IL-31RA基因敲除小鼠純合子模型的建立*

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IL-31RA基因敲除小鼠純合子模型的建立*

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2015-03-19網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20150319.0956.015.html

江濤， 高婧， 岳歡， 高雅倩， 黃俊瓊**

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院， 貴州 遵義563000)

[摘要]目的： 建立IL-31RA基因敲除小鼠純合子模型，為IL-31RA基因相關(guān)研究提供動(dòng)物模型。方法： IL-31RA基因敲除小鼠嚴(yán)格按照SPF級(jí)要求的動(dòng)物飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行飼養(yǎng)繁殖，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)法鑒定子代小鼠的基因型，RT-PCR法鑒定小鼠IL-31RA mRNA的表達(dá)，Western blot鑒定IL-31RA蛋白的表達(dá),HE染色觀察小鼠重要臟器的形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果： PCR法成功檢測(cè)出子代小鼠的3種基因型，純合子基因敲除小鼠未檢測(cè)出IL-31RA mRNA和IL-31RA蛋白的表達(dá)，IL-31RA基因敲除小鼠的重要臟器的形態(tài)學(xué)特征與野生型小鼠比較無(wú)明顯變化；基因敲除小鼠可成功飼養(yǎng)繁殖，亦可獲得較多的基因敲除純合子小鼠。結(jié)論： 成功構(gòu)建了IL-31RA基因敲除小鼠純合子模型。

[關(guān)鍵詞]白細(xì)胞介素31； 基因敲除； 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)； 反轉(zhuǎn)錄PCR； Western blot； 模型，動(dòng)物

白細(xì)胞介素31(Interleukin 31,IL-31)是2004年Dillon等發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子，屬于白細(xì)胞介素6細(xì)胞因子家族成員，主要由活化的CD4+Th2細(xì)胞產(chǎn)生。IL-31受體(IL-31R)是由IL-31RA與制瘤素M受體B(oncostatin M receptor B, OSMRB)組成的異源二聚體，在皮膚及支氣管上皮組織中表達(dá)水平較高。國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)IL-31及其受體與皮膚損傷、禿發(fā)癥、搔癢、特應(yīng)性皮炎、氣道超敏反應(yīng)及炎癥性腸病等疾病相關(guān)，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)IL-31及其受體在過(guò)敏性哮喘小鼠肺組織中表達(dá)增高，IL-31可誘導(dǎo)肺組織分泌趨化因子。為進(jìn)一步研究IL-31在過(guò)敏性哮喘中的作用，本研究成功構(gòu)建并鑒定出IL-31RA基因敲除小鼠純合子模型，報(bào)告如下。

1材料與方法

1.1　材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物IL-31RA基因敲除小鼠品系為C57BL/6J,4周齡，6雄2雌，購(gòu)自突變小鼠區(qū)域資源中心(MMRRC)，在遵義醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)與生物學(xué)研究中心繁殖擴(kuò)群。

1.1.2主要試劑Premix Taq(TaKaRa TaqTMVersion 2.0 plus dye)(TaKaRa公司)，DL 500 Marker，GoldView，動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒(上海生工)，總RNA提取試劑盒(天根生物)，引物由上海生工合成,DEPC(Sigma公司),兔抗鼠IL-31RA抗體、HRP標(biāo)記羊抗兔IgG抗體(北京博奧森公司) , 化學(xué)發(fā)光試劑及硝酸纖維素膜(GE公司)。

1.2　方法

1.2.1基因敲除小鼠雜合子模型由MMRRC進(jìn)行設(shè)計(jì)及完成?；蚯贸^(guò)程簡(jiǎn)述如下：IL-31RA基因組克隆來(lái)源于129SvEvBrd基因組文庫(kù)，構(gòu)建一個(gè)替換型載體替換IL-31RA的第4外顯子，即IL-31RA基因組序列(MGI:2180511)中8093-8172堿基，共80 bp；采用電穿孔法將此打靶載體轉(zhuǎn)入C57BL/6J小鼠胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)，經(jīng)G418 篩選得到陽(yáng)性克隆的ES細(xì)胞，并將此ES細(xì)胞植入假孕的C57BL/6J小鼠子宮內(nèi)，發(fā)育得到雜合子的IL-31RA基因敲除小鼠。所有小鼠均飼養(yǎng)在遵義醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)與生物學(xué)研究中心的屏障系統(tǒng)(SPF)小鼠飼養(yǎng)室，飼料購(gòu)自重慶第三軍醫(yī)大學(xué)生產(chǎn)的SPF級(jí)小鼠飼料【生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(渝)2012-0004】，飲用水為消毒純凈水，小鼠所接觸物品均高壓預(yù)真空滅菌。小鼠的性成熟期約35 d，妊娠期約20 d，采用雄雌鼠各1只合籠繁殖。

