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    子宮內膜異位癥與TNF-β G252A 基因的相關性研究

    2015-04-28 02:04:26余鴻標姚吉龍
    貴州醫(yī)科大學學報 2015年3期
    關鍵詞:異位癥多態(tài)性基因型

    余鴻標,姚吉龍

    (1.深圳市羅湖醫(yī)院 婦科,深圳 羅湖 518000;2.深圳市婦幼保健院 婦科,深圳 福田 518000)

    子宮內膜異位癥(endometriosis,Ems)是一種生育期婦女常見的疾病,指腺體和間質等子宮內膜組織在子宮肌層以外的位置出現(xiàn)生長和浸潤,可導致痛經乃至不孕,發(fā)生率為10%~15%[1-2]。Ems具有明顯的家族聚集性,患者的直系親屬患病率是無家族史患者的6 ~7 倍[3]。有研究證實腫瘤壞死因子(TNF)與其它促血管生成因子之間的相互作用能夠共同促進新血管生成,而血管的建立和維持是Ems 發(fā)生、發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。腫瘤壞死因子β(TNF-β)是體內T 細胞產生的淋巴毒素,基因位于HLA-β 和HLA-C2 之間,與MHC 基因及TNF-α 基因緊密連鎖[4]。TNF-β 基因+252 位點的等位基因G/A 位于第1 啟動子,與限制性內切酶的識別密切相關,是TNF-β 基因上最主要的多態(tài)性位點。本研究通過測定TNF-β 基因+252 位點的基因多態(tài)性和血清中TNF-β 的含量,分析Ems 與TNF-β G252A 基因之間的關系。

    1 材料與方法

    1.1 一般資料

    2013 年7 月~2014 年7 月經腹腔鏡和病理確診的Ems 患者80 例作為Ems 組,根據(jù)參考文獻[5]進行分期,其中Ⅰ~Ⅱ期45 例,Ⅲ~ Ⅳ期35例;21 ~40 歲,平均(30.15±5.25)歲。需經腹腔鏡等手段排除Ems 的適齡婦女80 例作為對照組,22 ~41 歲,平均(30.17±5.20)歲。全部受試者間均為無血緣關系,飲食結構相似,兩組受試者基礎資料比較,差異無統(tǒng)計學意義(P >0.05)。排除糖尿病疾病、腫瘤、甲狀腺肝腎功能不全及嚴重營養(yǎng)不良并使用過激素治療的患者。

    1.2 方法

    1.2.1 TNF-β 的含量測定[6]全部受試者均采用腹腔鏡在空腹時抽取靜脈血3 mL,3 500 r/min 離心10 min 后收集上清,分2 ~3 管置-70 ℃保存。采用TNF-β 酶聯(lián)免疫試劑盒(購自上海森雄科技實業(yè)有限公司)按照說明檢測血清中TNF-β 含量,每份標本做2 個副孔孔。

    1.2.2 TNF-β G252A 位點多態(tài)性檢測[7]采用酚-氯仿法提取白細胞中的DNA[8],設計并合成(大連寶生物工程有限公司)PCR 引物[11]。TNF-β G252A 上游引物為5'-CCGTGCTTCGTGCTTTGGACTA-3',下游引物為5'-AGAGCTGGTGGGGACATGTCTG-3'。PCR 體系50 μL(含10×緩沖液6 μL,2 mol/μL 的dNTP 3 μL,上、下游引物濃度0.4 mol/L,基因組DNA 0.1 μg,Taq DNA 聚合酶2U)。循環(huán)條件:94 ℃預變性5 min,94 ℃30 s、60 ℃30 s、72 ℃1 min,35 個循環(huán),72 ℃延伸5 min。結果判定:出現(xiàn)555 bp、185 bp 兩條帶為G 等位基因純合子(TNF-β 1/1 型);555 bp、185 bp、740 bp 3 條帶為G/A 雜合子(TNF-β 1/2 型);僅出現(xiàn)740 bp一條帶為A 等位基因純合子(TNF-β 2/2 型)。

    1.3 統(tǒng)計學處理

    數(shù)據(jù)使用SPSS 13.0 統(tǒng)計軟件分析,計量資料采用均數(shù)±標準差表示,兩樣本均數(shù)比較采用t 檢驗,計數(shù)資料采用率(%)表示,比較采用χ2檢驗,P <0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結果

    2.1 血清TNF-β 含量與EMT 分期的相關性

    Ems 組血清中TNF-β 含量明顯高于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P <0.05);Ems 組Ⅲ、Ⅳ期患者血清TNF-β 含量明顯高于Ⅰ、Ⅱ期患者,差異有統(tǒng)計學意義(P <0.05);見表1。Ems 組血清中TNF-β 的含量與EMT 分期之間正相關(r=0.853 2)。

    表1 子宮內膜異位癥組與對照組血清TNF-β 含量Tab.1 The levels of TNF-β in Ems group and the control group

