柔肝通絡(luò)湯預(yù)處理對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠腦保護(hù)作用*

龍華君　周慎　伍大華　劉雨　唐燕

（1.湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，湖南長(zhǎng)沙410006；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南長(zhǎng)沙410007）

·研究報(bào)告·

柔肝通絡(luò)湯預(yù)處理對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠腦保護(hù)作用*

龍華君1周慎1伍大華1劉雨2唐燕2

（1.湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，湖南長(zhǎng)沙410006；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南長(zhǎng)沙410007）

目的觀察柔肝通絡(luò)湯對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的影響。方法將SD大鼠分為柔肝通絡(luò)湯高、中、低劑量組和空白對(duì)照組、假手術(shù)組、模型組。采用線栓法復(fù)制大鼠局灶性腦缺血/再灌注損傷（MCAO）模型，分別觀察缺血再灌注后3、6、12、24、48 h神經(jīng)學(xué)評(píng)分及再灌24 h腦梗死面積。結(jié)果柔肝通絡(luò)湯能夠明顯改善模型動(dòng)物的神經(jīng)病學(xué)癥狀，縮小腦梗死面積。柔肝通絡(luò)湯各劑量組的神經(jīng)功能缺損評(píng)分及梗死灶面積均低于模型組（P＜0.05）。結(jié)論柔肝通絡(luò)湯在防治大鼠腦缺血再灌注損傷方面具有腦保護(hù)作用。

柔肝通絡(luò)湯腦缺血再灌注腦梗死面積神經(jīng)功能評(píng)分

腦血管疾病是導(dǎo)致全球人口死亡的三大疾病之一，嚴(yán)重危害人類健康。腦缺血再灌注損傷是指腦缺血恢復(fù)血液灌注后，腦細(xì)胞損傷反而進(jìn)行性加重。柔肝通絡(luò)湯是基于中風(fēng)腎虛血瘀病機(jī)，以益腎生髓、活血通絡(luò)立法而創(chuàng)制的方劑，從肝腎治腦，腎腦同治，在治療腦缺血再灌注損傷方面療效顯著［1-2］。本研究探討了柔肝通絡(luò)湯對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷中神經(jīng)功能的保護(hù)作用。現(xiàn)報(bào)告如下。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康雄性SD大鼠176只，體質(zhì)量為250～300 g，鼠齡為18月。由湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供。

1.2藥物柔肝通絡(luò)湯由制何首烏15 g，桑椹15 g，枸杞子30 g，丹參30 g，葛根30 g，當(dāng)歸尾10 g，赤芍10 g，地龍10 g，山楂15 g組成。藥材購(gòu)自湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，經(jīng)鑒定為道地藥材。一煎加水500 mL，煎汁150 mL；二煎加水300 mL，煎汁150 mL；取2次煎汁混合，文火煎，成膏狀（含生藥2 g/mL），冷藏備用。

1.3試劑與儀器紅四氮唑（TTC）：購(gòu)自上海鈺博生物科技有限公司。水合氯醛：分析純，購(gòu)自天津市科密歐化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心。恒溫水?。汉现嗅t(yī)藥大學(xué)免疫組化教研室提供。

1.4分組及給藥將176只大鼠先按體質(zhì)量大小分層，再采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分成6組，其中空白對(duì)照組16只，假手術(shù)組16只，模型對(duì)照組36只，柔肝通絡(luò)湯低、中、高劑量組各36只。假手術(shù)及空白組取2只大鼠、模型組及柔肝通絡(luò)湯組取6只大鼠用于再灌注24 h的TTC染色。以50 kg成人每日服用柔肝通絡(luò)湯劑（生藥材含量165 g）為劑量參照標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行換算［3］，柔肝通絡(luò)湯低、中、高劑量組每日灌胃柔肝通絡(luò)湯劑分別為7、14、28g/kg生藥含量，相當(dāng)于50kg人等效劑量的0.5倍、1倍、2倍。藥物質(zhì)量濃度均按大鼠1.4 mL/100 g灌胃容量用蒸餾水配制。空白對(duì)照組、假手術(shù)組與模型組灌胃0.9%氯化鈉注射液1.4 mL/100 g。每日1次，連續(xù)7 d，最后1次于術(shù)前30 min給予。

1.5模型制備采用改良Longa［4］法制作大鼠大腦中動(dòng)脈堵塞（MACO）模型，假手術(shù)組栓線插入深度在15 mm以內(nèi)，此深度不足以阻斷大腦中動(dòng)脈，其余步驟與模型組相同。術(shù)中室溫保持在25～30℃，100 W白熾燈照明維持肛溫（37.5±0.5）℃。術(shù)后消毒皮膚單籠飼養(yǎng)觀察，自由飲食。

