miR-200c對舌癌Tca8113細胞增殖和凋亡的影響*

朱名毅，姚金光，劉 津，姜 艷△

(1.右江民族醫(yī)學(xué)院科學(xué)實驗中心，廣西百色 533000；2.右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，廣西百色 533000)

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miR-200c對舌癌Tca8113細胞增殖和凋亡的影響*

朱名毅1，姚金光2，劉 津2，姜 艷1△

(1.右江民族醫(yī)學(xué)院科學(xué)實驗中心，廣西百色 533000；2.右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，廣西百色 533000)

目的 探討miR-200c對人舌鱗狀細胞癌Tca8113細胞增殖和凋亡的影響。方法 將miR-200c的模擬物通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染到人舌鱗狀細胞癌Tca8113細胞內(nèi)，通過四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測細胞增殖能力、流式細胞術(shù)檢測細胞周期和細胞凋亡率、Westernblot檢測半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)和Bcl-2蛋白的表達。結(jié)果 與對照組相比，miR-200c模擬物20、40、80nmol/L組的Tca8113細胞生長受到明顯抑制，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，miR-200c模擬物的濃度越大，作用時間越長，抑制效果越明顯(P<0.05)；轉(zhuǎn)染miR-200c模擬物48h后，Tca8113細胞停滯于G0/G1期，細胞凋亡率顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；Westernblot證明20、40、80nmol/L組Bcl-2蛋白表達量明顯低于對照組，而Caspase-3蛋白表達量明顯高于對照組(P<0.05)。結(jié)論miR-200c過表達可抑制舌癌Tca8113細胞增殖并誘導(dǎo)細胞凋亡。

舌腫瘤；miR-200c；細胞增殖；細胞凋亡

微RNA(microRNA，miRNA)是近年來發(fā)現(xiàn)的一類由18-25個短寡核苷酸組成的內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA。miRNA廣泛存在于各種生物中，參與細胞的發(fā)育、分化、增殖、凋亡、遷移等多種生物學(xué)過程[1]。miRNA可作為癌基因或抑癌基因，與許多腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，目前的研究發(fā)現(xiàn)舌鱗癌中存在 miRNA 差異性表達，改變某些特異 miRNA 的表達水平，可影響舌癌的發(fā)生、發(fā)展[2-3]。miR-200c具有調(diào)節(jié)下游靶基因表達的作用，在腫瘤中miR-200c主要通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子的表達參與腫瘤轉(zhuǎn)移的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程[4-6]。很少有文獻報道m(xù)iR-200c在腫瘤細胞增殖、凋亡過程中的作用及其機制。本文通過體外將miR-200c模擬物轉(zhuǎn)染入舌癌細胞，上調(diào) miR-200c的表達，觀察其對舌癌細胞增殖、凋亡的影響，并檢測Bcl-2和Caspase-3蛋白表達的變化，分析其相關(guān)機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人舌鱗狀細胞癌Tca8113細胞株由廣西醫(yī)科大學(xué)鄺曉聰教師贈送。miRNA模擬物及其陰性對照由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成，miR-200c模擬物序列：5′-UAA UAC UGC CGG GUA AUG AUG GA-3′；miR-200c模擬物陰性對照序列：5′-UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT-3′；miRNA inhibitor negative control-FAM序列：5′-UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT-3′。RPMI 1640培養(yǎng)液和胎牛血清購自美國HYCLONE公司。Opti-MEMⅠ培養(yǎng)液和LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒購自美國Invitrogen公司。四甲基偶氮唑鹽(MTT) 和細胞周期檢測試劑盒購自美國sigma公司，細胞凋亡檢測試劑盒購自BD公司，二甲基亞砜(DMSO)購自上海生工生物工程公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)和瞬時轉(zhuǎn)染 將舌鱗癌細胞株Tca8113復(fù)蘇后，接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，加入含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液，置于培養(yǎng)箱中(37 ℃、5%CO2)常規(guī)培養(yǎng)，選擇對數(shù)生長期細胞用于實驗。轉(zhuǎn)染前1 d，選擇生長狀態(tài)良好的Tca8113細胞，用100 μL無抗生素RPMI 1640培養(yǎng)液按3×103每孔的濃度接種到96孔板，24 h后細胞濃度為50%～70%時進行轉(zhuǎn)染實驗。其具體步驟為：先用12.50 μL Opti-MEM Ⅰ稀釋miRNA模擬物；再將0.25 μL Lipofectamine 2000加入到12.50 μL Opti-MEM Ⅰ中，室溫靜止5 min；然后把二者混勻，室溫放置20 min；最后把混合液全部均勻加入到96孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后換成含血清和抗生素的RPMI 1640培養(yǎng)液進行后續(xù)實驗。將羧基熒光素(caboxyfluorescein，F(xiàn)AM)標(biāo)記的miR-200c陰性對照轉(zhuǎn)染到Tca8113細胞中，細胞常規(guī)培養(yǎng)24 h后，在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率。

