MMP-14蛋白在胃癌侵襲轉(zhuǎn)移中的表達(dá)和作用

谷倬宇，李思源，肖智偉，周 婷，李 軍△

(1.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院；2.新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆石河子 832002)

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MMP-14蛋白在胃癌侵襲轉(zhuǎn)移中的表達(dá)和作用

谷倬宇1，李思源2，肖智偉1，周 婷1，李 軍1△

(1.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院；2.新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆石河子 832002)

目的 探討人胃癌組織中基質(zhì)金屬蛋白酶14(MMP-14)的表達(dá)及其與胃癌侵襲、轉(zhuǎn)移的關(guān)系。方法 采用免疫組化法檢測59份胃癌組織(觀察組)和20份正常胃組織(對照組，為經(jīng)病理證實(shí)距腫塊邊緣5cm的正常組織)中MMP-14的表達(dá)情況，并分析MMP-14與胃癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系，以及MMP-14在胃癌不同TNM分期中的表達(dá)特點(diǎn)。結(jié)果 觀察組胃癌組織中MMP-14的表達(dá)陽性率為50.85% (30/59)，對照組胃組織MMP-14表達(dá)陽性率為5.00% (1/20)，觀察組MMP-14表達(dá)陽性率明顯高于對照組(P<0.01)；MMP-14的表達(dá)水平與胃癌分化程度、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度、浸潤深度、淋巴管浸潤與否及TNM分期有關(guān)，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；隨著TNM分期的進(jìn)展MMP-14蛋白表達(dá)上調(diào)，且有從細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)的趨勢。結(jié)論 胃癌組織中存在MMP-14的高表達(dá)，有助于胃癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。

胃腫瘤；基質(zhì)金屬蛋白酶14；腫瘤浸潤；腫瘤轉(zhuǎn)移；免疫組織化學(xué)

胃癌是中國乃至世界上最常見的致死性惡性腫瘤之一，其惡性程度分別排在中國男性和女性的第3位和第4位[1-2]。胃癌患者的病死率極高，死因多是由于原發(fā)灶的術(shù)后轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)和周圍血管浸潤，其發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，研究證實(shí)溶解周圍基質(zhì)是該過程的關(guān)鍵生物學(xué)事件，而基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)可降解細(xì)胞基底膜(BD)和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)，是該過程中最重要的蛋白水解酶類，是腫瘤細(xì)胞向周圍浸潤的重要橋梁[3]。MMPs中跨膜的MMP-14蛋白，是惡性腫瘤入侵的關(guān)鍵蛋白[4-5]。本試驗(yàn)通過測定胃癌組織和正常胃組織中MMP-14的蛋白表達(dá)情況，分析MMP-14與胃癌臨床病理特征的關(guān)系，并探討其在不同胃癌組織TNM分期中的表達(dá)特點(diǎn)，旨在探討胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的相關(guān)機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科2012年1月至2013年5月經(jīng)10%甲醛固定和石蠟包埋的胃癌組織切片59份(觀察組)，經(jīng)病理專家驗(yàn)證距腫瘤邊緣5 cm的正常胃組織20份(對照組)。觀察組中男44例，女15例；年齡50～81歲，平均(60.41±7.21)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合WHO胃癌診斷標(biāo)準(zhǔn)；術(shù)前未行分子靶向治療、生物基因治療及放化療；由至少兩位病理專家共同閱片確診；臨床資料完整。

1.2 方法

1.2.1 抗體和試劑 MMP-14兔抗人多克隆抗體購自英國Abcam公司，免疫組化染色試劑盒SP9000及濃縮型DAB試劑盒購自北京中杉金橋生物有限公司。

1.2.2 免疫組化染色 4 μm的石蠟切片脫蠟水化后用新鮮配制的3%過氧化氫液體進(jìn)行室溫封閉，PBS清洗干凈后滴加正常山羊血清封閉液室溫封閉30 min，4 ℃滴加1∶100稀釋比例的一抗過夜，37 ℃復(fù)溫1 h后滴加生物素化二抗孵育半小時，依染色試劑盒說明書室溫滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記工作液，鏡下DAB顯色，蘇木素復(fù)染脫水后用中性透明樹膠封片。以PBS液代替一抗作為陰性對照。

