荔波少數(shù)民族人群HBV感染與ESRα基因Pvu Ⅱ和T29C位點基因多態(tài)性研究*

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荔波少數(shù)民族人群HBV感染與ESRα基因PvuⅡ和T29C位點基因多態(tài)性研究*

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2015-03-19網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20150319.0943.010.html

左婭**， 何燕***， 趙孝梅， 張婷， 王嬋娟， 禹文峰， 官志忠

(貴陽醫(yī)學院 分子生物學重點實驗室, 貴州 貴陽550004)

[摘要]目的： 了解貴州荔波少數(shù)民族人群雌激素受體(ESRα)基因PvuⅡ位點和T29C位點多態(tài)性與乙型肝炎病毒 (HBV)易感性的關(guān)系。方法： 選取貴州荔波縣少數(shù)民族健康對照91例和HBsAg攜帶者80例，采用聚合酶鏈式反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性 (PCR-RFLP)方法測定受檢者基因組中ESRα基因PvuⅡ和T29C位點多態(tài)性，分析兩位點多態(tài)性與HBV易感性的關(guān)系。結(jié)果： 在荔波少數(shù)民族健康對照組和HBsAg攜帶組中均檢出ESRα基因PvuⅡ和T29C位點3種基因型，但3種基因頻率和等位基因頻率在兩組間分布差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結(jié)論： ESRα基因的PvuⅡ和T29C基因多態(tài)性與荔波少數(shù)民族人群中乙肝感染無關(guān)。

[關(guān)鍵詞]少數(shù)民族； 基因，雌激素受體； 乙型肝炎； 攜帶者； 感染； 多態(tài)性； 貴州荔波

全球約有4億人為乙型肝炎病毒 (HBV)攜帶者，每年約有25萬人死于慢性肝炎、肝硬化和肝細胞癌[1-3]。HBV感染的慢性化是一個多因素的結(jié)果，除與HBV的變異、宿主的年齡、性別和免疫狀態(tài)等有關(guān)外，機體遺傳基因的多態(tài)性可能也是導致HBV感染慢性化的另一個重要原因[4]。雌激素主要通過與雌激素受體α(estrogen receptora，ESRα)結(jié)合發(fā)揮作用[5-7]，而ESRα基因突變會導致雌激素功能的下降，引起HBV感染人群不同的遺傳易感性[8]，貴州是一個多民族省份，少數(shù)民族人口眾多，且大多聚居于較封閉偏遠的山區(qū)，形成了遺傳學上相對隔離的人群。選用這樣相對封閉的隔離自然人群作為研究對象，可以最大限度的排除基因流(gene flow)現(xiàn)象對該人群等位基因頻率、基因型頻率的影響，對多基因疾病研究具有獨特的優(yōu)勢。

1對象與方法

1.1　研究對象

按照知情同意原則，隨機對貴州省荔波縣少數(shù)民族進行問卷調(diào)查和抽樣分析，根據(jù)乙肝血清標志物、肝功能指標及HBV病毒DNA定量結(jié)果分別選取健康對照91例，男性45例，女性46例，(47.8±1.57)歲；HBsAg攜帶者80例，男性41例，女性39例，(48.5±1.42)歲。所選的研究對象3代內(nèi)無族外通婚史，彼此間無直接血緣關(guān)系 ，性別、年齡匹配 ，無乙型肝炎疫苗接種史。

