賴氨酸對原代奶牛乳腺上皮細(xì)胞中酪蛋白及mTOR信號通路相關(guān)基因表達(dá)的影響

高海娜，韓榮偉，鄭楠，胡菡，，李發(fā)弟，王加啟，，5

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州　730070；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島　266109；

3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)部奶產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實(shí)驗(yàn)室(北京)，北京　100193；

4.農(nóng)業(yè)部奶及奶制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心(北京)，北京　100193；5.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京

畜牧獸醫(yī)研究所，動物營養(yǎng)學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京　100193)

賴氨酸對原代奶牛乳腺上皮細(xì)胞中酪蛋白及mTOR信號通路相關(guān)基因表達(dá)的影響

高海娜1,3,4,5，韓榮偉2，鄭楠3，4，胡菡1，3，4，李發(fā)弟1，王加啟1，3，4，5

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州730070；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島266109；

3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)部奶產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實(shí)驗(yàn)室(北京)，北京100193；

4.農(nóng)業(yè)部奶及奶制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心(北京)，北京100193；5.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京

畜牧獸醫(yī)研究所，動物營養(yǎng)學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100193)

摘要：為了在探究單一添加不同濃度的賴氨酸對原代奶牛乳腺上皮細(xì)胞的增殖，以及mTOR信號通路介導(dǎo)的酪蛋白合成相關(guān)基因的影響.試驗(yàn)用厄爾平衡溶液(EBSS)代替正常培養(yǎng)基來處理原代奶牛乳腺上皮細(xì)胞，在此基礎(chǔ)上依次添加不同濃度的賴氨酸，采用MTT法檢測細(xì)胞12 h和24 h的增殖和利用qRT-PCR技術(shù)檢測4個編碼酪蛋白基因和8個mTOR信號通路中與乳蛋白合成翻譯相關(guān)基因的相對表達(dá)量.結(jié)果表明：添加賴氨酸12 h，濃度為0.5～24 mmol/L時，原代奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖數(shù)量增加(P=0.05)；添加賴氨酸24 h，濃度為0.5～8 mmol/L時，細(xì)胞增殖數(shù)量增加(P <0.01).當(dāng)賴氨酸的添加濃度為0.5～16 mmol/L時，CSN1S1、CSN1S2、CSN2 和 CSN3 基因表達(dá)均顯著上調(diào)(P<0.01).當(dāng)賴氨酸添加量為0.5～16 mmol/L時，mTOR和raptor基因的表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.05).在添加不同濃度的賴氨酸時，下游通路信號因子S6K1、4EBP1和eEF2基因表達(dá)均顯著上調(diào)(P<0.01)；rps6基因表達(dá)上調(diào)，eIF4E基因表達(dá)下調(diào)，但差異均不顯著.以上結(jié)果表明，補(bǔ)充賴氨酸能顯著促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞中酪蛋白的合成，這一過程與mTOR信號通路介導(dǎo)蛋白質(zhì)合成相關(guān).

關(guān)鍵詞：賴氨酸；酪蛋白；mTOR；細(xì)胞增殖；基因表達(dá)

第一作者：高海娜(1987-)，女，碩士，研究方向?yàn)閯游餇I養(yǎng)與飼料科學(xué).E-mail:gaohaina103@126.com

Effect of lysine on milk protein synthesis mediated by the

mTOR signaling pathway in the primary

mammary epithelial cell

GAO Hai-na1,3,4,5,HAN Rong-wei2,ZHENG Nan3,4,HU Han1,3,4,LI Fa-di1,WANG Jia-qi1,3,4,5

(1.College of Animal Science and Technology,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China;2.College of

Food Science and Engineering,Qingdao Agricultural University,Qingdao 266109,China;3.Ministry of Agriculture-

Milk and Dairy Product Inspection Center,Beijing 100193,China;4.Ministry of Agriculture-Milk Risk

Assessment Laboratory,Institute of Animal Sciences,Chinese Academy of Agricultural Sciences,

Beijing 100193,China;5.State Key Laboratory of Animal Nutrition,Institute of Animal

Sciences,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing 100193,China)

