松針纖維素降解菌系篩選及產(chǎn)酶條件研究

王宏燕，張 玨，趙承森

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150030）

松針是松科松屬植物針葉，主要來(lái)源于黑松、油松和馬尾松等[1]。松針是一種可持續(xù)利用天然再生資源。通過(guò)合理利用廢棄松針資源，以之用作土壤改良劑，能改善土壤退化，提高土壤生物多樣性。纖維素是松針細(xì)胞重要組成成分之一。纖維素屬于大分子聚合物，是分布最廣的碳水化合物[2]。由于纖維素具有水不溶性的高結(jié)晶結(jié)構(gòu)，外圍被木質(zhì)素包圍，難以大量降解。因此，篩選高效纖維素降解菌尤為重要。關(guān)于纖維素降解菌篩選研究很多，有關(guān)纖維素酶產(chǎn)生菌報(bào)道中對(duì)纖維素分解活力較強(qiáng)的菌株為真菌屬菌株，國(guó)內(nèi)對(duì)產(chǎn)纖維素酶能力較強(qiáng)的單一菌種研究較多，菌種混合發(fā)酵研究較少[3-6]。

本研究從大興安嶺松林區(qū)松針腐殖土中篩選得到3株高纖維素酶活的纖維素降解菌，并對(duì)其進(jìn)行組合培養(yǎng)，得到優(yōu)勢(shì)組合，對(duì)該組合產(chǎn)酶條件進(jìn)行研究，可為合理利用廢棄松針資源提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來(lái)源

大興安嶺松林區(qū)松針腐殖土土樣，4℃保存。

1.1.2 松針來(lái)源

大興安嶺松林區(qū)松樹(shù)針葉，將新鮮無(wú)霉變松針洗凈烘干，粉碎，過(guò)20目篩，備用。

1.1.3 培養(yǎng)基

羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基：KH2PO40.5 g，CaCl20.07 g，（NH4）2SO40.4 g，CuSO40.005 g，MgSO4·7H2O 0.07 g，Na2HPO40.5 g，ZnCl20.001 g，CMC－Na 15.0 g，蒸餾水1 000 mL，121℃滅菌20 min。

馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖水26.0 g，蒸餾水1 000 mL，121℃滅菌20 min。

產(chǎn)酶培養(yǎng)基：(NH4)2SO41.4 g，KH2PO42 g，尿素0.3 g，MgSO4· 7H2O 0.3 g，CaCl20.3 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.0075 g，MnSO4· 7H2O 0.0025 g，ZnSO4·7H2O 0.002 g，CuSO4· 8H2O 0.003 g，蒸餾水1 000 mL，121℃滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 菌株富集和純化

將從菌源地采樣得來(lái)的土壤樣品取5.0 g加入盛有100 mL無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，激活菌源土中的菌種，將三角瓶置于28℃、140 r·min-1搖床上振蕩培養(yǎng)，重復(fù)傳接Ⅴ代。將第Ⅴ代菌液按照一系列不同濃度稀釋，將10-4、10-5、10-63種濃度菌液在無(wú)機(jī)鹽瓊脂培養(yǎng)基平板上涂布，每個(gè)稀釋度涂3大板塊，恒溫培養(yǎng)，反復(fù)劃線涂布至長(zhǎng)出單菌落，鏡檢確定為純凈單菌體后，接種在保藏培養(yǎng)基上進(jìn)行保存。

1.2.2 松針纖維素降解菌篩選

初篩采用剛果紅纖維素瓊脂培養(yǎng)基鑒別法，經(jīng)比較選取D/d較大的菌落進(jìn)行復(fù)篩。復(fù)篩采用酶活測(cè)定方法，分別測(cè)量CMC、濾紙、微晶纖維素3種酶活[7]，連續(xù)測(cè)量8 d。根據(jù)酶活力大小，得到優(yōu)勢(shì)菌株。

粗酶液制備：接種3.75 mL種子培養(yǎng)基中的菌液至裝有75 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基的150 mL三角瓶中，置于28℃、140 r·min-1搖床培養(yǎng)，收取菌液至離心管中，4℃、6 000 r·min-1離心10 min，取上清液即為粗酶液。

酶活定義：在pH 5.0，50℃條件下，1 mL粗酶液在1 min內(nèi)水解它的作用底物生成1 μg葡萄糖的酶活性，稱為1個(gè)纖維素酶活力單位（IU）。