1.2　全血DNA提取與定量

采用Qiagen公司的FlexiGene DNA提取試劑盒提取全血DNA；紫外吸收法測定DNA濃度，并標化DNA模板濃度為100 mg/L。

1.3　ESRα基因PvuⅡ和T29C多態(tài)性位點基因擴增

采用聚合酶鏈式反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性 (PCR-RFLP)法，根據(jù)GenBank中ESRα基因PvuⅡ和T29C多態(tài)性位點的基因序列，設(shè)計PvuⅡ多態(tài)位點引物，上游系列為5′-TCTCCCACCTCAGCCTTAC-3′，下游系列為5′-ACCAATGCTC ATCCCAAC-3′，擴增產(chǎn)物長為448 bp。參照文獻[9] 設(shè)計T29C多態(tài)位點引物，上游系列為5′- GACCATGACCCTCCACACCAAAGGA TC-3′，下游系列為5′-ACCGTAGACCTGCGCGTTG-3′，擴增產(chǎn)物長218 bp。引物由上海生物工程技術(shù)有限公司合成。反應(yīng)采用Touch-down PCR法： 94 ℃變性40 s、62 ℃退火50 s(每個循環(huán)降低0.5 ℃)、72 ℃延伸40 s，擴增14個循環(huán)后改為94 ℃變性40 s、55 ℃退火50 s、72 ℃延伸40 s繼續(xù)20個循環(huán)。PCR擴增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4　PCR產(chǎn)物的酶切

ESRα基因PvuⅡ、T29C位點 PCR產(chǎn)物分別以限制性核酸內(nèi)切酶PvuⅡ、MspⅠ酶切，37 ℃恒溫水浴過夜，酶切產(chǎn)物用2.0%瓊脂糖凝膠電泳分離、鑒定。

1.5　統(tǒng)計學方法

以Hardy-Weinberg平衡吻合度檢驗確定對照組遺傳平衡狀況，根據(jù)PCR-RFLP結(jié)果確定樣本的基因型，用直接計數(shù)法計算基因型頻率和等位基因頻率；SPSS 19.0統(tǒng)計軟件的χ2檢驗分析各基因型在2組人群中的分布。

2結(jié)果

2.1　ESRα 基因PvuⅡ和T29C位點

PCR-RFLP結(jié)果顯示ESRα基因PvuⅡ位點的擴增產(chǎn)物長度為448 bp，每例樣本的目的條帶清晰，適于后續(xù)PCR產(chǎn)物的PvuⅡ酶切反應(yīng)。若ESRα基因PvuⅡ位點未發(fā)生突變，為野生型CC，不產(chǎn)生酶切位點(僅見448 bp片段)；若由野生型C突變成T，為突變型TT片段中產(chǎn)生酶切位點，酶切后觀察到380 bp、68 bp為突變型TT，觀察到448 bp、380 bp、68 bp 3個片段為雜合型CT；因 68 bp片段較小不易觀察，故不作為觀察項(見圖1)。ESRα基因T29C位點的擴增產(chǎn)物長度218 bp，每例樣本的目的條帶清晰，適于后續(xù)PCR產(chǎn)物的MspⅠ酶切反應(yīng)。ESRα基因T29C位點若為野生型TT，無MspⅠ酶切位點(僅見218 bp)；若由野生型T突變成C，片段中產(chǎn)生MspⅠ酶切位點，酶切后可為突變型CC(觀察到192 bp、26 bp 2個片段)、或雜合型TC(觀察到218 bp、192 bp、26 bp 3個片段)；因 26 bp片段較小不易觀察，故不作為觀察項。見圖1。

注：ESRα基因T29C位點結(jié)果為 1、2、3、4，1為PCR擴增產(chǎn)物，2-4為酶切產(chǎn)物，2為野生型TT，3為突變型CC，4為雜合型TC；ESRα基因 PvuⅡ位點結(jié)果為5、6、7、8，5為PCR擴增產(chǎn)物，6-8為酶切產(chǎn)物，6為野生型CC，7為突變型TT，8為雜合型CT圖1　ESRα基因PvuⅡ和T29C位點PCR擴增產(chǎn)物和酶切產(chǎn)物電泳圖Fig.1　Electrophoresis of PCR amplification products and enzyme digestion products of PvuⅡ and T29C loci of ESR gene

2.2　HBV感染與ESRα 基因PvuⅡ和T29C位點的基因型頻率和等位基因頻率

ESRα基因PvuⅡ和T29C位點基因型頻率和等位基因頻率在貴州少數(shù)民族健康對照組和HBsAg攜帶組中的分布差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1，表2。