1.2.2 MTT法檢測miR-200c對Tca8113細胞增殖的影響 為了解miR-200c模擬物(mimics)、轉(zhuǎn)染試劑以及背景效應(yīng)之間的差異，以排除非序列特異性的效應(yīng)，本研究在預(yù)實驗中設(shè)計了3組對照：(1)空白對照組(A組)；(2)脂質(zhì)體試劑對照組(B組)；(3)miR-200c模擬物陰性對照組(C組)。Tca8113細胞接種于96孔板后，在同樣的實驗條件下，先觀察以上3組細胞之間生長情況，證實它們對細胞的生長沒有明顯影響，后續(xù)的實驗中均以B組作為對照組。實驗組分為20、40、80 nmol/L組，按上述轉(zhuǎn)染方法分別將終濃度為20、40、80 nmol/L的miR-200c模擬物轉(zhuǎn)染Tca8113細胞，常規(guī)孵育24、48、72 h后，棄培養(yǎng)液，每孔加入質(zhì)量濃度5 g/L的MTT溶液20 μL繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，洗凈該鹽，每孔加入150 μL DMSO，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。每組細胞設(shè)5個平行孔，重復(fù)3次實驗。用酶標(biāo)儀測量各孔的吸光度值(A值)，以細胞增殖率反映細胞增殖情況，細胞增殖率=轉(zhuǎn)染細胞A值/對照細胞A值×100%。

1.2.3 流式細胞術(shù)檢測miR-200c對細胞周期的影響 Tca8113細胞轉(zhuǎn)染miR-200c模擬物48 h后，對常規(guī)胰酶消化、離心收集轉(zhuǎn)染后的細胞，用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，之后加入2倍體積的預(yù)冷70%乙醇于4 ℃固定過夜，第2天PBS洗滌2次后，加500 μL PBS(含100 μg/mL RNaseA，50 g/mL溴化乙錠)，于4 ℃避光孵育30 min，200目篩網(wǎng)過濾后上機檢測細胞周期，實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.2.4 流式細胞術(shù)檢測miR-200c對細胞凋亡的影響 Tca8113細胞轉(zhuǎn)染miR-200c模擬物48 h后，以適量胰酶消化，離心收集轉(zhuǎn)染后的細胞，用PBS洗滌細胞2次，用500 μL Binding Buffer調(diào)整細胞濃度為(1～5)×105個/mL，向重懸液中加入5 μL Annexin V-FITC 染色，隨后加入5 μL碘化丙啶(PI)染色，室溫下避光孵育 15 min，流式細胞儀檢測凋亡率，實驗重復(fù) 3 次。

1.2.5 Western blot檢測miR-200c對細胞Bcl-2和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase-3)蛋白表達的影響 Tca8113細胞轉(zhuǎn)染miR-200c模擬物48 h后，常規(guī)胰酶消化，離心收集轉(zhuǎn)染后的細胞，加入適量含有苯甲基磺酰氟(PMSF)的細胞裂解液于冰上裂解細胞，提取總蛋白，用蛋白濃度測定試劑盒進行蛋白定量。15%聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，電轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜。37 ℃下用10%脫脂奶粉封閉1 h，分別加入Bcl-2、Caspase-3抗體，4 ℃冰箱過夜孵育，洗膜后加入二抗，室溫孵育2 h，洗膜后加入增強化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑曝光、顯影，以β-actin為內(nèi)參。將膠片掃描后，用Image Pro PLUS 7.0軟件分析Bcl-2、Caspase-3和β-actin的灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參照β-actin的比值為目的蛋白的相對表達量。

2 結(jié) 果

2.1miR-200c轉(zhuǎn)染效率的觀察FAM標(biāo)記的miR-200c陰性對照轉(zhuǎn)染Tca8113細胞24h后，在熒光顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)大部分細胞均含有熒光，轉(zhuǎn)染效率可達到90%以上。