Abstract：The objective of this study was to use the primary bovine mammary epithelial cells as the model,understanding the regulatory effects of single supplement with different concentrations of lysine on cells proliferation by MTT and milk protein synthesis molecular mechanism by qRT-PCR.Treatment groups based on the Earle's balanced salts were added with lysine of different concentrations.The primary bovine mammary epithelial cell proliferation in 12 h and 24 h and the gene on milk protein synthesis were detected.The results showed that adding 0.5～24 mmol/L lysine for 12 h improved the proliferation of primary bovine mammary epithelial cell (P=0.05);adding 0.5～8 mmol/L lysine for 24 h,the rate of primary bovine mammary epithelial cell proliferation significantly increased (P<0.01).The expression of genes CSN1S1,CSN1S2,CSN2 and CSN3 significantly increased (P<0.01)when the concentration of lysine was 0.5～8 mmol.At the concentration of lysine was 0.5～16 mM,the expression of genes mTOR and raptor related to mTORC1 both increased (P<0.05).The expression of genes S6K1,4EBP1,eEF2 related to mTOR signaling pathway increased (P<0.01),but the increasing of rps6 was not significantly (P>0.05).Expression of gene eIF4E decreased,but not significant (P>0.05).These results demonstrated that lysine supplements could significantly promote the synthesis of casein,which the process might be a potential control point in the regulation of milk protein synthesis in the primary mammary epithelial cell.

Key words：lysine;casein;mTOR;cell proliferation;gene expression

隨著人們營養(yǎng)觀念的改變，乳品中的高蛋白、低脂肪已經(jīng)成為衡量乳品質(zhì)的重要指標(biāo)[1].乳蛋白是乳中重要的營養(yǎng)組成成分，具有較高的營養(yǎng)價值.已有的研究證明，只有深入了解反芻動物乳腺組織對氨基酸的吸收代謝模式和乳腺組織乳蛋白合成時的可吸收氨基酸比例才能提高乳腺乳蛋白的產(chǎn)量，改善乳品質(zhì)[2-3].作為奶牛營養(yǎng)物質(zhì)的氨基酸，它們除了作為蛋白質(zhì)合成的底物以外，也可以通過刺激哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin ，mTOR)信號通路中mTORC1復(fù)合物，進(jìn)而影響其下游因子的基因表達(dá)和蛋白磷酸化級聯(lián)反應(yīng)[4-6]，進(jìn)而調(diào)節(jié)乳蛋白合成率[5-7].

賴氨酸作為乳蛋白合成的第一限制性必需氨基酸，必然與乳腺的生長發(fā)育及泌乳密切相關(guān)[8].關(guān)于泌乳奶牛乳腺氨基酸代謝，以往的研究主要側(cè)重于賴氨酸對奶牛生產(chǎn)性能的影響[9-11]，試驗(yàn)表明，補(bǔ)充過瘤胃賴氨酸可以促進(jìn)奶牛尤其是產(chǎn)奶高峰期奶牛的乳蛋白合成[12].乳蛋白的合成是從乳腺上皮細(xì)胞中粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的核糖體上開始的，然后由信號肽引導(dǎo)進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔，并在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體內(nèi)進(jìn)行磷酸化和糖基化等化學(xué)修飾過程，再由分泌泡轉(zhuǎn)送到上皮細(xì)胞頂膜，通過胞吐的方式釋放到腺泡腔中[13].因此，乳腺上皮細(xì)胞的數(shù)量和功能很大程度上決定著泌乳奶牛的生產(chǎn)性能(乳產(chǎn)量和乳蛋白的合成量)[14].還有研究表明添加一定量的游離賴氨酸能夠提高αs1-酪蛋白(CSN1S1)基因的表達(dá)豐度[10-12,15].

本研究以體外培養(yǎng)的原代奶牛乳腺上皮細(xì)胞為模型，利用噻唑藍(lán)(MTT)法來探討添加不同濃度梯度水平的賴氨酸及培養(yǎng)時間對體外培養(yǎng)的原代奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖的影響及其對酪蛋白和mTOR下游信號基因表達(dá)的影響.旨在探討體外培養(yǎng)條件下，通過酪蛋白基因及影響酪蛋白合成的mTOR信號中多個基因的表達(dá)，乳蛋白合成時賴氨酸需要的最佳濃度范圍，以期為提高乳蛋白合成，改善牛奶質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù).

1試驗(yàn)材料

1.1主要儀器

冷凍離心機(jī)(德國索福Legend)、恒溫CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo)、倒置顯微鏡(日本olympus)、細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(Bio-Rad TC10)、RNA濃度測定儀(美國Thermo)、凝膠成像系統(tǒng)(美國Thermo)、IQ5熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad)、酶標(biāo)儀(美國Thermo)等.