1.2.2基因敲除小鼠的鑒定因引進(jìn)的IL-31RA基因敲除小鼠均為雜合子，繁殖出的子代可出現(xiàn)野生型(Wild-type，WT)IL-31RA+/+、雜合子IL-31RA+/-及突變型(Knockout，KO)IL-31RA-/-3種表型，對(duì)子代IL-31RA基因敲除小鼠作為模型需先鑒定其基因型。IL-31RA基因敲除小鼠基因組DNA的提?。杭羧⌒∈笪舶湍┒思s0.6 cm，按說(shuō)明書(shū)操作抽提DNA，雙蒸水溶解， 4 ℃保存。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)及瓊脂糖凝膠電泳鑒定IL-31RA基因敲除小鼠子代基因型：按照參考文獻(xiàn)設(shè)計(jì)引物，WT上游系列為5′-GGGTGTGAACGCTGGAATAATG-3′、KO上游系列為5′-GCAGCGCATCGCCTTCTATC-3′(含有插入的neo基因序列，可鑒定插入的載體片段)、共用下游引物系列為5′-GATCATCTCTCCAAATTTACATG-3′。WT型目的片段長(zhǎng)274 bp，KO型目的片段長(zhǎng)348 bp。反應(yīng)體系(25 μL):Premix Taq 12.5 μL, WT和KO上游及下游引物各1 μL，模板DNA 2 μL，加滅菌蒸餾水補(bǔ)足體積。循環(huán)條件為95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s、60 ℃退火 30 s， 30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。4 ℃保存?zhèn)溆?。PCR 反應(yīng)終產(chǎn)物5 μL進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定IL-31RA基因敲除小鼠子代基因型，判斷標(biāo)準(zhǔn)為WT型和KO型分別在274 bp與348 bp處出現(xiàn)單一的目的條帶，雜合子則在274 bp和348 bp處同時(shí)出現(xiàn)目的條帶。

1.2.3IL-31RA基因敲除小鼠IL-31RA mRNA的鑒定采用RT-PCR法，IL-31RA基因敲除小鼠總RNA的提取及cDNA的合成：取已經(jīng)鑒定的WT及KO小鼠肺組織，按照總RNA提取試劑盒操作說(shuō)明書(shū)抽提RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。逆轉(zhuǎn)錄體系(20 μL)：5×Prime ScriptTMBuffer 4 μL，Prime Script TM RT Enzyme Mix I 1 μL，Oligo dT Primer(50 μM) 1 μL， Random 6 mers(100 μM) 1 μL，Total RNA 10 μL，RNase Free dH2O補(bǔ)足體積。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：37 ℃，15 min；85 ℃，5 s； cDNA放于-20 ℃保存。PCR反應(yīng)及瓊脂糖凝膠電泳鑒定mRNA，設(shè)計(jì)及合成含有IL-31RA基因第4號(hào)外顯子的基因序列引物，上游系列為5′-TCATTTCTCAGCGTCAGTGG-3′、下游系列為5′-TCCTTCTCTGGTCTCCAAGTG-3′；擴(kuò)增的目的基因片段長(zhǎng)為389 bp。 反應(yīng)體系(25 μL):Premix Taq 12.5 μL,上、下游引物各1 μL，模板cDNA 2 μL，滅菌蒸餾水補(bǔ)足體積。反應(yīng)條件： 94 ℃預(yù)變性2 min； 94 ℃變性30 s、61 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s， 30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。4 ℃保存?zhèn)溆?。取PCR反應(yīng)終產(chǎn)物5 μL進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定小鼠IL-31RA mRNA。

1.2.4IL-31RA基因敲除小鼠IL-31RA蛋白的鑒定采用Western Blot法，提取已經(jīng)鑒定的KO及WT小鼠肺組織蛋白質(zhì),蛋白定量后以4∶1比例與Buffer混合，100 ℃水浴6 min，常規(guī)行SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜,用封閉液 (含50 g/L脫脂奶粉的TBST)室溫振搖封閉2 h。依次加入兔抗鼠IL-31RA抗體及 HRP標(biāo)記羊抗兔IgG,化學(xué)發(fā)光法曝光顯色, 觀察結(jié)果。

