貴州省3個(gè)少數(shù)民族HLA-G基因14 bp插入/缺失的多態(tài)性研究*

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貴州省3個(gè)少數(shù)民族HLA-G基因14 bp插入/缺失的多態(tài)性研究*

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2015-03-19網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20150319.0946.011.html

何燕， 趙孝梅， 左婭， 張婷， 鄧婕， 吳昌學(xué)， 禹文峰， 官志忠**

(貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院 分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽(yáng)550004)

[摘要]目的： 了解貴州省3個(gè)少數(shù)民族(布依族、水族、苗族)群體人類白細(xì)胞抗原-G(HLA-G)基因14 bp插入/缺失多態(tài)性的分布規(guī)律及其與遺傳背景之間的關(guān)系。方法： 采用PCR擴(kuò)增、電泳及測(cè)序的方法對(duì)來(lái)自貴州地區(qū)的布依族、水族、苗族共344例健康個(gè)體DNA進(jìn)行HLA-G基因14 bp插入/缺失多態(tài)性檢測(cè)，并與文獻(xiàn)報(bào)道的仡佬族、壯族等13個(gè)民族群體的HLA-G基因14 bp插入/缺失多態(tài)性分布數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果： 布依族、水族和苗族人群的+14 bp等位基因頻率分別為23.7%、26.0%和38.1%，+14 bp/+14 bp基因型頻率分別為9.40%、10.4%和15.9%，14 bp插入頻率比較示布依族和苗族差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=11.345，P=0.001)，苗族與水族差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.125，P=0.009)而布依族和水族間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.017)；與其他人群數(shù)據(jù)比較，苗族群體的14 bp插入/缺失分布與其他人群相似，而作為壯侗語(yǔ)族的布依族、水族則有自己獨(dú)特的14 bp插入/缺失分布規(guī)律。結(jié)論： 布依族、水族人群的14 bp插入/缺失分布相似，但是與苗族人群的分布存在一定的差異。

[關(guān)鍵詞]基因，HLA-G; 14 bp插入/缺失多態(tài); 布依族; 水族; 苗族；貴州

人類白細(xì)胞抗原-G(HLA-G)是非經(jīng)典的HLA I類分子，位于6號(hào)染色體HLA-A端粒側(cè)。HLA-G基因的多態(tài)性水平較其它經(jīng)典的HLA I類分子低，目前研究最多的是14 bp插入/缺失等位基因多態(tài)性。14 bp插入/缺失多態(tài)性與各種原因引起的復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、重度子癇前期、潰瘍性結(jié)腸炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡及一些慢性炎癥性疾病等的發(fā)病及進(jìn)展有關(guān)[1-6]。HLA-G基因14 bp插入/缺失的多態(tài)性不僅與種族有關(guān)，還與民族起源相關(guān)[7-8]。遺傳背景會(huì)影響基因頻率在群體中的分布，而遺傳背景不同所造成的群體分層現(xiàn)象會(huì)導(dǎo)致一些研究(尤其是病例-對(duì)照研究)中假陽(yáng)性結(jié)果的出現(xiàn)[9-11]。本文選擇同為漢藏語(yǔ)系的布依族、水族和苗族為研究對(duì)象，檢測(cè)該群體健康個(gè)體的14 bp插入/缺失多態(tài)性分布頻率，并結(jié)合文獻(xiàn)，與仡佬族、壯族、傣族、毛南族、布朗族、佤族、基諾族、哈尼族、土族、裕固族、怒族、云南漢族、浙江漢族共13個(gè)民族群體進(jìn)行對(duì)比，分析14 bp插入/缺失多態(tài)性和群體遺傳背景的相互關(guān)系。

1對(duì)象與方法

1.1　研究對(duì)象

根據(jù)知情同意原則，采集貴州省3個(gè)少數(shù)民族(布依族、苗族、水族)群體共344例健康無(wú)親緣關(guān)系個(gè)體外周血2~5 mL，用于HLA-G基因14 bp插入/缺失多態(tài)性分析。采樣時(shí)，追溯采血對(duì)象3代以上均為本民族，以保證其代表性。