1.2主要試劑

DMEM/F12培養(yǎng)基(Gibco，美國)、厄爾平衡溶液(EBSS，北京雷根生物技術(shù)有限公司)、胎牛血清(Gibco，美國)、青鏈霉素(碧云天生物技術(shù)研究所)、胰酶(碧云天生物技術(shù)研究所)、L-賴氨酸(Sigma，上海)、RNA 提取試劑盒(TIANGEN)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)、熒光定量試劑盒(TaKaRa)、噻唑藍(lán)(MTT，Sigma，美國)、二甲基亞砜(Sigma，美國)等.

原代奶牛乳腺上皮細(xì)胞：來自一頭健康的3歲中國荷斯坦奶牛.采取組織塊接種法和純化得到的健康奶牛乳腺上皮細(xì)胞.

2試驗(yàn)方法

2.1原代奶牛乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)室前期已建立原代奶牛乳腺上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)體系[16].將原代奶牛乳腺上皮細(xì)胞置于含有10%胎牛血清的 DMEM/F12 生長培養(yǎng)基中，在38 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng).當(dāng)細(xì)胞長滿培養(yǎng)皿(Corning，430165)的90%時，用胰酶溶液于38 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中消化，待細(xì)胞質(zhì)回縮，細(xì)胞間隙增大縮成圓形時，用培養(yǎng)基終止消化反應(yīng)；用移液器反復(fù)吹打后收集細(xì)胞懸液于離心管，900 r/min室溫離心5 min；棄上清液，加入新鮮的含有10%胎牛血清的 DMEM/F12 生長培養(yǎng)基，制成細(xì)胞懸浮液.

2.2MTT法檢測細(xì)胞增殖試驗(yàn)

將細(xì)胞密度調(diào)整到大約1×105個/mL接種到96 孔培養(yǎng)板(Corning，3599)，每孔100 μL，用含有10%胎牛血清的 DMEM/F12生長培養(yǎng)基貼壁處理24 h，用不含胎牛血清的DMEM/F12生長培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)過夜，細(xì)胞處理時用厄爾平衡溶液(配方見表1)代替正常培養(yǎng)基.陰性對照組是厄爾平衡溶液，陽性對照組是厄爾平衡溶液+10%胎牛血清，處理組是在陰性對照組的基礎(chǔ)上分別補(bǔ)充(Lys：0.5、1、2、4、6、8、16、24、48 mmol/L)9個濃度的賴氨酸，分別培養(yǎng)12 h和24 h后進(jìn)行MTT檢測.每種處理設(shè)6個重復(fù)，每組試驗(yàn)重復(fù)3次.最后用全自動酶標(biāo)儀檢測各孔450 nm波長下的吸光值(D450) 來判定細(xì)胞增殖狀況.細(xì)胞相對增殖率(relative growth rate，RGE)計(jì)算公式:

RGR=試驗(yàn)組OD450/對照組OD450

2.3q RT-RCR檢測試驗(yàn)

將原代奶牛乳腺上皮細(xì)胞接種到含有10%胎牛血清的 DMEM/F12生長培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中(Thermo 172958)中貼壁處理24 h，用不含胎牛血清的 DMEM/F12生長培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)過夜，然后對細(xì)胞進(jìn)行6 h的以下處理：陰性對照組(厄爾平衡溶液)，陽性對照組(厄爾平衡溶液+10%胎牛血清)，處理組分別是在陰性對照組(厄爾平衡溶液)基礎(chǔ)上添加(Lys：0.5、2、8、16 mmol/L)賴氨酸.每種處理3個重復(fù)，每組試驗(yàn)重復(fù)3次.

2.4樣品RNA提取

處理結(jié)束后提取原代奶牛乳腺上皮細(xì)胞總RNA(TIANGEN)，采用NanoDrop1000檢測RNA 純度及OD260nm/OD280nm，樣品質(zhì)量濃度保持在200 ng/μL左右，OD測定值在1.8

2.5反轉(zhuǎn)錄

采用500 ng RNA/10 μL體系，參照TaKaRa 的Prime Script RT reagent Kit With gDNA Eraser(貨號DRR037A)試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄操作.取2 μL 5×Prime Script Buffer 2(for Real Time)，0.5 μL Prime Script RT Enzyme Mix Ⅰ，0.5 μL Oligo dT Primer，配制成混合液并混勻后置于冰上，加入2 μg 模板RNA，再加入RNase-free 水補(bǔ)足到10 μL，最后將反應(yīng)體系置于PCR儀上，37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃保存.這樣就得到了cDNA第一鏈，樣品長期保存可放-20 ℃.