1.2.5IL-31RA基因敲除對(duì)小鼠重要臟器的影響臟器系數(shù)測(cè)定:頸椎脫臼法處死小鼠，稱量小鼠體重及臟器(心臟、肝臟、腎臟、肺、胸腺及脾臟)的重量，臟器系數(shù)=100×臟器重量(g)/體重(g)。HE染色：心臟、肝臟、腎臟、肺、胸腺及脾臟于4%多聚甲醛中固定48 h后，常規(guī)石蠟切片，HE染色。在顯微鏡下觀察各個(gè)臟器的形態(tài)學(xué)變化。

1.3　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2結(jié)果

2.1　IL-31RA基因敲除小鼠的生長(zhǎng)繁殖情況

IL-31RA基因敲除小鼠(IL-31RA-/-)能成功繁殖(已繁殖5代)，子代小鼠生長(zhǎng)狀況良好(已觀察1年零6個(gè)月)。小鼠約35 d性成熟，性周期為4～5 d，妊娠期約20 d，哺乳期約20 d，每胎產(chǎn)仔數(shù)為7～12只，成活率>98%。

2．2　IL-31RA基因敲除小鼠基因型鑒定

小鼠基因型的鑒定結(jié)果如圖1，其中1、2號(hào)小鼠為野生型(IL-31RA+/+)，僅出現(xiàn)274 bp條帶；3號(hào)小鼠為雜合子(IL-31RA+/-)，同時(shí)出現(xiàn)274 bp 和348 bp 2個(gè)條帶，4、5號(hào)小鼠為突變型(IL-31RA-/-)，僅出現(xiàn)1個(gè)348 bp條帶。

圖1　IL-31RA基因敲除小鼠基因型鑒定Fig.1　Identification results of genotype of IL-31RA gene knockout mice

2.3　IL-31RA基因敲除小鼠IL-31RA mRNA的鑒定

RT-PCR結(jié)果示W(wǎng)T小鼠(1、2號(hào))檢測(cè)出389 bp處的條帶，而KO小鼠(3、4、5號(hào))未檢測(cè)出。見(jiàn)圖2。

圖2　小鼠IL-31RA mRNA的RT-PCR鑒定Fig.2　Identification results of IL-31RA mRNA of the mice

2.4　IL-31RA基因敲除小鼠IL-31RA蛋白鑒定

Western Blot結(jié)果示IL-31RA基因敲除小鼠IL-31RA蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量為83 kDa，WT小鼠檢測(cè)到相對(duì)分子量約為83 kDa片段，KO小鼠未檢出。見(jiàn)圖3。

圖3　小鼠IL-31RA蛋白的Western Blot鑒定Fig.3　Identification results of IL-31RA protein of the mice

2.5　L-31RA基因敲除小鼠重要臟器系數(shù)及HE染色

純合子IL-31RA基因敲除小鼠與野生型間各臟器的臟器系數(shù)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1；兩者間形態(tài)學(xué)也無(wú)明顯改變，見(jiàn)圖4。

表1　L-31RA基因敲除小鼠心臟、肝臟、腎臟、

圖4　小鼠各臟器的HE染色結(jié)果(×200)Fig.4　HE staining results of each organ of mice

3討論

IL-31的功能包括調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖分化，調(diào)節(jié)造血和免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子和趨化因子分泌，參與調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，是重要的炎癥因子。IL-31可誘導(dǎo)皮膚炎癥，刺激表皮角質(zhì)細(xì)胞分泌趨化因子、巨噬細(xì)胞炎性蛋白3β、胸腺活化調(diào)節(jié)的趨化因子、T細(xì)胞活化蛋白-3[4-6]。Lei Z 等發(fā)現(xiàn)過(guò)敏性哮喘患者血清IL-31和外周血單核細(xì)胞IL-31mRNA均明顯高于正常對(duì)照組，Shah SA等研究發(fā)現(xiàn)IL-31可上調(diào)氣道上皮細(xì)胞黏液素基因MUC5AC的表達(dá)；IP WK等采用IL-31在體外刺激人支氣管上皮細(xì)胞，通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、上皮生長(zhǎng)因子(EGF)表達(dá)增高；Stott B 等[10]發(fā)現(xiàn)IL-31可由IL-4誘導(dǎo)表達(dá)，可以促進(jìn)Th2型炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)促炎基因的表達(dá)。Liu W等[11]研究發(fā)現(xiàn)兒童過(guò)敏性鼻炎(AR)伴有哮喘患者血清和鼻灌洗液中IL-31mRNA和IL-31比正常對(duì)照組及單純患AR組顯著增高，并且增高趨勢(shì)與Th2細(xì)胞因子及黏蛋白5AC(MUC5AC)的表達(dá)一致。近年，越來(lái)越多的國(guó)內(nèi)外研究證實(shí)IL-31在氣道過(guò)敏性疾病中發(fā)揮重要作用，有望成為該疾病的診斷和(或)監(jiān)測(cè)指標(biāo)。

