二斑葉螨幾丁質(zhì)酶基因的原核表達(dá)及多克隆抗體制備

張道偉，陳 靜，張正玲，曾燕玲，郭玉雙

（1.遵義師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院/赤水河流域動物資源保護(hù)與應(yīng)用研究重點實驗室，貴州 遵義 563002；2.遵義醫(yī)學(xué)院生化與分子生物學(xué)教研室，貴州 遵義 563009；3.貴州省煙草科學(xué)研究院，貴陽 550083）

二斑葉螨（Tetranychus urticaeKoch），屬于葉螨科（Tetranychidae）葉螨屬（Tetranychus），是一種分布廣泛，寄主種類繁多，食性雜的世界性害螨。其主要危害蘋果、柑橘、木薯和花卉等作物，是果園、花卉和溫室害螨[1]。1983年在北京首次發(fā)現(xiàn)其危害花卉作物以來，此后在山東、河北、重慶、江蘇和貴州等地區(qū)陸續(xù)發(fā)現(xiàn)其危害果園和其他作物，局部地區(qū)十分嚴(yán)重，甚至難以控制[2-3]。

二斑葉螨世代歷期短、繁殖力強(qiáng)、用藥次數(shù)多、抗藥性發(fā)展極為迅速。邱立紅等研究表明，常規(guī)化學(xué)農(nóng)藥如有機(jī)磷類和擬除蟲菊酯類農(nóng)藥對二斑葉螨防治效果不理想[4-5]。需要新型環(huán)保治理措施。

幾丁質(zhì)又稱甲殼素、甲殼質(zhì)，是由2-乙酰氨基-2-脫氧-D-吡喃葡萄糖苷通過β-1,4-糖苷鍵連接形成的一種多糖類生物高分子，廣泛存在于自然界的一種結(jié)構(gòu)類多糖生物高分子。在進(jìn)化過程中，昆蟲利用幾丁質(zhì)的剛性和化學(xué)穩(wěn)定性，形成其細(xì)胞外骨架如外表皮和中腸內(nèi)壁的圍食膜結(jié)構(gòu)（Peritrophic membrane，PM），保護(hù)昆蟲在生長、移動、呼吸和外界交流過程中免受環(huán)境中各種傷害[6]。幾丁質(zhì)約占昆蟲蛻皮干物質(zhì)的40%[7]。由于其獨特結(jié)構(gòu)和在昆蟲生長過程中重要作用，高等動物和植物中均不含幾丁質(zhì)，通過干擾幾丁質(zhì)的合成和降解，是新型農(nóng)藥研究的熱點。幾丁質(zhì)酶（EC3.2.1.14）是降解幾丁質(zhì)的主要酶類之一，在自然界存在范圍極為廣泛。在昆蟲中主要功能是周期性褪去舊表皮過程中降解幾丁質(zhì)。蜱螨綱物種作為節(jié)肢動物的一大類群，除沒有化蛹階段，其具有和昆蟲相似的生長發(fā)育歷程（卵、若螨、幼螨、成螨），同樣需要周期性褪去幾丁質(zhì)外殼并形成新表皮，但對蜱螨的蛻皮機(jī)制國內(nèi)外研究比較薄弱。目前對螨類幾丁質(zhì)酶研究甚少，對利用幾丁質(zhì)酶調(diào)控農(nóng)業(yè)害螨的機(jī)理研究處于空白。對二斑葉螨幾丁質(zhì)酶加以研究，有助于深入了解該害螨的幾丁質(zhì)代謝機(jī)制，為將來利用幾丁質(zhì)酶作為靶標(biāo)基因進(jìn)行二斑葉螨防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料

二斑葉螨（T.urticae）由貴州大學(xué)昆蟲研究所金道超教授饋贈，在實驗室飼養(yǎng)多代種群，樣品收集過程參考胡展育等方法[8]，采用直徑為12 cm培養(yǎng)皿飼養(yǎng)二斑葉螨，在培養(yǎng)皿內(nèi)放入約1 cm厚海棉塊，上面放1張薄膜，在薄膜上放1張平展的四季豆葉片，葉背向上，四周用棉條圈住，使葉片面積約為20 cm，皿內(nèi)保持淺水層以防葉片失水、干枯和幼、若螨逃逸。培養(yǎng)條件為溫度（25±1）℃、光照16 h的人工氣候箱。