以cDNA為模板，參照TaKaRa的SYBR Green說明書(貨號：DRR820A) 進(jìn)行q RT-RCR方法檢測mRNA 的表達(dá)，選用r9基因?yàn)閮?nèi)參.試驗(yàn)中所用的13個基因的引物均由上海生工基因有限公司合成(引物見表2)，其定量反應(yīng)體系為20 μL：10 μL SYBR?Premix ExTaqTMⅡ(2×)，0.8 μL PCR forward primer，0.8 μL PCR forward reverse，2 μL cDNA，6.4 μL 無酶水.反應(yīng)程序?yàn)榈?階段95 ℃ 30 s，1個循環(huán)；第2階段退火延伸95 ℃ 5 s，60 ℃：34 s，40個循環(huán).熔解曲線程序?yàn)?5 ℃ 30 s，共41個循環(huán).合成的cDNA貯存于-20 ℃冰箱中，備用.利用IQ5實(shí)時定量序列檢測軟件(Bio-Rad versa Doc，USA) 自動讀取Ct值.

表2　引物序列

2.7統(tǒng)計(jì)分析熒光定量數(shù)據(jù)

采用2-ΔΔCt法分析奶牛乳腺上皮細(xì)胞中目的基因mRNA的相對表達(dá)量，所有結(jié)果用SAS 9.2軟件ANOVA程序進(jìn)行方差分析，均值多重比較采用鄧肯氏法(Duncan法)，結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示.q RT-RCR數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)參見Livak等[21]的方法進(jìn)行.

3結(jié)果與分析

3.1賴氨酸對乳腺上皮細(xì)胞增殖的影響

檢測賴氨酸對體外培養(yǎng)的原代奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖作用的吸光度值(OD)列于表3，OD值可間接地反映出細(xì)胞的增殖能力，OD值越大表明增殖能力越強(qiáng).試驗(yàn)結(jié)果如表3和圖1所示，同一濃度不同培養(yǎng)時間對原代奶牛乳腺細(xì)胞的增殖影響差異不顯著；而同一時間不同濃度對原代奶牛乳腺上皮細(xì)胞的增殖有不同程度的影響.其中，當(dāng)在厄爾平衡溶液添加濃度為0.5～24 mmol/L的賴氨酸，培養(yǎng)12 h，對奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖有作用，但差異不顯著；而隨著賴氨酸的濃度增大(48 mmol/L)對體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞的增殖有抑制作用.當(dāng)在厄爾平衡溶液添加濃度為0.5～8 mmol/L的賴氨酸，培養(yǎng)24 h，對原代奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用(P<0.01)；而隨著賴氨酸濃度的增大(16～48 mmol/L)對體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞的增殖有抑制作用.培養(yǎng)時間的作用結(jié)果如圖1所示，在最適濃度范圍內(nèi)12 h的增殖作用最強(qiáng).

表3　賴氨酸對原代奶牛乳腺上皮細(xì)胞的相對生長率(n=3)

同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫字母表示濃度差異顯著(P<0.05)、同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同大寫字母表示時間差異顯著(P<0.05).

圖1　賴氨酸對原代奶牛乳腺上皮細(xì)胞相對

3.2賴氨酸對原代奶牛乳腺上皮細(xì)胞酪蛋白相關(guān)基因表達(dá)的影響

以體外培養(yǎng)的原代奶牛乳腺上皮細(xì)胞為模型，研究在厄爾平衡溶液中添加不同濃度的賴氨酸對酪蛋白合成的影響.試驗(yàn)結(jié)果如表4和圖2所示，在厄爾平衡溶液添加濃度為 0.5～16 mmol/L的賴氨酸，與未添加賴氨酸的陰性對照組相比，αs1-酪蛋白(αs1-casein,CSN1S1)、αs2-酪蛋白(αs2-casein,CSN1S2)、β-酪蛋白(β-casein,CSN2)和 κ-酪蛋白(κ-casein,CSN3)基因表達(dá)均顯著上調(diào)(P<0.01).這說明賴氨酸能促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞CSN1S、CSN1S2、CSN2和CSN3基因的表達(dá).但是不同水平賴氨酸處理對相同酪蛋白的基因促進(jìn)效果不同，隨著賴氨酸濃度的升高則其基因表達(dá)量下降；當(dāng)賴氨酸的添加濃度為0.5 mmol/L時，CSN1S1、CSN1S2和CSN2基因表達(dá)量最高.而當(dāng)賴氨酸的添加濃度為2 mmol/L時，CSN3基因的表達(dá)量最高.

