℃，濕盒孵育過夜后，37 ℃復溫45 min，PBS洗3次(5 min/次)；滴加二抗，37 ℃孵育2 h，PBS洗3次(5 min/次)；DAB顯色至背景變黃，流水沖洗15 min；蘇木精復染10 s，流水沖洗15 min；梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。光學顯微鏡下觀察、拍照。

2 結果

2.1 各組視網膜中TGF-β2mRNA、Smad2mRNA表達比較 3組視網膜中TGF-β2mRNA、Smad2mRNA表達比較，差異均有統(tǒng)計學意義(F=6.232，P=0.034；F=9.518，P=0.014)，其中模型組和活血解毒方組視網膜中TGF-β2mRNA、Smad2mRNA表達水平均高于正常組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；活血解毒方組視網膜中TGF-β2mRNA、Smad2mRNA表達水平均低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表1)。

表1 各組大鼠視網膜中TGF-β2mRNA、Smad2mRNA表達比較

Table1ComparisonofTGF-β2mRNAandSmad2mRNAexpressionsineachretinasofratsgroup

組別例數☆TGF-β2mRNASmad2mRNA正常組30235±02160563±0178模型組32146±0692?4725±1873?活血解毒方組31410±0496?△2517±0670?△

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05；☆表示數據有缺失

2.2 各組視網膜中MMP-9、MMP-2蛋白表達比較 3組大鼠視網膜中MMP-9、MMP-2蛋白表達比較，差異均有統(tǒng)計學意義(F=17.387，P=0.001；F=8.593，P=0.008)，其中模型組和活血解毒方組視網膜中MMP-9、MMP-2蛋白表達均高于正常組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；活血解毒方組視網膜中MMP-9、MMP-2蛋白表達均低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表2)。

Table2ComparisonofMMP-9，MMP-2proteinexpressionsineachretinasofratsgroup

組別例數MMP-9MMP-2正常組40209±01360089±0022模型組41192±0240?0239±0078?活血解毒方組40612±0304?△0145±0037?△

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05；MMP-9=基質金屬蛋白酶9，MMP-2=基質金屬蛋白酶2

2.3 各組視網膜中Ⅳ型膠原的表達 Ⅳ型膠原陽性細胞表現為胞質著色呈棕褐色，主要在神經節(jié)細胞層胞質和血管內皮細胞有陽性表達，糖尿病組大鼠隨著病情發(fā)展，視網膜內核層細胞也有陽性表達。鏡下可見：正常組大鼠視網膜中Ⅳ型膠原表達低，呈淡棕色；模型組：視網膜Ⅳ型膠原表達升高，呈深棕褐色；活血解毒方組：視網膜Ⅳ型膠原表達呈淡褐色，較模型組表達降低(見圖1)。

3 討論

視網膜微循環(huán)障礙是DR發(fā)生的基礎[3]，其病理改變過程為毛細血管內皮細胞間連接松弛，通透性增加，基底膜增厚；周細胞丟失，管壁空洞樣變；內皮細胞過度增殖，屏障功能損害，血液成分滲出，毛細血管閉塞，引起視網膜水腫及新生血管形成，同時伴隨纖維組織增生等改變[12]。

TGF-β是一種多功能雙向細胞因子，調節(jié)多種靶基因表達，可抑制內皮細胞增殖，也可促進新生血管管腔形成，還可以刺激ECM合成，促使ECM沉淀，刺激膠原蛋白合成增多，在DR的病理過程中發(fā)揮著十分重要的作用。TGF-β有多種亞型，在視網膜組織中主要表達TGF-β2。Smad2蛋白是TGF-β下游信號的重要轉導分子，在TGF-β/Smad信號轉導通路中發(fā)揮著重要作用[3，13]。有研究發(fā)現，TGF-β2可以提高α平滑肌肌動蛋白的表達，而α平滑肌肌動蛋白表達的上調可以促使Smad2發(fā)生核內轉移，使視網膜周細胞由生長增殖狀態(tài)到生長抑制狀態(tài)，退出生長周期[14-15]。說明Smad2在DR視網膜新生血管形成中起著重要作用。Ochiai等[16]發(fā)現糖尿病患者玻璃體中總TGF-β2和活化TGF-β2水平顯著高于正常對照組，本實驗結果與之相符。

ECM是DR增生膜的主要成分，MMP-9、MMP-2是參與ECM代謝的關鍵酶類，其高表達能夠分解ECM產物，有助于血管內皮細胞沖破基底膜，向間質組織內部進一步伸展[17]。同時，MMPs分子能夠分解Ⅳ型膠原[18]，從而破壞內皮細胞間的緊密連接，為新生血管生成創(chuàng)造空間[17]。而基底膜和間質膠原蛋白的降解產物對血管內皮細胞也有趨化作用，有利于血管內皮細胞的定向遷移，從而形成新生血管。基底膜主要由Ⅳ型膠原、層粘連蛋白等構成，是位于毛細血管周圍特殊形式的ECM?；啄ぴ龊袷荄R的特征性改變之一。糖尿病代謝紊亂使Ⅳ型膠原合成增加，分解減慢，并在基底膜沉積[6]。Kowluru等[19]發(fā)現在患糖尿病2個月和12個月的大鼠體內，MMP-9激活，高血糖誘發(fā)的MMP-9活化會加快視網膜毛細血管細胞凋亡，這是糖尿病視網膜病變的前兆。趙宏等[20]用反轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)和放射免疫方法分別檢測20例PDR和10例正常對照玻璃體切除物中MMP-2、MMP-9 mRNA的表達與MMP-2、MMP-9的含量，結果PDR玻璃體切除物中MMP-2、MMP-9 mRNA與MMP-2、MMP-9的含量均高于正常對照組。本實驗用Western blotting檢測MMP-9、MMP-2蛋白在視網膜組織中的表達結果與之相符。魏玲格等[6]應用光鏡、免疫組織化學、電鏡等技術，研究不同時間點SD大鼠視網膜Ⅳ型膠原蛋白和毛細血管基底膜的厚度變化，結果顯示隨著糖尿病病程的發(fā)展，視網膜毛細血管基底膜不斷增厚并伴有Ⅳ型膠原蛋白的增加，本實驗結果與之相符。