    2.2 TNF-β G252A 位點多態(tài)性及分布

    PCR 擴增結果顯示Ems 組和對照組均檢出TNF-β G252A 位點G/A 突變。TNF-β G252A 多態(tài)位點不同基因型如圖1 的電泳圖譜所示。兩組間各基因型分布差異有統(tǒng)計學意義(P <0.05),A/A基因型及G/A 基因型頻率在Ems 組中均高于對照組。而A/A 基因型患內異癥的危險度是G/G 基因型的3.5 倍。見表2。

    圖1 TNF-β G252A 位點擴增產物電泳結果Fig.1 Electrophorersis results of PCR product of TNF-β G252 gene

    表2 Ems 組與對照組TNF-β G252A 位點基因型頻率Tab.2 Comparison of genotypic frequencies of TNF-β 252 gene between Ems group and control group

    3 討論

    Ems 是一類良性腫瘤,但具有能夠侵襲轉移和復發(fā)的特點。對于TNF 基因與Ems 之間的關系,學說眾多卻均無定論。因此,探明其中的關系,對于Ems 的診斷、治療及預后方面將有重大意義[1-2]。

    本研究中,實驗組血清中測得TNF-β 含量顯著高于對照組(P <0.05),實驗組Ⅲ、Ⅳ期明顯高于Ⅰ、Ⅱ期(P <0.05),實驗組血清中TNF-β 的含量與EMT 分期之間正相關(r=0.853 2)。這可能是因為TNF 是重要的血管生成因子,可促進內膜異位灶的血管形成和盆腔粘連[5]。在Ems 早期TNF-β 可誘導產生多種細胞因子如IL-1、IL-6 等炎癥介質調控并促使種植灶中新生血管的生長、分化,最終形成內異癥病灶。過量的TNF 又可降低機體的免疫狀態(tài),使得Ems 進一步發(fā)生、發(fā)展。因此,會伴隨著Ems 病情的加重,患者體內血清中TNF-β 的濃度會逐步增高。

    此外,兩組間各基因型分布差異有統(tǒng)計學意義(P <0.05),A/A 基因型及G/A 基因型頻率在實驗組中均高于對照組。而A/A 基因型患Ems 的危險度是G/G 基因型的3.5 倍。說明等位基因A 將使Ems 的患病概率明顯增加,與張良等[9]的報道一致,但與車坤蘭等[10]報告的實驗組和對照組間無差異結果不同。主要原因在于單一基因對Ems發(fā)病的作用,更多的受到了種族、生存環(huán)境、飲食習慣等因素的影響,探究多基因同疾病的關系更具借鑒意義。

    綜上,Ems 患者血清中TNF-β 的含量與EMT的分期呈正相關,A/A 基因型是患Ems 的危險基因型。但是由于單一基因對Ems 發(fā)病的作用會受到了種族、生存環(huán)境、飲食習慣等因素的影響,同時存在研究樣本量偏少等問題,需要進一步加大樣本量研究。

    [1]朱琳,顏士杰,沙玉成.血清和腹腔液中CA125,TNF-α 與子宮內膜異位癥患者的相關性研究[J].中國婦幼保健,2014(8):1196-1198.

    [2]焦路陽,郭慶合,魯廣建.血清TNF-α,IL-6 與IL-8在子宮內膜異位癥中的檢測及意義[J].現(xiàn)代預防醫(yī)學,2012(17):4540-4540.

    [3]陳海霞.TNF-β 基因A252G 位點多態(tài)性及其在血漿和組織中表達與淋巴瘤關系的研究[D].新疆醫(yī)科大學,2012.

    [4]Steff AM,G agne D,Page M,et al.Serum concentrations of insulin-like growth factor-1,soluble tumor necrosis factor receptor-1 and angiogenin in endometriosis patients[J].Am J R eprod Immuno,2004(2):166-173.

    [5]吳佩蔚.子宮內膜異位癥不孕患者血清IL-6 及TNF-α水平變化研究[J].中國婦幼保健,2013(10):1644-1646.

    [6]羅敏,何援利,彭冬先,等.子宮內膜異位癥患者血清TNF-α 和TNF-β 的測定[J].中南大學學報,2005(3):304-306.

    [7]陳曉,王宇學.實時熒光定量RT-PCR 法檢測TNFαmRNA 基因表達[J].現(xiàn)代檢驗醫(yī)學雜志,2006(4):13-15.

    [8]宋潔云,劉芳宏,馬軍,等.酚/氯仿法和鹽析法提取人類外周血基因組DNA 方法的比較[J].中國實驗診斷學,2013(5):802-805.

    [9]張良,奚慶華,鞠少卿.腫瘤壞死因子β 基因多態(tài)性與江蘇子宮內膜異位癥患者的相關性研究[J].醫(yī)學檢驗與臨床,2008(6):10.

    [10]車坤蘭,羅程,何鳳儀,等.子宮內膜異位癥與腫瘤壞死因子TNFα-308G/A 和TNFβG252A 基因多態(tài)性的關系[J].解剖學研究,2010(1):21-24.

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