1.6標(biāo)本采集與檢測(cè)1）神經(jīng)學(xué)評(píng)分：缺血再灌注動(dòng)物模型蘇醒后，在再灌注3、6、12、24、48 h時(shí)間點(diǎn)，按照Longa［4］神經(jīng)功能缺損評(píng)分法進(jìn)行評(píng)分：無(wú)神經(jīng)損傷癥狀為0分；不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪為1分；向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈為2分；向?qū)?cè)傾倒3分；不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失為4分。2）TTC染色及腦梗死面積的測(cè)定：缺血2 h再灌注24 h時(shí)，各組大鼠用10%水合氧醛（0.35 mL/ 100 g）腹腔注射深度麻醉后固定大鼠，暴露心臟。鉗夾住腹主動(dòng)脈及下腔靜脈，用磨鈍的10號(hào)針頭刺入左心室，先快速滴入0.9%氯化鈉注射液約100 mL，后斷頭取腦，腦組織置于-20℃冰箱約15 min后，去除嗅球、小腦和低位腦干。每個(gè)腦組織切成5個(gè)連續(xù)冠狀切片（片厚2 mm），迅速置于1%TTC染液中，37℃避光水浴15 min，每間隔5 min將切片翻動(dòng)1次。染色后的正常組織為玫瑰紅色，梗死組織為白色。將每組腦片排列整齊，拍照保存，應(yīng)用圖像分析軟件統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算腦梗死面積百分比。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。計(jì)量資料以（±s）表示，采用單因素方差分析。P＜0.05為差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

表1　各組大鼠各時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較（±s）

表1　各組大鼠各時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較（±s）

與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與假手術(shù)組比較，△P＜0.01。下同。

組別n空白對(duì)照組10假手術(shù)組10模型組30再灌注24h時(shí)再灌注48h時(shí)0 0 0 0 2.83±0.41△2.67±0.82△柔肝通絡(luò)湯高劑量組301.17±0.41*1.33±0.52*1.50±0.55*2.00±0.63*1.67±0.82*柔肝通絡(luò)湯中劑量組301.33±0.52*1.50±0.552.00±1.102.33±0.821.67±0.52*柔肝通絡(luò)湯低劑量組301.33±0.84*1.83±0.752.17±0.412.50±0.552.33±1.03再灌注3h時(shí)再灌注6h時(shí)再灌注12h時(shí)000 000 2.00±0.63△2.17±0.75△2.33±0.82△

2.1各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較見(jiàn)表1。模型組與柔肝通絡(luò)湯高、中、低劑量組大鼠均出現(xiàn)神經(jīng)功能障礙，假手術(shù)組及空白組大鼠未見(jiàn)明顯神經(jīng)學(xué)功能損傷。再灌注24 h各組神經(jīng)功能缺損評(píng)分最高，神經(jīng)功能受損最嚴(yán)重，再灌注48 h時(shí)神經(jīng)功能缺損評(píng)分開(kāi)始降低。與假手術(shù)組比較，模型組各時(shí)間點(diǎn)大鼠均表現(xiàn)出嚴(yán)重的神經(jīng)缺損癥狀（P＜0.01）。與模型組相比，柔肝通絡(luò)湯高劑量組各時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能得到了顯著改善（P＜0.05），柔肝通絡(luò)湯中劑量組在再灌注3 h和再灌注48 h神經(jīng)功能改善作用最好（P＜0.05），柔肝通絡(luò)湯低劑量組在再灌注3 h時(shí)顯著改善神經(jīng)功能（P＜0.05）。2.2各組大鼠腦梗死面積比較見(jiàn)表2，圖1。TTC染色結(jié)果顯示：梗死區(qū)主要位于大腦中動(dòng)脈供血的額頂葉、基底節(jié)區(qū)等部位。應(yīng)用圖像分析軟件統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算腦梗死面積百分比，發(fā)現(xiàn)除空白對(duì)照組與假手術(shù)組外，各組均呈大小不同的梗死灶。柔肝通絡(luò)湯低、中、高劑量能顯著減少梗死面積，與模型組相比，柔肝通絡(luò)湯各劑量組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。

表2　各組大鼠再灌24 h時(shí)腦梗死面積比較（±s）

表2　各組大鼠再灌24 h時(shí)腦梗死面積比較（±s）

與空白對(duì)照組比較，▲P＜0.01。

組別n空白對(duì)照組2假手術(shù)組2模型組6腦梗死面積（%）00 25.13±2.18△柔肝通絡(luò)湯高劑量組613.66±4.53**柔肝通絡(luò)湯中劑量組614.76±3.47**柔肝通絡(luò)湯低劑量組621.25±1.42*