2.2miR-200c對Tca8113細胞增殖的影響Tca8113細胞經(jīng)轉(zhuǎn)染miRNA-200c模擬物后，細胞增殖比未轉(zhuǎn)染的細胞明顯減緩。轉(zhuǎn)染24h時，40、80nmol/L組miRNA-200c模擬物對細胞生長抑制與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；轉(zhuǎn)染48、72h時，3組不同濃度miRNA-200c模擬物對細胞生長抑制與對照組比較，均差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，miRNA-200c模擬物的濃度越大，其抑制效果越明顯，見圖1。

a：P<0.05，與對照組比較。

圖1miR-200c對Tca8113細胞增殖的影響

2.3 流式細胞術(shù)檢測miR-200c對細胞周期和凋亡的影響 與對照組比較，實驗組miR-200c模擬物可以使G0/G1期細胞比例增加、S期細胞比例減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；miR-200c模擬物還可以使細胞的凋亡率明顯增加，且miR-200c模擬物濃度越大，凋亡率越高(P<0.05)，見表1。

表1 各組細胞周期和凋亡情況比較

a：P<0.05，與對照組比較。

2.4miR-200c對Tca8113細胞Bcl-2和Caspase-3蛋白表達的影響 以對照組組目的蛋白/β-actin的比值為1，Westernblot法檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-200c模擬物48h后，隨著miR-200c模擬物濃度增加，20、40、80nmol/L組細胞Bcl-2蛋白相對表達量遞減，細胞Caspase-3蛋白相對表達量遞增，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 各組細胞Bcl-2和Caspase-3蛋白表達比較

a：P<0.05，與對照組比較。

3 討 論

研究表明舌癌具有獨特的miRNA表達譜，miRNA的表達改變在舌癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。李莎莎等[7]學(xué)者采用RT-qPCR和原位雜交法檢測發(fā)現(xiàn)miR-21在舌鱗癌細胞及組織標(biāo)本中都呈高表達；舌鱗癌分化程度越低，miR-21表達越高；miR-21表達與患者生存期呈負關(guān)；miR-21高表達患者的預(yù)后較低表達者差。Jia等[8]學(xué)者認為miR-195的低表達與舌鱗癌大小和臨床分期有關(guān)，同時miR-195的低表達還能降低患者的生存時間；增加miR-195在舌癌細胞SCC-15和CAL27中的表達，可以抑制細胞增殖，促進細胞凋亡，與降低周期素D1(CyclinD1)和Bcl-2的表達有關(guān)。miR-200c是miR-200家族成員之一，近年來許多研究表明，miR-200c在頭頸部腫瘤、乳腺癌、胰腺癌、腎癌膀胱癌和肝癌等腫瘤中呈低表達[9]。miR-200c參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和耐藥等過程，miR-200c在肺癌患者血清中呈低表達，高表達miR-200c會降低肺癌患者的生存時間；miR-200c也能通過靶向作用蛋白鋅指E盒結(jié)合同源盒蛋白1/2(ZEB1/2)，上調(diào)E-鈣黏蛋白的表達，從而抑制腫瘤轉(zhuǎn)移過程中的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程；此外miR-200c不但能提高腫瘤細胞對藥物的敏感性，也能增加腫瘤細胞對化療藥物的耐藥性[10]。王晟[11]發(fā)現(xiàn)miR-200c在高度惡性乳腺癌細胞株和乳腺癌標(biāo)本中呈低表達，過表達乳腺癌細胞株的miR-200c，可以下調(diào)G13信號通路、突觸傳遞信號通路、神經(jīng)沖動傳遞信號通路和細胞內(nèi)代謝負調(diào)控信號通路等基因的表達，還發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮素受體A(EDNRA)可能是miR-200c的調(diào)控靶點。本研究通過MTT實驗檢測發(fā)現(xiàn)舌癌Tca8113細胞轉(zhuǎn)染miR-200c模擬物，上調(diào)miR-200c的表達，可抑制細胞的增殖；miR-200c模擬物濃度越大，對細胞增殖的抑制率越高。流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，miR-200c能夠使G0/G1期細胞增多，而S期細胞減少，從而抑制舌癌細胞的生長。