1.2.3 組合菌群產(chǎn)酶條件研究

將復(fù)篩獲得的松針降解菌進(jìn)行組合培養(yǎng)，按體積比1∶1接種，通過(guò)測(cè)定CMC、濾紙和微晶纖維素3種酶活性，將其與單菌株3種酶活性進(jìn)行比較，篩選出最佳組合，進(jìn)行產(chǎn)酶條件研究。

以松針為唯一碳源，選擇豆餅粉、玉米面、尿素、（NH4）2SO4、NH4NO3、NH4Cl、NaNO3、KNO38種不同氮源進(jìn)行氮源對(duì)產(chǎn)酶影響的試驗(yàn)。每組3個(gè)重復(fù)。得到最佳氮源。

以松針為碳源，硝酸鈉為氮源，分別研究在以3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0作為起始培養(yǎng)pH時(shí)的產(chǎn)酶情況。每組3個(gè)重復(fù)。得到最佳起始pH。

當(dāng)以松針為碳源，硝酸鈉為氮源，培養(yǎng)基起始pH 6.0時(shí)，在酶反應(yīng)體系中加入聚乙二醇400、吐溫20、吐溫60和吐溫80等表面活性劑，進(jìn)行表面活性劑對(duì)產(chǎn)酶影響的試驗(yàn)。每組3個(gè)重復(fù)。得到最優(yōu)表面活性劑。

2 結(jié)果與分析

2.1 松針降解菌的初篩

在剛果紅纖維素培養(yǎng)基上經(jīng)剛果紅染色后，共有23株菌株有水解圈，以培養(yǎng)3 d后透明圈直徑與菌落直徑之比大于2為篩選原則，初步篩選得到9株松針降解菌，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 松針降解菌初篩結(jié)果Table 1 Pine needles degrading bacteria screening results

2.2 松針降解菌的復(fù)篩

將初篩獲得的9株菌分別進(jìn)行CMC、濾紙和微晶纖維素酶活力測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖1～3。

由圖1可知，從第1～8天，9株菌纖維素酶活力均有兩個(gè)峰值，其中ZJ-5峰值出現(xiàn)在第3和6天，ZJ-15峰值出現(xiàn)在第4和7天，其余7株菌的峰值均出現(xiàn)在第4和6天。ZJ-13和ZJ-8的CMC活性較高，達(dá)到40 IU以上水平，分別是47.68和44.39 IU。

由圖2可知，從第1～7天，9株菌的濾紙酶活力均有2個(gè)峰值，其中ZJ-1的峰值出現(xiàn)在第2天和第4天，ZJ-2、ZJ-5、ZJ-8、ZJ-15和ZJ-19峰值出現(xiàn)在第3和5天，ZJ-11、ZJ-13和ZJ-16峰值出現(xiàn)在第2和5天。ZJ-8和ZJ-13濾紙酶活性較高，達(dá)到30 IU以上水平，分別是31.15和30.05 IU。

由圖3可知，從第1～7天，9株菌的微晶纖維素酶活力均有兩個(gè)峰值，其中ZJ-13峰值出現(xiàn)在第2和5天，ZJ-2、ZJ-5、ZJ-8和ZJ-15峰值出現(xiàn)在第3天和第5天，ZJ-1、ZJ-11、ZJ-16和ZJ-19峰值出現(xiàn)在第3天和第6天。ZJ-13、ZJ-19和ZJ-8微晶纖維素酶活性較高，達(dá)到70 IU以上水平，分別是92.93、75.28和73.25 IU。

從各菌株3種纖維素酶活比較結(jié)果來(lái)看，確定ZJ-8、ZJ-13和ZJ-19為松針纖維素降解高效菌株。

圖1 松針降解菌CMC酶活Fig.1 CMC activity of pine needles degrading bacteria

圖2 松針降解菌濾紙酶活力Fig.2 FPA activity of pine needles degrading bacteria

圖3 松針降解菌微晶纖維素酶活Fig.3 Microcrystalline cellulose enzyme activity of pine needles degrading bacteria