實(shí)驗(yàn)教學(xué)儀器設(shè)備的維修是設(shè)備管理的重要工作，隨著設(shè)備的使用，難免會出現(xiàn)設(shè)備損壞的情況，這就需要我們對實(shí)驗(yàn)設(shè)備進(jìn)行維修和保養(yǎng)，做好儀器設(shè)備的維修能夠提高設(shè)備的使用年限，也能夠保證實(shí)驗(yàn)教學(xué)的順利開展。實(shí)驗(yàn)設(shè)備的維修應(yīng)有維修記錄表，每次維修詳細(xì)記錄，方便今后查閱。

3.3賴氨酸對mTOR信號通路相關(guān)基因表達(dá)的影響

以體外培養(yǎng)的原代奶牛乳腺上皮細(xì)胞為模型，研究在厄爾平衡溶液中添加不同濃度的賴氨酸對mTOR信號通路相關(guān)的基因的影響.結(jié)果由表5和圖3可見.與陰性對照組相比，添加賴氨酸使mTOR復(fù)合物1中的mTOR、raptor(regulatory-associated protein of mTOR)和mTORC1復(fù)合物中的綁定蛋白(Binds to the kinase domain of mTOR,stabilizes protein of raptor ，GβL)基因的表達(dá)上調(diào)，但是不同水平賴氨酸處理對mTORC1組件中不同基因促進(jìn)效果不同；當(dāng)賴氨酸濃度的添加范圍為0.5～16mmol/L，mTOR基因的表達(dá)顯著升高(P<0.01)，而raptor基因是在賴氨酸濃度為0.5～2 mmol/L的范圍內(nèi)顯著升高(P<0.01).而GβL基因是在賴氨酸濃度為0.5～8 mmol/L的范圍內(nèi)顯著升高(P<0.01).但是隨著賴氨酸濃度的增加，這3個基因的相對表達(dá)量減少.

表4　賴氨酸對乳蛋白相關(guān)基因表達(dá)的影響(n=3)

同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫字母表示濃度差異顯著(P<0.05)；E為The Earle’s balanced salt solution (EBSS)的縮寫.

圖2　賴氨酸對乳蛋白相關(guān)基因表達(dá)的影響(n=3)

當(dāng)添加賴氨酸后，mTOR信號通路下游基因：核糖體S6蛋白激酶(Ribosomal protein S6 kinase，S6K1)、真核翻譯起始因子4E 結(jié)合蛋白1 ( Eukaryotic translation initiation factor 4 e binding protein 1，4EBP1)、真核細(xì)胞翻譯延伸因子(eukaryotic elongation factor，eEF2)和核糖體蛋白S6 (Ribosomal protein S6，rps6)也上調(diào)，但是不同水平賴氨酸處理對mTOR通路中不同下游基因促進(jìn)效果不同(如表5/圖4、5)；當(dāng)賴氨酸的添加濃度為0.5～2 mmol/L時， 顯著增加S6K1基因的表達(dá).當(dāng)賴氨酸的添加濃度為0.5～8 mmol/L，顯著增加4EBP1基因的表達(dá).當(dāng)賴氨酸的添加濃度為0.5～16 mmol/L時，均顯著增加eEF2基因的表達(dá)作用.但是S6K1和4EBP1基因隨著賴氨酸添加量的增加，其基因的相對表達(dá)量減少.但當(dāng)在厄爾平衡溶液中添加賴氨酸，會使真核翻譯起始因子 4E結(jié)合蛋白1(eukaryotic translation initiation factor 4E binding protein 1,EIF4E)基因的表達(dá)量下調(diào)，但差異不顯著.

表5　賴氨酸對mTOR信號通路相關(guān)基因表達(dá)的影響(n=3)

同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫字母表示濃度差異顯著(P<0.05)；E： The Earle’s Balanced Salt Solution (EBSS)的縮寫.

圖3　賴氨酸對mTOR信號通路相關(guān)基因

圖4　賴氨酸對mTOR信號通路相關(guān)基因

圖5　賴氨酸對mTOR信號通路相關(guān)基因

4討論

4.1賴氨酸對乳腺上皮細(xì)胞增殖的影響

乳腺組織在動物體內(nèi)的增殖和分化受許多因素的影響如激素、維生素、氨基酸、生長因子等，這些因素同樣也影響體外培養(yǎng)的乳腺上皮細(xì)胞的增殖、分化、泌乳等功能[22].