表1　HBV感染與ESRα基因PvuⅡ多態(tài)性

表2　HBV感染與ESRα 基因T29C位點多態(tài)性

3討論

雌激素受體是存在于靶器官的細胞內(nèi)、可與激素發(fā)生特異性結(jié)合而形成激素-受體復合物、是使激素發(fā)揮其生物學效應(yīng)的一種蛋白質(zhì)分子，至今發(fā)現(xiàn)的ESR有ESRα和ESRβ兩種亞型。人體中ESRα基因定位于第6號染色體短臂的第2區(qū)5號帶中的第1亞帶，由140 kb堿基構(gòu)成，編碼595個氨基酸的蛋白質(zhì)，包括8個外顯子和7個內(nèi)含子[10]。ESR不同的基因型有可能決定不同個體間 ESR的表達水平與功能差異，從而影響到病原體對宿主的易感性。1993年，駱抗先等[11]對中國7個民族的HBV感染調(diào)查發(fā)現(xiàn)HBsAg具有較高的陽性率，且這些民族間HBV感染存在差異。2006年，謝建萍等[12]研究發(fā)現(xiàn)，ESRα基因PvuⅡ位點多態(tài)性與HBV感染后疾病進展密切相關(guān)；2009年，郜玉峰等[13]的研究顯示ESRα基因PvuⅡ位點C/T基因型和C等位基因可能是乙型肝炎病毒感染慢性化的遺傳易感基因。也有大樣本研究發(fā)現(xiàn)，ESRα基因T29C位點基因多態(tài)性與HBV持續(xù)性感染相關(guān)[13]；對甘肅地區(qū)人群的ESRα基因T29C位點基因多態(tài)性與HBV感染轉(zhuǎn)歸的研究結(jié)果也顯示，ESRα基因T29C位點TT 基因型和T等位基因可能是HBV感染慢性化的遺傳易感基因[14]。但本次研究結(jié)果卻顯示ESRα基因PvuⅡ和T29C位點基因多態(tài)性的分布在貴州荔波少數(shù)民族HBV感染組和健康對照組中差異無統(tǒng)計學意義，這與單可人等[15]對貴州彝族ESRα基因T29C基因型分布與 HBV 感染研究結(jié)果一致，提示不同民族和城鄉(xiāng)區(qū)域中ESRα基因PvuⅡ和T29C位點的分布存在差異，ESR基因PvuⅡ和T29C位點基因多態(tài)性在HBV感染的發(fā)生發(fā)展中起主要作用還是輔助作用，或是協(xié)同作用，又或是ESR基因多態(tài)性是否真正與HBV感染密切相關(guān)，尚有待于進一步大樣本的研究證實。

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(2015-01-09收稿，2015-02-25修回)

中文編輯： 吳昌學； 英文編輯： 周凌

Study on Association ofESRαPvuⅡ and T29C Gene Polymorphism

with Susceptibility to Hepatitis B Virus Infection in Libo

Minority Population of Guizhou Province

ZUO Ya, HE Yan, ZHAO Xiaomei, ZHANG Ting,WANG Chanjuan, YU Wenfeng， GUAN Zhizhong

(TheKeyLaboratoryofMolecularBiology,GuiyangMedicalCollege,Guiyang550004,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: Analysis on the correlation of the polymorphism of estrogen receptor (ESRα) gene PvuⅡ and T29C loci with hepatitis B virus (HBV) infection in Libo minority population of Guizhou province. Methods: Polymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) technique was used to analyze the polymorphism of PvuⅡ and T29C loci in 91 healthy controls and 80 HBsAg carriers, the correlation of these two loci with susceptibility to HBV was analyzed. Results: Three genotypes of ESRα PvuⅡand T29C loci were detected in both control group and HBsAg group. Between two groups, the three kinds of gene frequency and allele frequency distribution showed no statistical difference (P>0.05). Conclusions: The PvuⅡ and T29C loci gene polymorphism of ESR is not associated with HBV susceptibility in Libo minority nationality.

[Key words]ethnic minorities； gene; estrogen receptor； hepatitis B; carries; infection； polymorphism; Guizhou,Libo

[中圖分類號]R394； R34-33； RZ273

[文獻標識碼]A

[文章編號]1000-2707(2015)03-0222-03

通信作者***E-mail:annieheyan@gmc.edu.cn

[基金項目]**貴陽醫(yī)學院2010級生物技術(shù)專業(yè)本科生