2.3 菌株組合培養(yǎng)與單獨(dú)培養(yǎng)的酶活性比較

由圖4～6可知，多數(shù)組合培養(yǎng)的菌群酶活力均高于單獨(dú)培養(yǎng)菌株酶活力，可能是不同菌株間產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，提高菌株發(fā)酵產(chǎn)酶能力。不是所有組合菌群產(chǎn)酶能力均有提高，組合ZJ-13/ZJ-19的FPA和微晶纖維素酶活力較單獨(dú)培養(yǎng)的菌株ZJ-13和ZJ-19有所下降，可能是菌株間產(chǎn)生拮抗作用，互相影響產(chǎn)酶能力。

圖4 菌株單獨(dú)培養(yǎng)和組合培養(yǎng)的CMC酶活Fig.4 Strains cultured alone and mixed cultured of CMC activity

圖5 菌株的單獨(dú)培養(yǎng)與組合培養(yǎng)的濾紙酶活力Fig.5 Strains cultured alone and mixed cultured of FPA activity

圖6 菌株單獨(dú)培養(yǎng)與組合培養(yǎng)的微晶纖維素酶活力Fig.6 Strains cultured alone and mixed cultured of microcrystalline cellulose enzyme activity

菌株組合ZJ-8/ZJ-13的CMC、濾紙和微晶纖維素酶活較單獨(dú)培養(yǎng)的菌株提高最明顯，其CMC酶活力較ZJ-8和ZJ-13單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)分別提高87.85%和74.90%，F(xiàn)PA酶活力較ZJ-8和ZJ-13單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)分別提高15.10%和19.26%，微晶纖維素酶活力較ZJ-8和ZJ-13單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)分別提高67.30%和31.86%?？纱_定組合ZJ-8/ZJ-13為最優(yōu)組合。

2.4 組合菌群產(chǎn)酶條件的研究

2.4.1 不同氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響

以松針為唯一碳源，分別以豆餅粉、玉米面、尿素、（NH4）2SO4、NH4NO3、NH4Cl、NaNO3、KNO3作為氮源進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵，測(cè)定CMC、FPA和微晶纖維素3種酶活力。結(jié)果見(jiàn)圖7。

圖7 不同氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.7 Effect of different nitrogen sources on enzyme production

由圖7可知，組合菌群在以硝酸鈉為氮源的培養(yǎng)基中，3種酶活均達(dá)到最高，分別為90.27、43.92和131.61 IU。因此，最佳氮源為硝酸鈉。

2.4.2 不同起始pH對(duì)產(chǎn)酶的影響

以松針為碳源，硝酸鈉為氮源，用pH分別為 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0的緩沖溶液配置液體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，測(cè)定CMC、FPA和微晶纖維素酶活力。結(jié)果見(jiàn)圖8。

由圖8可知，組合菌群在起始pH 3.0～10.0均有酶活力，pH 6.0時(shí)，3種酶活均達(dá)到最高，分別為94.90、46.70和136.56 IU。因此，培養(yǎng)基最適起始pH 6.0。

2.4.3 培養(yǎng)基中添加不同表面活性劑對(duì)產(chǎn)酶的影響

當(dāng)以松針為碳源，硝酸鈉為氮源，培養(yǎng)基起始pH 6.0時(shí)，在酶反應(yīng)體系中加入聚乙二醇400、吐溫20、吐溫60和吐溫80等表面活性劑進(jìn)行培養(yǎng)，測(cè)定CMC、FPA和微晶纖維素酶活力。結(jié)果見(jiàn)圖9。

圖8 不同起始pH對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.8 Effect of different initial pH on enzyme production

圖9 添加不同表面活性劑對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.9 Effect of different surfactants on enzyme production

由圖9可知，組合菌群在4種表面活性劑作用下酶活力均有所提高，在加入聚乙二醇400時(shí)酶活最佳，3種酶活均達(dá)到最高，分別為98.03、50.84和140.06 IU，因此培養(yǎng)基中添加最佳表面活性劑為聚乙二醇400。

3 討 論

松針富含葉綠素、胡蘿卜素、維生素、蛋白質(zhì)、氨基酸等多種成分，具有生理活性作用和營(yíng)養(yǎng)保健作用[8-9]。在初篩、復(fù)篩松針纖維素高效降解菌株過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，每個(gè)菌株產(chǎn)酶高峰時(shí)間不同，但均有兩個(gè)峰值，每個(gè)菌株在達(dá)到第2個(gè)峰值后，酶活力均緩慢下降。