本試驗(yàn)在不含胎牛血清的厄爾平衡溶液中單一添加不同濃度的賴氨酸，體外培養(yǎng)不同時間的原代奶牛乳腺上皮細(xì)胞.試驗(yàn)結(jié)果表明，在培養(yǎng)原代奶牛乳腺上皮時，單一添加不同濃度的賴氨酸，不同時間點(diǎn)作用的效果趨勢相同.這說明賴氨酸對原代奶牛乳腺上皮細(xì)胞的增殖具有一定程度的調(diào)節(jié)作用.當(dāng)在厄爾平衡溶液添加濃度為0.5～24 mmol/L的賴氨酸，培養(yǎng)12 h，對奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖有作用(P=0.05)，但差異不顯著；而隨著賴氨酸的濃度增大(48 mmol/L)對體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞的增殖有抑制作用.當(dāng)賴氨酸的添加濃度為0.5～8 mmol/L，培養(yǎng)24 h，對原代奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用；而隨著賴氨酸濃度的增大(16～48 mmol/L)對體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞的增殖有抑制作用.因此，我們可以得出這樣的結(jié)論，厄爾平衡溶液中添加外源的賴氨酸能夠促進(jìn)細(xì)胞的增殖.這可能是因?yàn)?，賴氨酸作為其生長的營養(yǎng)素對其生長具有調(diào)節(jié)的作用，氨基酸過量供應(yīng)時的利用效率降低有關(guān)[25].從培養(yǎng)時間的作用結(jié)果如圖1所示，在最適濃度范圍內(nèi)12 h處理后的原代奶牛乳腺上皮細(xì)胞的增殖作用最強(qiáng)，這可能的原因是12 h內(nèi)作為原代奶牛乳腺上皮細(xì)胞對外源添加營養(yǎng)素的適應(yīng)階段，而隨著時間的延長及細(xì)胞生長代謝使得培養(yǎng)基的營養(yǎng)素濃度降低，對原代奶牛乳腺上皮細(xì)胞的增殖作用減弱.這與前人報道結(jié)果一致.Finil等[23]研究結(jié)果表明，賴氨酸作為外源添加的營養(yǎng)素對細(xì)胞增殖具有一定的作用.在小鼠骨細(xì)胞培養(yǎng)體系中添加賴氨酸0.587 mg/mL，結(jié)果表明與對照組(不添加賴氨酸)相比顯著增加了I型膠原質(zhì)、骨鈣蛋白的合成.同時Mercier等[24]指出，乳腺上皮細(xì)胞的數(shù)量很大程度上決定著乳蛋白的合成量.這都為我們進(jìn)一步研究賴氨酸對體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞乳蛋白合成的機(jī)制提供了依據(jù)，這同時也可以說明賴氨酸能夠通過增加奶牛乳腺上皮細(xì)胞的數(shù)量來對乳蛋白合成及分泌進(jìn)行調(diào)控.

4.2賴氨酸對mTOR信號通路介導(dǎo)酪蛋白合成相關(guān)基因表達(dá)的影響

Toerien C A通過體內(nèi)法研究了泌乳奶牛饑餓22 h后靜脈內(nèi)灌注氨基酸通過mTOR路徑調(diào)控乳蛋白合成，結(jié)果表明，乳腺組織中灌注必需氨基酸(EAA)增強(qiáng)了 mTOR靶點(diǎn)S6K的磷酸化，同時也促進(jìn)了乳蛋白的合成，EAA提高(P<0.05)或趨向于提高(P<0.1)乳腺內(nèi) mTOR的活性，這表明mTOR途徑能夠調(diào)控乳蛋白產(chǎn)量[4].楊金勇和來金良[1，26]利用qRT-PCR檢測體外培養(yǎng)乳腺組織中CSN1S1表達(dá)水平時也發(fā)現(xiàn)，當(dāng)在必需氨基酸的最適濃度范圍內(nèi)培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細(xì)胞，其賴氨酸的最佳濃度分別為197、57 μg/mL.這與Wu等[27]報道結(jié)果相一致.這為我們進(jìn)一步研究賴氨酸對體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞乳蛋白合成的機(jī)制提供了依據(jù).