1.2.3 結(jié)果判定 染色結(jié)果判定采用半定量分析法，在高倍鏡下隨機(jī)挑選5個視野，根據(jù)細(xì)胞染色強(qiáng)度計(jì)分：不著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。根據(jù)陽性細(xì)胞百分率計(jì)分：<5%為0分，5%～<25%為1分，25%～<50%為2分，50%～<75%為3分，≥75%為4分。兩項(xiàng)評分相乘：0～1分為陰性，>1分為陽性。

1.2.4 免疫組化圖像分析 隨機(jī)選取TNM分期中10個不同的視野，采用Image Pro Plus 6.0圖像檢測系統(tǒng)分析細(xì)胞染色結(jié)果，用平均光密度(OD)值表示MMP-14染色強(qiáng)度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，采用χ2檢驗(yàn)分析MMP-14與臨床病理特征的關(guān)系，采用方差分析和LSD檢驗(yàn)分析不同TNM分期的OD值。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 MMP-14在胃癌組織和正常胃組織中的表達(dá) MMP-14在正常胃組織中陰性表達(dá)(圖1A)，僅有極少數(shù)微弱表達(dá)。MMP-14在胃癌組織中的表達(dá)主要位于細(xì)胞質(zhì)，大多數(shù)呈中等或強(qiáng)陽性表達(dá)(圖1B)。觀察組MMP-14陽性表達(dá)率為50.85%(30/59)，顯著高于對照組5.00%(1/20)，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=11.32，P<0.01)。

圖1 對照組(A)及胃癌組(B)MMP-14的免疫組化染色結(jié)果(×100)

2.2 MMP-14表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系 胃癌浸潤程度越深、分化程度越低、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度越重、TNM分期進(jìn)展程度越晚，MMP-14表達(dá)的陽性率越高(P<0.01)，見表1。

2.3 MMP-14表達(dá)在胃癌不同TNM分期中的表達(dá)特點(diǎn) MMP-14在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)多位于細(xì)胞質(zhì)，隨著TNM分期進(jìn)展，開始出現(xiàn)細(xì)胞膜表達(dá)(圖2，箭頭為細(xì)胞膜陽性)。Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期的平均OD值分別為222.64±6.73、250.22±11.41、295.63±6.88，不同TNM分期的MMP-14表達(dá)強(qiáng)度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖3。

圖2 MMP-14在細(xì)胞膜陽性表達(dá)(×400)

臨床病理特征nMMP-14陽性χ2P分化程度 高、中22(37.29)4(18.18)12.970.00 低37(62.71)26(70.27)浸潤深度 T1～220(33.90)5(25.00)8.090.00 T3～439(66.10)25(64.10)

續(xù)表1 MMP-14表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

a：P<0.01，與Ⅱ期比較;b：P<0.01，與Ⅲ期比較。

圖3 MMP-14在不同TNM分期中的平均OD值比較

3 討 論

MMPs通過對ECM中各種成分的降解，在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中的作用十分關(guān)鍵，是一組重要的ECM降解酶類。大量研究表明，MMPs的高表達(dá)和多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[6-8]。MMP-14是MMPs家族的重要成員，又被稱為膜型MMP-1(MT1-MMP)，是第1個發(fā)現(xiàn)的具有跨膜序列的MMPs，MMPs的表達(dá)增加可以觸發(fā)級聯(lián)激活過程，致使細(xì)胞周圍的纖維蛋白溶解，這是腫瘤細(xì)胞侵襲的重要特征[9]。

國內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，MMP-14在胃癌組織中陽性表達(dá)率很高，并且MMP-14陽性表達(dá)組與陰性對照組相比更易發(fā)生區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[10]。國外研究顯示，胃癌組織和癌旁正常組織中MMP-14 蛋白表達(dá)的比值與淋巴轉(zhuǎn)移和腫瘤分期有關(guān)[11]，胃癌細(xì)胞中MMP-14表達(dá)下調(diào)后發(fā)生轉(zhuǎn)移的能力下降，增殖能力強(qiáng)、侵襲遷移能力高的腫瘤細(xì)胞MMP-14的表達(dá)明顯上調(diào)[12-13]。本研究胃癌組織中MMP-14蛋白表達(dá)陽性率為50.85%，與文獻(xiàn)報(bào)道接近[10]。本研究結(jié)果也證明了胃癌組織中MMP-14的陽性表達(dá)與胃癌的區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度、浸潤深度、TNM分期等密切相關(guān)，提示MMP-14在腫瘤的浸潤、轉(zhuǎn)移中起著舉足輕重的作用。近年來的研究發(fā)現(xiàn)上調(diào)非經(jīng)典Wnt通路中Wnt5a的表達(dá)，可使聚集增多的β-catenin與核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生作用，進(jìn)而激活靶基因誘導(dǎo)MMP-14表達(dá)[14-15]。此外NF-κB通路介導(dǎo)的環(huán)氧合酶-2的表達(dá)也可能是MMP-14的一個重要調(diào)控點(diǎn)[16]，而MMP-14表達(dá)相關(guān)的分子機(jī)制仍有待于進(jìn)一步的研究。