注：A為正常組；B為模型組；C為活血解毒方組

圖1 各組大鼠視網膜中Ⅳ型膠原的表達(蘇木精染色，×400)

Figure 1 Expression of collagen Ⅳ in retinas of rats groups

中醫(yī)稱DR為消渴目病，病機以氣陰兩虛為基礎，腎陰虧損、肺胃津虧，從而燥熱內生，陰虛燥熱，燒傷脈絡致血瘀脈外，血行不暢、痰瘀互結、目絡瘀阻，治宜滋陰補腎、益氣養(yǎng)陰、活血化瘀[21]。活血解毒方是臨床經驗方，由鬼箭羽和黃連等中藥組成，具有滋陰清熱、活血化瘀的功效。前期研究發(fā)現，活血解毒方可降低糖化血紅蛋白[11]，同時還能夠降低視網膜血管內皮生長因子(VEGF)的表達，增加色素上皮衍生因子(PVDF)的表達[7]，抑制血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)及內皮素-1(ET-1)的表達[9]，能改善DR血流狀況，抑制毛細血管增生，從而改善由于高血糖引起的糖尿病視網膜微循環(huán)障礙[8]，對糖尿病微血管病變有明顯的改善作用。本實驗表明，活血解毒方改善糖尿病大鼠視網膜功能的作用可能與下調TGF-β2mRNA及Smad2 mRNA的表達，干預TGF-β/Smads信號轉導通路調控基質代謝，從而下調MMP-9、MMP-2、Ⅳ型膠原的表達有關。但是TGF-β/Smads信號轉導通路調控基質代謝是一個十分復雜的過程，仍然需要進一步研究與之相關的Smad7蛋白、基質金屬蛋白酶抑制物-1(TIMP-1)、Ⅰ型膠原等表達的變化，以期闡明DR的發(fā)病機制，為活血解毒方用于臨床治療DR提供可靠的實驗依據。

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(本文編輯：賈萌萌)

Effects of Huoxue Jiedu Recipe on Retinopathy in Diabetic Rats

HEJie，HAOGai-mei，WUZhi-qian，etal.

BasicMedicalCollege，BeijingUniversityofChineseMedicine，Beijing100029，China

Objective To observe the effects of Huoxue Jiedu Recipe(HJR) on TGF-β2,Smad2，MMP-9，MMP-2，and collagen Ⅳ in diabetic rats with retina to explore possible mechanism of HJR in improving retinopathy of diabetic rats through TGF-β/Smads signal transduction pathways regulating matrix metabolism.Methods 12 SPF male SD rats were enrolled in this study.Eight rats，chosen randomly after 1 week of adaptive feeding，were given single intraperitoneal injection of streptozotocin(STZ)in a dose of 65 mg/kg，to induce diabetic models.The rest 4 rats，as control group，were given equal amount of sodium citrate.The 8 diabetic models were divided，according to latin square design，into groups model，HJR，4 in each.HJR group were given HJR，7.70 g/kg，1 time/d，groups control and model given equal volume of purified water，16 weeks.Real-time PCR method was used to determine the expressions of TGF-β2mRNA and Smad2 mRNA，the Western blotting used to detect the expressions of MMP-9，MMP-2 proteins，immunohistochemistry used to measure the expression of collagen Ⅳ.Results There was significant difference in the expressions of TGF-β2mRNA and Smad2 mRNA among 3 groups(F=6.232，P=0.034；F=9.518，P=0.014)，thereinto higher in groups model and HJR than in control group，lower in HJR group than in model group(P<0.05).There was difference in MMP-9，MMP-2 expressions among 3 groups(F=17.387，P=0.001；F=8.593，P=0.008)，thereinto higher in groups model and HJR than in control group(P<0.05)，lower in HJR group than in model group(P<0.05).The expression of collagen Ⅳ was low，assuming hazel in control group；high，assuming dark brown in model group；lower in HJR group than in model，assuming pale brown.Conclusion HJR can intervene，by down-regulating the expressions of TGF-β2mRNA and Smad2 mRNA，TGF-β/Smads signal transduction pathways regulating matrix metabolism to down-regulate the expressions of MMP-9，MMP-2，collagen Ⅳ to improve diabetic retinopathy.

Diabetic retinopathy；Huoxue jiedu recipe；TGF-β/Smad signaling transduction pathway；Matrix metabolism

國家科技部“十二五”支撐計劃項目(2012BAI29B07)；北京中醫(yī)藥大學在讀研究生項目(2014-JYBZZ-XS-024)

100029 北京市，北京中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院(何潔，郝改梅，武志黔，薛曉興，王偉)，科研實驗中心(韓靜，吳晏)；中國中醫(yī)科學院中醫(yī)基礎理論研究所(李玉波)

R 587.26

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2015.05.006

2014-10-20；

2014-12-10)