1.2　HLA-G基因14 bp插入/缺失多態(tài)性檢測(cè)

采用QIAGEN外周血DNA提取試劑盒提取DNA，DU640型核酸蛋白分析儀測(cè)定DNA濃度，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)基因組DNA完整性，樣品DNA稀釋至100 mg/L，-20 ℃保存?zhèn)溆?。用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)PCR引物，上游系列為5′-CCCTCACTGTGACTGATATG-3′，下游系列為5′-CAAAGAGGAGTCAGGGTTC-3′。 25 μL PCR擴(kuò)增體系組成為10×buffer 2.5 μL，25 mmol/L MgCl21.5 μL，4×dNTP(每種2.5 mmol/L)2.0 μL，TaqDNA聚合酶1.25 U，10 μmol/ L上下游引物各1 μL，模板DNA 100 ng。PCR擴(kuò)增條件為：94 ℃變性40 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，30次循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)3%瓊脂糖凝膠電泳及溴化乙啶染色后在凝膠成像儀上檢測(cè)并記錄結(jié)果。

1.3　數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

計(jì)數(shù)該群體的基因型頻率和相應(yīng)的等位基因頻率，用Pypop0.7.0軟件對(duì)各群體進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)(Hardy-Weinberg Equilibrium,HWE)，群體間等位基因頻率比較用SPSS 17. 0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1　14 bp插入基因型判定

擴(kuò)增產(chǎn)物為134 bp的單一條帶，基因型為14 bp插入型純合子(+14 bp/ +14 bp)；擴(kuò)增產(chǎn)物為106 bp單一條帶的為14 bp缺失型純合子(-14 bp/-14 bp)；兩種條帶均有為雜合子(+14 bp/-14 bp)，如圖1。擴(kuò)增的產(chǎn)物經(jīng)純化后測(cè)序，并將結(jié)果在NCBI Blast中進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示插入的14 bp片段的基因序列為ATTTGTTCATGCCT，且該序列與HLA-G基因的Exon8的序列一致，說(shuō)明本研究的分型方法可靠，見(jiàn)圖2。

注：M為DNA MarkⅠ，1、3、4、5、9、13為雜合子(+14 bp/-14 bp)，2、6、7、8、11為缺失型純合子(-14 bp/-14 bp)，10、12為插入型純合子(+14 bp/+14 bp) 圖1　HLA-G基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1　The agarose gel electrophoresis figure of HLA-G gene PCR products

2.2　民族群體中HLA-G 14 bp插入/缺失的等位基因、基因型頻率和Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)

注：左圖為含14 bp插入的基因序列圖，插入的14 bp序列為ATTTGTTCATGCCT；右圖為14 bp缺失的基因序列圖，如圖箭頭所指出為14 bp缺失的位置圖2　HLA-G基因Exon8 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序圖Fig.2　Sequence figures about the PCR products of the HLA-G gene Exon8 region

3個(gè)民族(布依族、苗族、水族)群體的14 bp插入(+14 bp)等位基因頻率分別為0.237、0.381、0.260；+14 bp/-14 bp基因型頻率分別為0.381、0.443、0.313；-14 bp/-14 bp基因型頻率分別為0.525、0.398、0.583；+14 bp/+14 bp基因型頻率分別為0.094、0.159、0.104； Hardy-Weinberg 平衡檢驗(yàn)結(jié)果顯示3個(gè)群體基因型頻率均符合Hardy- Weinberg 平衡，說(shuō)明樣品具有代表性。見(jiàn)表1。

表1　不同民族群體HLA-G 基因14 bp插入/缺失基因型、等位基因頻率及Hardy-Weinberg檢驗(yàn)

2.3　HLA-G基因14 bp插入頻率

3個(gè)民族群體HLA-G基因14 bp插入頻率的比較采用χ2檢驗(yàn)，結(jié)果經(jīng)Bonferroni校正后，取P<0.017為差異具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果顯示布依族和苗族差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=11.345，P=0.001)；苗族與水族差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.125，P=0.009)而布依族和水族間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.017) 。見(jiàn)表2。