在侵襲轉(zhuǎn)移過程中，隨著腫瘤細(xì)胞與ECM相互作用并對其進(jìn)行重塑，MMP-14開始在細(xì)胞膜偽足處聚集，這種偽足是特殊的細(xì)胞膜突起，富含支架蛋白、肌動蛋白、胞吐復(fù)合體及各種酶類，是腫瘤入侵的首要區(qū)域[17]。本研究結(jié)果表明，隨著TNM分期進(jìn)展，MMP-14蛋白表達(dá)上調(diào)并開始出現(xiàn)細(xì)胞膜陽性，這不僅提示胃癌細(xì)胞的侵襲能力與MMP-14表達(dá)水平呈正相關(guān)，而且提示細(xì)胞內(nèi)存在某種運(yùn)動調(diào)控機(jī)制使MMP-14逐漸向細(xì)胞膜定向轉(zhuǎn)運(yùn)，進(jìn)而有助于胃癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移，但具體的胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制尚不明確。

綜上所述，胃癌組織中的MMP-14表達(dá)水平明顯增高，且胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵事件可能是通過影響MMP-14的表達(dá)和轉(zhuǎn)運(yùn)而增加胃癌的侵襲力，目前的研究結(jié)果提示，可以通過抑制MMP-14的作用進(jìn)而影響腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。因此，對MMP-14的深入研究將有助于對腫瘤治療提供新的治療前景，為臨床進(jìn)一步治療晚期惡性腫瘤提供新的思路。

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Expression and role of MMP-14 protein in invasion and metastasis of stomach carcinoma

GuZhuoyu1,LiSiyuan2,XiaoZhiwei1,ZhouTing1,LiJun1△

(1.FirstAffiliatedHospital,MedicalCollegeofShiheziUniversity,Shihezi,Xinjiang832002,China;2.KeyLaboratoryofXinjiangEndemicandEthnicDiseaseofMinistryofEducation,Shihezi,Xinjiang832002,China)

Objective To explore the expression of matrix metalloproteinase-14(MMP-14) protein in the human stomach carcinoma tissues and its correlation with carcinoma invasiveness and metastasis.Methods The MMP-14 protein expression was detected by immunohistochemistry in 59 cases of stomach carcinoma tissues (observation group) and 20 cases of normal stomach tissues (control group,the adjacent normal tissues from the tumor margin of 5 cm confirmed by pathology),and its correlation with the clinically pathological parameters was analyzed.The expression characteristics of MMP-14 among various TNM stages of stomach carcinoma were also analyzed.Results The positive rate of MMP-14 expression was 50.85%(30/59) in the observation group and 5.00% (1/20) in the control group,the positive rate of the observation group was significantly higher than that of the control group (P<0.01);the expression level of MMP-14 was correlated with the differentiation degree,regional lymph node metastasis degree,invasion depth,lymphatic invasion and TNM stage,which showing the statistical difference(P<0.01);the expression of MMP-14 protein was up-regulated and showed the transferring trend from cytoplasm to cellular membrane along with the progression of TNM stage.Conclusion The overexpression of MMP-14 protein exists in stomach carcinoma tissues,which contributing to the invasion and metastasis of stomach carcinoma cells.

stomach neoplasms;matrix metalloproteinase 14;neoplasm invasiveness;neoplasm metastasis;immunohistochemistry

谷倬宇(1989-)，在讀碩士研究生，主要從事消化系統(tǒng)腫瘤的診治研究?！?/p>

,Tel:18703093580;E-mail：xjlijun@163.com。

??·臨床研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.10.024

R

A

1671-8348(2015)10-1365-03

2014-10-08

2014-12-12)