本試驗(yàn)使用q RT-PCR方法分別檢測單一添加不同濃度賴氨酸對原代奶牛乳腺上皮細(xì)胞中乳蛋白基因表達(dá).結(jié)果表明，賴氨酸的濃度為0.5～16 mmol/L時，與未添加賴氨酸的陰性對照組(厄爾平衡溶液)相比，均顯著促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞CSN1S1、CSN1S2、CSN2和CSN3基因表達(dá)表達(dá)(P<0.01).但是不同水平賴氨酸處理對相同酪蛋白的基因促進(jìn)效果不同，當(dāng)賴氨酸濃度為0.5 mmol/L時，CSN1S1、CSN1S2和CSN2基因表達(dá)量最高；隨著賴氨酸濃度的增加則其基因表達(dá)量下降.這說明當(dāng)厄爾平衡溶液中賴氨酸的添加濃度為0.5～2 mmol/L時，酪蛋白基因的表達(dá)作用較強(qiáng).這和其他研究者文章中所述的“適宜濃度的氨基酸能夠促進(jìn)泌乳相關(guān)基因的表達(dá)”的結(jié)果一致.但從結(jié)果我們可以看出，無論添加多大濃度的賴氨酸，在影響乳蛋白合成的相關(guān)基因或與mTOR信號通路相關(guān)基因時，始終是陽性對照(厄爾平衡溶液+10%的胎牛血清)的作用最強(qiáng).這可能是因?yàn)樘ヅＱ逯羞€有細(xì)胞生長過程中所需的較全面的蛋白因子及其他一些生物活性物質(zhì)和營養(yǎng)物質(zhì)，這也可以說明氨基酸之間的互作作用或是氨基酸與其他營養(yǎng)素之間的互作作用使與泌乳相關(guān)基因的表達(dá)強(qiáng)于單個氨基酸的作用.

5結(jié)論

當(dāng)賴氨酸的添加濃度為0.5～2 mmol/L，對原代奶牛乳腺上皮細(xì)胞的增殖效果最佳.但隨著濃度的增加，會減少原代奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖的數(shù)量，達(dá)高濃度時甚至?xí)种?，這說明賴氨酸對原代奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖的影響具有劑量依賴性.不同的作用時間對原代奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖的影響不同，這說明賴氨酸對原代奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖的影響具有時效性，同樣賴氨酸對原代奶牛乳腺上皮細(xì)胞乳中酪蛋白的合成具有劑量依賴性，當(dāng)賴氨酸的添加濃度為0.5～2 mmol/L時，可以顯著地上調(diào)酪蛋白基因的表達(dá)并能調(diào)控與乳蛋白翻譯相關(guān)基因的表達(dá)，潛在影響乳蛋白的合成.

參考文獻(xiàn)

[1]楊金勇.蛋氨酸、賴氨酸及其二膚對奶牛乳腺上皮細(xì)胞酪蛋白以αs1基因表達(dá)的影響[D].杭州:浙江大學(xué)大學(xué)，2006

[2]Broderick G A,Stevnson M J,Patton R A,et al.Effect of supplementing rumen-protected methionine on production and nitrogen excretion in lactating dairy cows[J].Journal of Dairy Science,2008,91(3):1092-1102

[3]Socha M T,Putnam D E Garthwaite B D,et al.Improving intestinal amino acids supply of pre and postpartum dairy cows with rumen protected methionine and lysine[J].Journal of Dairy Science,2005,88(3):1113-1126

[4]Toerien C A,Trout D R,Cant J P.Nutritional stimulation of milk protein yield of cows is associated with changes in phosphorylation of mammary eukaryotic initiation factor 2 and ribosomal s6 kinase 1[J].Journal of Nutrition,2010,140(2):285-292

[5]Toerien C A,Cant J P.Abundance and phosphorylation state of translation in initiation factors in mammary glands of lactating and nonlactating dairy cows[J].Journal of Dairy Science,2007,90(6):2726-2734

[6]袁國鋮.不同類型日糧對泌乳奶牛乳腺組織胰島素通路及JAK-STAT信號通路的影響[D].蘭州:甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013

[7]German T,Barash I.Characterization of an epithelial cell line from bovine mammary gland[J].InVitroCellular and Developmental Biolology Animal,2002,38(5):282-292

[8]李喜艷.奶牛乳腺上皮細(xì)胞中賴氨酸蛋氨酸配比模式對酪蛋白合成的影響及機(jī)理研究[D].北京:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究，2011