1.1.2 試劑

AMV（Reverse transcriptase XL）、Oligo d（T）18、Ribonuclease Inhibitor、 DNA MarkerDL2000、pMD18-T載體、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、XhoⅠ、T4DNA連接酶、DNA Marker DL2 000、pMD18-T載體均購自TaKaRa公司；預(yù)染Marker、His單抗、NBT-BCIP顯色液購自武漢博士德公司、氨芐霉素（Ampicillin）、IPTG、牛血清白蛋白（BSA）、Ⅱ抗（IGg-AP）蛋白質(zhì)、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）所需試劑如丙烯酰胺、N，N'-甲叉雙丙烯酰胺、十二烷基硫酸鈉（SDS）、Tris緩沖液、TEMED（N，N，N'，N'-四甲基乙二胺）、過硫酸銨（AP）等購自北京索萊寶試劑公司。PCR擴(kuò)增試劑和蛋白Marker購自全式金生物公司；Tween-20購自Amresco公司；提取總RNA所用Trizol試劑購自上海Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計與合成

根據(jù)此前克隆的二斑葉螨幾丁質(zhì)酶全長基因序列（GenBank序列號，AEZ36152）設(shè)計一對引物，序列如下：Tuchi-F:5'TACGGATCCTTTGTCAC TTCGGT CGTCTC 3'（BamHⅠ）；

Tuchi-R:5'TCTCTCGAGGCCGCAAACACCAT TAACAT 3'（XhoⅠ）。

引物由上海英駿公司合成，在Tuchi-F和Tuchi-R中分別設(shè)計BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點（劃線部分）。

1.2.2 總RNA的提取與cDNA合成

RNA提取過程參考文獻(xiàn)[9]，取新鮮二斑葉螨置于無RNase研缽中，加入液氮，迅速進(jìn)行研磨至粉末狀；用移液器加入0.5 mL Trizol于研缽中，繼續(xù)研磨；待研缽中的固態(tài)物融化后，將其用移液器轉(zhuǎn)移至1.5 mL Eppendorf管中，用力振蕩15 s，室溫靜置5 min；加入0.1 mL氯仿，混合后靜置5 min，4℃，12 000 g離心15 min；小心取上清液移入1個新Eppendorf管中，再加入0.25 mL異丙醇，室溫靜置10 min，然后于4℃,12 000 g離心10 min；倒掉上清后，加入0.5 mL 75%乙醇洗滌沉淀，4℃，7 500 g離心5 min，棄掉上清液；將EP管倒置在超凈工作臺10～15 min，加入30 μL經(jīng)過DEPC處理過的去離子水中，將所獲RNA用凝膠電泳和分光光度計檢測濃度和純度。在總體積為25 μL的Eppendorf管中依次加入 1 μg二斑葉螨總RNA，2 μL Oligo d（T）18，5 μL的5×AMV buffer，2 μL dNTP（10 mmol· L-1），0.5 μL的AMV RNase，補(bǔ)充DEPC處理水到25 μL，在42℃水浴中保溫1.5 h后，95℃放置10 min滅活A(yù)MV RNase，即獲得cDNA。

1.2.3基因克隆及表達(dá)載體構(gòu)建

以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，以Tuchi-F和Tuchi-R為引物進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25 μL：10×Buffer 2.5 μL，dNTP（各2.5 mmol·L-1）1 μL，上下游引物各 1 μL，cDNA 1 μL，TaqDNA 聚合酶0.2 μL，補(bǔ)充雙滅菌蒸餾水至25 μL。PCR擴(kuò)增按如下條件進(jìn)行：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，55℃復(fù)性30 s，72℃延伸60 s，35個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，割膠回收、純化按DNA回收試劑盒說明書進(jìn)行。經(jīng)純化回收后的PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，通過藍(lán)白斑篩選，挑取陽性克隆，BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定后測序。

經(jīng)鑒定的陽性克隆過夜搖菌后提取質(zhì)粒DNA，經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切后回收目的基因片段，分別與用相同內(nèi)切酶雙酶切的pET-32a（+）表達(dá)載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，BamHⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定。驗證正確后獲得重組表達(dá)菌pET-32a-TuChi。