Bcl-2家族的表達和調(diào)控是影響細胞凋亡的關(guān)鍵因素之一，bcl-2基因家族包括促進凋亡基因如bax等和抑制凋亡的基因如bcl-2等，過表達bcl-2或下調(diào)bax可抑制腫瘤細胞凋亡[12-13]。細胞凋亡的過程也就是Caspase酶被激活，引起“瀑布式”級聯(lián)反應(yīng)，對底物進行切割，降解DNA修復(fù)酶，使染色體、細胞骨架和核蛋白等裂解成小片段，最終導(dǎo)致細胞死亡[14]。Bcl-2能夠通過抑制細胞色素C的釋放，從而阻斷Caspase斷裂重要的細胞內(nèi)基質(zhì)，細胞凋亡信號逐級放大，激活的Caspase-3介導(dǎo)細胞死亡[15]。本研究還發(fā)現(xiàn)，miR-200c模擬物轉(zhuǎn)染舌癌Tca8113細胞后，細胞凋亡率顯著增加，而且與miR-200c模擬物濃度呈正相關(guān)。Western-blot結(jié)果顯示Bcl-2蛋白表達水平下降，而Caspase-3蛋白表達水平增高，說明上調(diào)Tca8113細胞中miR-200c的表達，可以降低Bcl-2的表達，從而激活Caspase-3酶的活性，促進細胞凋亡。

綜上所述，上調(diào)舌癌細胞中miR-200c的表達后，Tca8113細胞增殖水平明顯受到抑制，流式細胞術(shù)檢測顯示G0/G1期細胞增加，細胞凋亡率也明顯增加，Western-blot結(jié)果顯示細胞Bcl-2蛋白表達水平降低，Caspase-3活化增強。本實驗初步證明miR-200c可以作為舌癌的一種抑癌基因，能夠降低與抗凋亡相關(guān)基因Bcl-2的表達，通過激活Caspase-3的活化從而抑制舌癌細胞增殖促進其凋亡。針對miR-200c的治療策略可能會給舌癌的治療提供新的思路和治療靶點。

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Effects of miR-200c on proliferation and apoptosis of tongue carcinoma Tca8113 cells*

ZhuMingyi1,YaoJinguang2,LiuJin2,JiangYan1△

(1.MedicalScientificExperimentalCenter,YoujiangMedicalUniversityforNationalities,Baise,Guangxi533000,China;2.AffiliatedHospitalofYoujiangMedicalUniversityforNationalities,Baise,Guangxi533000,China)

Objective To investigate the effects of miR-200c on proliferation and apoptosis of tongue squamous cell carcinoma (TCCS) Tca8113 cells.Methods The mimics of miR-200c were transfected into Tca8113 cells using liposome.The Tca8113 cell proliferation was detected by 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay.The flow cytometry assay was used to determine the cell cycle and the apoptosis rate of Tca8113 cell.The protein expression levels of Bcl-2 and Caspase-3 in Tca8113 cell was detected by Western-blot.Results The 20,40,80 nmol/L miR-200c mimics groups inhibited the growth of Tca8113 cells,the difference compared with the control group showing statistical significance(P<0.05).The greater the miR-200c mimics concentration and the longer duration of action,the more significant the inhibition effect(P<0.05).After 48h transfecting by miR-200c mimics,the Tca8113 cells were arrested in the G0/G1phases of cell cycle,and the apoptosis rate of the miR-200c mimics groups was significantly increased,the difference compared with the control group showing statistical significance(P<0.05);Western blot verified that the expression amount of Bcl-2 protein in the 20,40,80 nmol/L miR-200c groups was significantly lower than that in the control group,while the expression amount of Caspase-3 protein was significantly higher than that in the control group(P<0.05).Conclusion The overexpression of miR-200c might inhibit the proliferation of Tca8113 cell and induces their apoptosis.

tongue neoplasms;miR-200c;cell proliferation;apoptosis

??·基礎(chǔ)研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.10.009

廣西高等學(xué)?？蒲匈Y助項目(201204LX329)；右江民族醫(yī)學(xué)院科研資助項目[右醫(yī)科字(2011)1號]。 作者簡介：朱名毅(1982-)，講師，碩士研究生，主要從事腫瘤分子生物學(xué)研究。△

，Tel：(0776)2837119；E-mail：jiangyan19852005@126.com。

R

A

1671-8348(2015)10-1322-03

2014-10-30

2014-12-18)