[9]Liu H,Cao Z J,Wang L,et al.Responses of milk protein and mammary amino acids metabolism to duodenal soybean small peptides and free amino acids infusion in lactating goat[J].Journal of Animal and Feed Science，2010,19(S1):24-36

[10]Wu H H,Zhao X J,Zhang C Q,et al.Establishment of mammary tissue culture:an in vitro mode for bovine lactation[J].Journal of Animal and Feed Sciences,2004,13(1):575-578

[11]Wang C,Liu J X.Effects of ratio of lysine to methionine in metabolizable protein on lactation performance of dairy cows[C] // Proceeding of the 13th Animal Science Congress of the Asian- Australian of Animal Production Societies,2008,65

[12]Robinson P H,Fredeen A H,Chalupa W,et al.Ruminally protected lysine and methionine for lactating dairy cows fed a diet designed to meet requirements for microbial and postruminal protein[J].Journal of Dairy Science,1995,78(3):582-594

[13]王佳麗,高學(xué)軍,李慶章,等.蛋氨酸對體外培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細(xì)胞泌乳能力的影響[J].乳業(yè)科學(xué)與技術(shù),2012,35(1):8-10

[14]Singh K,Erdman R A,Swanson K M,et al.Epigenetic regulation of milk production in dairy cows[J].Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia,2010,15(1):101-112

[15]趙學(xué)軍.奶牛乳腺組織體外培養(yǎng)體系的建立及MET 對其酪蛋白αs1基因表達(dá)的影響[D].杭州:浙江大學(xué),2004

[16]Hu H,Wang J,Bu D,et al.Invitroculture and characterization of a mammary epithelial cell line from Chinese Holstein dairy cow[J].PLOS ONE,2009,4(11):e7636

[17]徐柏林.精氨酸對乳腺上皮細(xì)胞中酪蛋白合成的影響及其調(diào)控機(jī)制[D].揚(yáng)州:揚(yáng)州大學(xué)，2012

[18]Sigl T,Meyer H H D,Wiedemann S.Gene expression analysis of protein synthesis pathways in bovine mammary epithelial cells purified from milk during lactation and short‐term restricted feeding[J].Journal of animal physiology and animal nutrition,2014,98(1):84-95

[19]Hayashi A A,Nones K,Roy N C,et al.Initiation and elongation steps of mRNA translation are involved in the increase in milk protein yield caused by growth hormone administration during lactation[J].Journal of dairy science,2009,92(5):1889-1899

[20]胡菡,王加啟,李發(fā)弟,等.高溫誘導(dǎo)體外培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細(xì)胞的應(yīng)激響應(yīng)[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報,2011,19(2):287-293

[21]Livak K J,Schmittgen T D.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method[J].Methods,2001,25(4):402-408

[22]Ehmann V L,Peterson W D.To grow mouse mammary epithelial cell in culture[J].Journal of Cell Biology,1984,98(3):1026-1032

[23]Finil M,Torricellil P,Giavaresil G,et al.Effect of L-lysine and L-arginine on Primary osteoblast cultures from normal and osteopenic rats[J].Biomedicine & Pharmacotherapy,2001,55(4):213-220

[24]Mercier J C,P Gaye.Early events in secretion of main milk proteins:occurrence of precursors[J].Journal of Dairy Science,1982,65(2):299-316

[25]Raggio G,Pacheco D,Berthiaume R,et al.Effect of level of metabolizable protein on splanchnic flux of amino acids in lactating dairy cows[J].Journal of Dairy Science,2004,87(10):3461-3472

[26]來金良.必需氨基酸濃度對奶牛乳腺酪蛋白基因表達(dá)的影響[D]．杭州:浙江大學(xué)，2006

[27]Wu D M,Keller W L,Park C S.Lipotropes alter casein gene expression in bovine mammary acinar culture[J].Journal of Nutritional Biochemistry,1999,10(8):455-457

(責(zé)任編輯趙曉倩)

收稿日期：2014-07-15；修回日期：2014-10-29

基金項(xiàng)目：公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)項(xiàng)目“生鮮乳質(zhì)量安全評價技術(shù)與生產(chǎn)規(guī)程”(201403071)；國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(2011CB100805)；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(xiàng)資金(nycytx-04-01)；中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程(ASTIP-IAS12).

通信作者：王加啟，男，博士，研究員，博士生導(dǎo)師，主要從事反芻動物營養(yǎng)與牛奶質(zhì)量安全的研究.E-mail:wangjiaqinmqc@126.com

中圖分類號：S 823.9+1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1003-4315(2015)03-0007-09