1.2.4 融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化及Western Blot鑒定

將鑒定正確的表達(dá)菌轉(zhuǎn)接到含有Amp抗性LB液體培養(yǎng)基中37℃過夜培養(yǎng)。過夜培養(yǎng)的菌液以1∶100體積比轉(zhuǎn)接至新的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，37℃，220 r·min-1培養(yǎng)振搖至OD600=0.5。加入IPTG使其終濃度分別為 0.4、0.6、0.8 mmol·L-1，30 ℃，220 r·min-1誘導(dǎo)表達(dá)2、4、6 h后分別取樣，經(jīng)10%SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)染色分析，確定最佳誘導(dǎo)表達(dá)時間。

以優(yōu)化的條件誘導(dǎo)表達(dá)菌表達(dá)，菌體經(jīng)10%SDS-PAGE后，半干法轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜，以多克隆抗體為一抗，以辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔IgG為二抗進(jìn)行Western Blot鑒定。

1.2.5 表達(dá)蛋白純化及多克隆抗體制備

以優(yōu)化的誘導(dǎo)條件誘導(dǎo)獲得100 mL菌液，超聲波破碎后離心，收集含有融合表達(dá)蛋白的上清。用Ni+柱純化融合蛋白，將純化的融合蛋白與弗氏完全佐劑按1∶1體積比充分乳化后，皮下多點注射新西蘭大白兔。免疫前，從兔耳抽取血樣，作為陰性對照。初次免疫后，每10 d使用弗氏不完全佐劑加強(qiáng)免疫1次，共3次。末次免疫后1周采血，分離血清，-70℃保存。

1.2.6 anti-Tuchi抗血清效價檢測

以純化的融合蛋白（100 g·孔-1）包被酶聯(lián)板，分別以不同稀釋倍數(shù)的免疫前兔血清（陰性對照）和免疫后兔血清作為一抗，用間接ELISA法測定多克隆抗體的效價。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組表達(dá)載體的構(gòu)建

以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到約800 bp的條帶（見圖1），與目的片段長度相近。PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑取陽性克隆送測序，結(jié)果顯示含有雙酶切位點以及目的基因序列共804 bp，該序列與登錄到Gen?Bank上二斑葉螨幾丁質(zhì)酶基因序列保持一致。通過BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切，將目的片段克隆至pET-32a（+）載體上，轉(zhuǎn)化后獲得的重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切（見圖2）和測序檢驗，序列與目的片段吻合。

2.2 誘導(dǎo)表達(dá)條件優(yōu)化及重組蛋白純化

以不同終濃度IPTG誘導(dǎo)含有重組質(zhì)粒的菌株，表達(dá)2、4和6 h后分別取樣，經(jīng)10%SDSPAGE分析表明，含pET-32a-TuChi重組質(zhì)粒的菌株大量表達(dá)分子質(zhì)量約45 ku的外源蛋白，當(dāng)IPTG終濃度為0.6 mmol·L-1，表達(dá)4 h后的目的條帶表達(dá)量達(dá)到最高值，表達(dá)6 h后重組蛋白量并不隨時間延長而增加（見圖3A），因此確定最佳表達(dá)時間為4 h的重組蛋白。按照材料方法所述，將所得蛋白粗提液過Ni柱純化。經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測結(jié)果如圖3B所示，咪唑洗脫液中含有大量目的蛋白，且純度很高；隨著洗脫步驟的增加，洗脫的目的蛋白含量很低。

2.3 His單克隆抗體分析純化的重組蛋白

為進(jìn)一步確認(rèn)表達(dá)出來的重組蛋白是帶有His標(biāo)簽的目的蛋白，對表達(dá)純化出來的蛋白進(jìn)行His單克隆抗體分析，Western Blot分析結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，純化出來的蛋白具有單一的結(jié)合條帶，表明表達(dá)純化出來的蛋白是所需目的重組蛋白。

圖1 二斑葉螨 TuChi基因PCR擴(kuò)增結(jié)果電泳分析Fig.1 Electrophoresis of PCR products of TuChi gene

圖2 Bam HⅠ、 Xho I雙酶切鑒定pET-32a- TuChi Fig.2 Digestion of pET-32a- TuChi

圖3 pET-32a-TuChi不同誘導(dǎo)時間下融合蛋白表達(dá)產(chǎn)物和重組蛋白純化Fig.3 pET-32a-TuChi induction under different time and purification of recombinant protein