IL-31在過(guò)敏性哮喘中發(fā)揮重要作用，但其具體機(jī)制尚不清楚?；蚯贸∈蠹夹g(shù)是建立在同源重組理論基礎(chǔ)上的一種技術(shù)，借助細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)、和動(dòng)物胚胎學(xué)的方法，使小鼠體內(nèi)某種基因的功能缺失，是闡明該基因功能最直接的手段之一，因此基因敲除技術(shù)成為后基因組時(shí)代最重要的研究方法和內(nèi)容[12]。本研究采用同源重組的方法敲除小鼠IL-31RA基因包含在編碼信號(hào)肽的基因序列內(nèi)外顯子4，使IL-31RA失去功能，通過(guò)觀察IL-31RA基因敲除小鼠生長(zhǎng)繁殖情況，發(fā)現(xiàn)IL-31RA基因敲除小鼠與野生型小鼠具有一樣的生長(zhǎng)繁殖能力，并且IL-31RA基因敲除對(duì)小鼠的重要臟器沒(méi)有明顯影響。雜合子小鼠交配后子代可能出現(xiàn)WT、KO及雜合子3種基因型，故必須對(duì)它們進(jìn)行基因型鑒定。本研究采用PCR法對(duì)4周齡基因敲除小鼠進(jìn)行基因型篩選，進(jìn)一步采用RT-PCR法及Western Blot法對(duì)篩選出的WT、KO小鼠進(jìn)行IL-31RA mRNA及IL-31RA蛋白的表達(dá)進(jìn)行鑒定，結(jié)果證明成功構(gòu)建了IL-31RA基因敲除小鼠的純合子模型，該模型的成功構(gòu)建，為更好的探討IL-31-IL-31R信號(hào)在過(guò)敏性哮喘中的作用提供了一個(gè)很好的動(dòng)物模型。

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(2015-01-08收稿，2015-02-27修回)

中文編輯： 吳昌學(xué)； 英文編輯： 周凌

·基礎(chǔ)研究·

Establishment of IL-31RA Gene Knockout Homozygous Mice Model

JIANG Tao, GAO Jing, YUE Huan, GAO Yaqian, HUANG Junqiong

(TheAffiliatedHospitalofZunyiMedicalCollege,Zunyi563000,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To establish the IL-31RA gene knockout homozygous mice model and lay the foundation for further study on IL-31 gene. Methods: IL-31RA gene knockout mice were bred and reproduced according to the SPF class animal feeding standard. PCR was used to identify the genotype of the offspring, the expression of IL-31RA mRNA was detected by RT-PCR, expression of IL-31RA protein was detected by Western blot, and morphological changes of vital organs were observed by HE staining. Result: Three genotypes of the offspring of IL-31RA gene knockout mice were successfully identified; expression of IL-31RA mRNA and IL-31RA protein was not detected in IL-31RA gene knockout homozygous mice. Compared with the wild type mice, morphological characteristics of vital organs of had no significant changes in IL-31RA gene knockout homozygous mice. IL-31RA gene knockout mice could be dred and reproduced successfully. Conclusion: The IL-31RA gene knockout homozygous mice model has been successfully established.

[Key words]interleukin 31; gene knockout; polymerase chain reaction; reverse transcription-PCR; Western blot; model, animal

[中圖分類號(hào)]R-332

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1000-2707(2015)03-0229-05

通信作者**E-mail:junqiongh@aliyun.com

[基金項(xiàng)目]*國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No:81260266)； 貴州省優(yōu)秀科技教育人才省長(zhǎng)專項(xiàng) (No：黔省專合字200951)