崔宗均等未使用傳統(tǒng)微生物純培養(yǎng)分離方法，篩選得到高效而穩(wěn)定的纖維素分解混合菌群，該混合菌群在高溫環(huán)境中表現(xiàn)出較強(qiáng)的分解能力[10]。文少白等以香蕉桿為唯一碳源培養(yǎng)無(wú)花果曲霉和康寧木霉，結(jié)果發(fā)現(xiàn)內(nèi)切酶（CMC）和纖維素全酶（FPA）活性分別比2種菌單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)提高[11]。因此，在篩選得到3株高效降解菌株后，組合培養(yǎng)研究。通過(guò)對(duì)松針降解過(guò)程中單菌株和組合菌群的CMC、FPA和微晶纖維素3種酶活性測(cè)定可見(jiàn)，多數(shù)組合產(chǎn)酶能力提高，可能是菌株間互補(bǔ)作用使產(chǎn)酶能力提高，但得到最優(yōu)組合為ZJ-8/ZJ-13，而非ZJ-8/ZJ-13/ZJ-19?？梢?jiàn)，并非所有高效菌株混合的產(chǎn)酶效果最好，尤其是組合ZJ-13/ZJ-19的酶活力與單菌株相比下降，這可能是菌株間拮抗作用導(dǎo)致。所以在研究組合菌群時(shí)，要注意菌株間是否存在拮抗作用。

對(duì)該組合產(chǎn)酶條件的研究發(fā)現(xiàn)，該組合分泌的纖維素酶在pH 3.0～10.0均有活力，說(shuō)明此組合分泌的纖維素酶pH范圍廣泛，在偏酸性條件下比在堿性條件下活力高。研究在培養(yǎng)基中加入表面活性劑對(duì)產(chǎn)酶影響，表面活性劑應(yīng)用在紡織工業(yè)中對(duì)酶的活性產(chǎn)生影響[12]，試驗(yàn)中作為無(wú)機(jī)非離子型表面活性劑聚乙二醇400對(duì)組合菌群有較好促進(jìn)酶生產(chǎn)效果。由于濾紙結(jié)構(gòu)中包括結(jié)晶型纖維素和非結(jié)晶型纖維素，所以通常采用FPA衡量纖維素菌酶系的綜合降解能力。此外，在有表面活性劑存在條件下，表現(xiàn)出較好適應(yīng)性。表面活性劑雖可提高纖維素分子溶解度，使酶和纖維素分子更有效接觸，但可能通過(guò)改變離子強(qiáng)度、螯合金屬離子等方式影響酶活性部位微環(huán)境或者可能因表面活性劑改變細(xì)胞膜通透性，造成菌體內(nèi)外環(huán)境失衡，影響其菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)酶。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)研究表明，單獨(dú)培養(yǎng)菌株獲得的纖維素分解菌在功能發(fā)揮上受很大限制，將篩選出的3株高效松針纖維素降解菌ZJ-8、ZJ-13和ZJ-19分別進(jìn)行單獨(dú)培養(yǎng)和混合發(fā)酵培養(yǎng)，經(jīng)產(chǎn)酶酶活性測(cè)定，多數(shù)組合酶活力均高于單獨(dú)培養(yǎng)菌株的酶活力，可能是不同菌株間產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，提高菌株發(fā)酵產(chǎn)酶能力。但并非所有組合菌群產(chǎn)酶能力均有提高，組合ZJ-13/ZJ-19的FPA和微晶纖維素酶活力較單獨(dú)培養(yǎng)的菌株ZJ-13和ZJ-19下降，這可能是菌株之間產(chǎn)生拮抗作用，互相影響產(chǎn)酶能力。其中，酶活力最高的組合為ZJ-8/ZJ-13，通過(guò)對(duì)組合ZJ-8/ZJ-13液態(tài)發(fā)酵條件研究發(fā)現(xiàn)，氮源為硝酸鈉和豆餅粉時(shí)3種酶活力大小相差不明顯，但是考慮到豆餅粉價(jià)格高于硝酸鈉，粉碎過(guò)程較復(fù)雜，確定硝酸鈉為最佳氮源進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，此組合分泌的纖維素酶pH范圍廣泛。經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察初步鑒定3株菌均為真菌，這也是組合菌群在偏酸性條件下比堿性條件下酶活力高的原因之一。試驗(yàn)中作為無(wú)機(jī)非離子型表面活性劑的聚乙二醇400對(duì)組合菌群促進(jìn)酶生產(chǎn)具有良好效果。

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