2.4　16個(gè)不同語(yǔ)族的民族群體的HLA-G 14 bp插入/缺失頻率

結(jié)合已有報(bào)道的仡佬族、壯族、傣族、毛南族、布朗族、佤族、基諾族、哈尼族、土族、裕固族、怒族、云南漢族、浙江漢族共13個(gè)民族群體的HLA-G14 bp插入/缺失多態(tài)性分布數(shù)據(jù)[12-15]，將16個(gè)民族群體按語(yǔ)系語(yǔ)族的不同分為6組，見(jiàn)表3。再對(duì)這6個(gè)組進(jìn)行14 bp插入頻率的χ2檢驗(yàn)，結(jié)果經(jīng)Bonferroni校正后，取P<0.003 3為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果顯示漢藏語(yǔ)系壯侗語(yǔ)族與其余5個(gè)語(yǔ)族之間兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.003 3)，漢藏語(yǔ)系藏緬語(yǔ)族與漢藏語(yǔ)系漢語(yǔ)支比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001)，其余各組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.003 3)，見(jiàn)表4。

表2　3個(gè)民族群體的14 bp插入頻率

注：P<0.017為有顯著性差異，括號(hào)中數(shù)字代表所選擇的該民族群體中所含的個(gè)體數(shù)

表4　6個(gè)不同語(yǔ)族群體HLA-G基因14 bp插入等位基因頻率

注：P<0.003 3為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

3討論

我國(guó)是一個(gè)多民族國(guó)家，歷史悠久，各民族都形成了自己的民族文化和生活習(xí)俗。少數(shù)民族人口雖少，但分布很廣。由于地理環(huán)境和歷史發(fā)展的原因，多數(shù)少數(shù)民族仍然居住在較封閉的環(huán)境中，成為一個(gè)遺傳學(xué)上相對(duì)隔離的群體，所以少數(shù)民族群體的遺傳背景相對(duì)單純，這對(duì)進(jìn)行人類遺傳多樣性分析以及遺傳疾病基因定位研究具有一定的優(yōu)勢(shì)[12-15]。

本研究選取貴州省黔東南地區(qū)的布依族、水族、苗族3個(gè)同為漢藏語(yǔ)系的民族進(jìn)行HLA-G基因14 bp插入/缺失的χ2配對(duì)比較，結(jié)果顯示苗族14 bp插入頻率分別與布依族、水族比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而布依族和水族之間則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。原因可能是布依族和水族同為漢藏語(yǔ)系壯侗語(yǔ)族，都是由古代的“百越”族群發(fā)展而來(lái)，多居于貴州黔南一帶，兩個(gè)群體遺傳背景相似；而苗族屬于漢藏語(yǔ)系苗瑤語(yǔ)族，在發(fā)展過(guò)程中由于多方面的原因?qū)е缕渑c布依族、水族之間遺傳背景存在一定的差異[12]。因此，可以認(rèn)為HLA-G基因14 bp插入頻率可能因語(yǔ)族不同而有所差異，這與Tao Y等的研究結(jié)果相吻合。

本研究對(duì)來(lái)自6個(gè)不同語(yǔ)族群體的16個(gè)少數(shù)民族群體的HLA-G基因14 bp插入/缺失多態(tài)性進(jìn)行研究，結(jié)果表明：(1)在漢藏語(yǔ)系當(dāng)中緬藏語(yǔ)族14 bp插入頻率(0.405～0.534)最高，其次是漢語(yǔ)族(浙江漢族和云南漢族，0.403～0.408[13-14])和苗瑤語(yǔ)族(苗族，0.381)，最低是壯侗語(yǔ)族(壯族、傣族、布依族、水族、毛南族、仡佬族，0.260～0.344[8,12-13])；各語(yǔ)族之間比較14 bp插入頻率，苗瑤語(yǔ)族(0.381)與漢語(yǔ)族(0.403～0.408)接近，均低于緬藏語(yǔ)族(0.405～0.534)，同時(shí)該3個(gè)語(yǔ)族14 bp插入頻率均高于壯侗語(yǔ)族(0.260～0.344)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(2)作為阿爾泰語(yǔ)系蒙古語(yǔ)族的土族、裕固族14 bp插入頻率(0.376～0.446)[15]與南亞語(yǔ)系孟高棉語(yǔ)族的布朗族、佤族(0.470～0.609)接近；且均高于漢藏語(yǔ)系各語(yǔ)族，但只與壯侗語(yǔ)族(0.260～0.344)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。根據(jù)如上的結(jié)果可以看出HLA-G基因14 bp插入頻率具有語(yǔ)系及語(yǔ)族的分布特點(diǎn)[15]。漢族群體14 bp插入頻率與苗族群體、阿爾泰語(yǔ)系蒙古語(yǔ)族群體、南亞語(yǔ)系孟高棉語(yǔ)族群體均接近，原因可能是隨著時(shí)代的發(fā)展，人們思想觀念逐漸開(kāi)放、經(jīng)濟(jì)條件日益好轉(zhuǎn)、交通設(shè)施逐漸完善，使得各民族之間的交流逐漸增多，形成了一個(gè)“大雜居，小聚居”的局面，進(jìn)一步地促進(jìn)各民族之間的交流與融合。有研究者指出嶺南和西南地區(qū)的越人，有的較早與漢族融合，已經(jīng)逐漸演變形成今天的一些兄弟民族，這些兄弟民族就是屬于漢藏語(yǔ)系壯侗語(yǔ)族的各民族[16]。經(jīng)過(guò)數(shù)百年的演變，百越與外族的交流融合已經(jīng)是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程，既有外族成分融入百越，又不斷有百越的成分流向外族，這使得百越族演變而成的這些民族群在不斷的演變與進(jìn)化過(guò)程中形成了自己獨(dú)特的遺傳背景，這可能是壯侗語(yǔ)族14 bp插入頻率較本研究中提到的其余語(yǔ)族群體較低的一個(gè)原因。