圖4 His單克隆抗體分析雜交Western Blot分析Fig.4 Analysis of Western Blot by His momoclonal antibody

2.4 抗血清的效價檢測及特異性分析

將重組蛋白TuChi作為抗原，用間接ELISA法測定多抗效價。多克隆抗體第1次稀釋1 000倍，以后采用倍比稀釋法，當(dāng)稀釋到80 000倍時，待檢血清OD值明顯大于陰性對照OD值的2倍，而且陰性對照無明顯梯度。表明MBP-TuChi蛋白對anti-TuChi多克隆抗體具有很好的免疫原性，抗體效價anti-Tuchi＞80 000。

對抗體的特異性分析采用Western Blot方法，將純化后的抗體按1:1 000稀釋分別檢測二斑葉螨總蛋白和含pET-32a空載體的細(xì)菌總蛋白。結(jié)果如圖5所示，獲得的anti-Tuchi多克隆抗體能夠特異性識別二斑葉螨總蛋白中的幾丁質(zhì)酶，而對照蛋白（細(xì)菌）不能與其結(jié)合顯色。

圖5 Western Blot分析二斑葉螨幾丁質(zhì)酶抗體的特異性Fig.5 Western Blot analysis of the specificity of the Tuchi antibody

3 討論與結(jié)論

昆蟲及蜱螨類周期性蛻去舊表皮并合成新表皮，這一復(fù)雜的過程是由舊表皮和新表皮之間蛻皮液中的幾丁質(zhì)酶精確滴度調(diào)節(jié)[7]。在蛻皮階段，幾丁質(zhì)酶表達(dá)量高，易從昆蟲舊表皮和新表皮之間的蛻皮液中間純化出來。Kramer等首次從煙草天蛾（Manduca sexta）中克隆出全長的幾丁質(zhì)酶基因cDNA序列，已有多個編碼幾丁質(zhì)酶基因的cDNA序列從昆蟲不同目的多個物種中被分離，如煙草天蛾（Manduca sexta）[10]、家蠶（Bombyx mori）[11]、雙翅目如埃及伊蚊（Aedes aegypti）[12]、岡比亞按蚊（Anopheles gambiae）[13]鞘翅目如黃粉蟲和辣根猿葉甲（Phaedon cochleariae）[14]；膜翅目如甲腹繭蜂（Che?lonussp.）[15]。隨著基因組測序技術(shù)發(fā)展，幾丁質(zhì)酶研究已進(jìn)入基因家族功能階段[16]。目前對螨類中幾丁質(zhì)酶在其生長發(fā)育過程中的研究尚處于起步階段。

為獲得特異性好且效價高的Tuchi多克隆抗體，本研究采用pET-32a載體。pET-32a載體不僅提供更多的純化標(biāo)簽如His標(biāo)簽，Trx標(biāo)簽和S標(biāo)簽供選擇；添加1個小分子的伴侶蛋白可極大提高融合蛋白的表達(dá)效率。本研究中表達(dá)的重組蛋白Tu?chi在IPTG誘導(dǎo)4 h即達(dá)到最大表達(dá)量，全部以可溶性蛋白而非包涵體形式存在，減少重組蛋白是包涵體純化過程中的變性、復(fù)性等復(fù)雜處理步驟。為獲得可溶性的融合蛋白，需選擇合適載體、誘導(dǎo)溫度、IPTG濃度以及誘導(dǎo)時間等以確定最適宜表達(dá)條件。Anti-Tuchi最佳誘導(dǎo)條件是在37℃下，0.6 mmol·L-1IPTG，誘導(dǎo)4 h，可使重組蛋白Tuchi在上清表達(dá)。