圖1　各組大鼠腦梗死面積比較

3　討論

缺血性腦卒中占全部腦卒中的60%～80%［5］，腦血管病的預(yù)防和治療已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)外醫(yī)學(xué)工作者和醫(yī)學(xué)研究的重要課題。雖然中醫(yī)藥在降低缺血性腦卒中的致殘率、恢復(fù)神經(jīng)功能方面雖有較好的療效，但對(duì)運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)及語(yǔ)言等多項(xiàng)神經(jīng)功能損傷的恢復(fù)差異較大［6-8］。探求恢復(fù)受損神經(jīng)功能的方法和藥物是最為理想化的治療。

近年來(lái)的研究認(rèn)為，缺血中風(fēng)的病理基礎(chǔ)是：虛、風(fēng)、熱、痰、瘀、毒［9］?？偠灾瑹o(wú)非虛實(shí)二端，中風(fēng)之虛主要責(zé)之于肝腎陰虛，中風(fēng)之實(shí)主要?dú)w咎于瘀血［10］。雖然中風(fēng)病位在腦髓血脈，但實(shí)質(zhì)上與肝、腎等臟腑有聯(lián)系，肝腎虧虛是中風(fēng)病的基本病機(jī)。肝腎同源，補(bǔ)肝即補(bǔ)腎，而腎為先天之本，即是補(bǔ)腎法治療中風(fēng)病的理論依據(jù)。髓海有病，其本在腎，所以治腎亦即治腦［11］。故腎虛血瘀是缺血性中風(fēng)發(fā)病的重要的病理機(jī)制之一。有研究表明，補(bǔ)腎方藥有顯著的腦細(xì)胞保護(hù)作用，該方以補(bǔ)腎培元立法，佐以活血、化痰、通絡(luò)、泄毒之品，可以促進(jìn)急性期患者神經(jīng)功能的恢復(fù)，尤其對(duì)起病即有虛證表現(xiàn)的患者效果更加明顯［12-13］。故治療缺血中風(fēng)在活血化瘀的同時(shí)，要補(bǔ)肝生血，補(bǔ)腎生髓，標(biāo)本兼顧，使精髓旺，血絡(luò)活，瘀血散，神竅通。根據(jù)肝腎同源、從腎治腦、腎腦同治理論遣藥組方而成的柔肝通絡(luò)湯經(jīng)臨床應(yīng)用證實(shí)可明顯改善腦卒中患者的神經(jīng)功能，提高臨床療效，降低致殘率，提高生活質(zhì)量［1-2］。方中制首烏、桑椹、枸杞子滋補(bǔ)肝腎之陰，丹參、當(dāng)歸尾、赤芍活血化瘀，葛根、地龍逐瘀通絡(luò)，山楂逐瘀化痰，全方共奏益腎生髓、活血通絡(luò)之功效。

本研究結(jié)果顯示柔肝通絡(luò)湯高、中、低量組均能降低神經(jīng)功能評(píng)分，縮小腦梗死面積。筆者發(fā)現(xiàn)，在改善腦缺血再灌注后各時(shí)間點(diǎn)的神經(jīng)功能損傷以及縮小腦梗死面積方面，柔肝通絡(luò)湯高劑量組效果最為顯著，提示柔肝通絡(luò)湯具有對(duì)抗腦缺血再灌注損傷的作用，形成腦保護(hù)。該方雖在臨床取得滿意的療效，實(shí)驗(yàn)研究也表明其能有效減少腦缺血再灌注大鼠模型腦梗死面積和神經(jīng)功能缺損癥狀，但該方通過(guò)何種機(jī)制形成腦保護(hù)還待進(jìn)一步研究。

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The Effect of Rougan Tongluo Decoction Pretreated on the MCAO Model of Rats

LONG Huajun，ZHOU Shen，WU Dahua，et al.Affiliated Hospital of Traditional Chinese Medicine Research Institute in Hunan Province，Hunan，Changsha 410006，China

Objective：To investigate the effect of Rougan Tongluo Decoction on cerebral ischemia/reperfusion injury in rats.Methods：The experimental rats were divided into high，medium and low dose group and blank control，sham operation group and model group.The Focal cerebral ischemia/reperfusion injury（MCAO）model in rats was made by using suture-occluded method to observe Neurological score at 6h，12h，3h，24h，48h and Cerebral infarct size at 24 h after ischemia reperfusion.Results：Rougan Tongluo Decoction can obviously improve the animal models of neurological symptoms and Reduce infarction area.The Rougan Tongluo Decoction group's neurological deficit score and infarct size were lower than model group（P＜0.05）.Conclusion：Rougan Tongluo Decoction has a protective effect on preventing cerebral ischemia/reperfusion injury in rats.

Rougan Tongluo Decoction；Cerebral ischemia/reperfusion；Cerebral infarct size；Neurological score

R285.5

A

1004-745X（2015）09-1520-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.09.005

2015-04-12）

湖南省中醫(yī)藥科研計(jì)劃項(xiàng)目（2013110）；湖南省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2014SK3053）