本研究結(jié)果顯示3個(gè)少數(shù)民族群體(布依族、水族、苗族)的基因型和等位基因分布與其他群體的分布有相同的趨勢(shì)，在同一研究群體中基因型(+14 bp/+14 bp)頻率和+14 bp等位基因頻率都較低。與其它群體數(shù)據(jù)比較發(fā)現(xiàn)，苗族群體14 bp插入/缺失的分布與其他群體相似，而布依族和水族則有自己獨(dú)特的等位基因和基因型分布規(guī)律，推測(cè)可能與其獨(dú)特的遺傳背景相關(guān)。

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(2015-01-09收稿，2015-02-25修回)

中文編輯： 吳昌學(xué)； 英文編輯： 周凌

·專題研究·

Analysis of the 14 bp Insertion/Deletion Polymorphism in Human

Leukocyte Antigen-GGene in Chinese Buyi, Shui,

and Miao Ethnic Groups in Guizhou Province

HE Yan, ZHAO Xiaomei, ZUO Ya, ZHANG Ting, DENG Jie, WU Changxue, YU Wenfeng, GUAN Zhizhong

(TheKeyLaboratoryofMolecularBiology,GuiyangMedicalCollege,Guiyang550004,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To investigate the distribution of HLA-G gene 14 bp insertion /deletion polymorphism in Buyi, Shui and Gelao populations and their relationship with genetic background．Methods:PCR amplification, agarose gel electrophoresis and sequencing were used to explore the distribution of 14 bp insertion/deletion in HLA-G gene in 344 healthy people of these three ethnic groups, and the data were compared with that of 13 ethnic groups such as Gelao, Zuang reported in the literature. Results: The frequencies of +14 bp in Buyi, Shui and Miao were 23.7%, 26.0% and 38.1% respectively. The genotype frequencies of +14 bp/+14 bp in Buyi,Shui and Miao were 9.40%, 10.4% and 15.9% respectively. The differences of 14 bp insertion frequencies between Buyi and Miao, between Miao and Shui were statistically significant (P<0.05), while no significant difference was found between Buyi and Shui (P>0.05). When compared with other groups, the distribution characteristic of +14 bp insertion/deletion in Miao was similar to them, but Buyi and Shui showed significance difference from others. Conclusion: The distribution characteristics of +14 bp insertion/deletion in Buyi is similar to Shui, but they are different from that of Miao.

[Key words]gene,HLA-G; +14 bp insertion/deletion polymorphism; Buyi people; Shui people; Miao people； Guizhou

[中圖分類號(hào)]R394；R34-33； RZ273

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1000-2707(2015)03-0217-05

通信作者**E-mail:zhizhongguan@yahoo.com

[基金項(xiàng)目]*國(guó)家“十二·五”科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(No：2013BAI05B03)； 貴州省科技廳社會(huì)發(fā)展攻關(guān)項(xiàng)目：SY(2012)3135]