本研究對二斑葉螨幾丁質(zhì)酶基因進(jìn)行高效表達(dá)，以親和色譜純化的融合表達(dá)蛋白免疫新西蘭大白兔制備anti-TuChi多克隆抗體，抗體效價大于80 000。為保證所獲anti-Tuchi抗體能夠用于下一步試驗，對抗體的特異性進(jìn)行分析。從獲得的an?ti-Tuchi在與二斑葉螨總蛋白Western Blot分析中，可看到明顯的結(jié)合條帶，但在條帶下方還有一些非特異性結(jié)合條帶。原因為：①總蛋白存在部分降解。二斑葉螨總蛋白提取過程中，超聲破碎時間過長，溫度升高導(dǎo)致蛋白降解；或在Western Blot轉(zhuǎn)膜過程中電流過大導(dǎo)致溫度過高致使部分蛋白降解。②多個昆蟲物種基因組測序工作已完成，發(fā)現(xiàn)昆蟲中幾丁質(zhì)酶是一個基因家族，其成員有16～18個成員不等[16-17]。本研究獲得的anti-Tuchi抗體能否識別基因家族的其他成員尚不清楚，有待后續(xù)研究進(jìn)一步證實。

總之，該多抗的制備為檢測TuChi基因在二斑葉螨體內(nèi)表達(dá)的時空分布和表達(dá)量提供有效手段，為深入研究二斑葉螨TuChi基因及未知幾丁質(zhì)酶的功能鑒定提供材料。Anti-TuChi多抗制備，為深入研究二斑葉螨蛻皮過程機(jī)理奠定基礎(chǔ)，為未來害蟲防治提供新思路。

[1]蔡雙虎,程立生.二斑葉螨的研究進(jìn)展[J].熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué),2003(9):68-74.

[2]甘麗萍,張新虎.二斑葉螨實驗種群生物學(xué)特性的研究[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報,2004(13):66-69.

[3]劉慶娟,于毅,劉永杰,等.二斑葉螨的發(fā)生與防治研究進(jìn)展[J].山東農(nóng)業(yè)科學(xué),2011(9):99-101.

[4]邱立紅,張文吉.害蟲及螨對阿維菌素（Avermectins）的抗藥性發(fā)展及治理策略探討[J].中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,1999(4):43-48.

[5]張志剛,沈慧敏,段辛樂,等.二斑葉螨對螺螨酯抗藥性及對18種殺螨劑交互抗性[J].植物保護(hù),2011,37:82-85.

[6]Arakane Y,Muthukrishnan S.Insect chitinase and chitinase-like proteins[J].Cell Mol Life Sci,2009,67(2):201-216.

[7]Merzendorfer H,Zimoch L.Chitin metabolism in insects:struc?ture,function and regulation of chitin synthases and chitinases[J].J Exp Biol,2003,206:4393-4412.

[8]胡展育,郅軍銳,熊繼文.二斑葉螨的實驗種群密度研究[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué),2005,33(3):16-18.

[9]陳靜,張建華,郭玉雙,等.白背飛虱海藻糖酶Treh-2基因克隆及生物信息學(xué)分析[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2013,44(6):112-117.

[10]Kramer K J,Corpuz L,Choi,et al.Sequence of a cDNA and ex?pression of the gene encoding epidermal and gut chitinases ofManduca sexta[J].Insect Biochem Mol Biol,1993,23:691-701.

[11]Abdel-Banat B M,Koga D A.Genomic clone for a chitinase gene from the silkworm,Bombyx mori:Structural organization identi?fies functional motifs[J].Insect Biochem Mol Biol,2001,31:497-508.

[12]De La Vega H,Specht C A,Liu Y.et al.Chitinases are a multigene family inAedes,Anopheles and Drosophila[J].Insect Mol Biol,1998(7):233-239.

[13]Shen Z,Jacobs-Lorena M.Characterization of a novel gut-specif?ic chitinase gene from the human malaria vectorAnopheles gambi?ae[J].J Biol Chem,1997,272:28895-28900.

[14]Girard C,Jouanin L.Molecular cloning of a gut-specific chitinase cDNA from the beetlePhaedon cochleariae[J].Insect Biochem Mol Bio,1999,29:549-556.

[15]Krishnan A,Nair P N,Jones D.Isolation,cloning,and character?ization of new chitinase stored in active form in chitin-lined ven?om reservoir[J].J Biol Chem,1994,269:20971-20976.

[16]Zhu Q,Arakane Y,Banerjee D,et al.Domain organization and phylogenetic analysis of the chitinase-like family of proteins in three species of insects[J].Insect Biochem Mol Biol,2008,38:452-466.

[17]Zhu Q,Arakane Y,Beeman R W,et al.Characterization of recom?binant chitinase-like proteins ofDrosophilamelanogaster andTri?boliumcastaneum[J].Insect Biochem Mol Biol,2008,38:467-477.