大鼠激素性股骨頭壞死模型的建立和評價

董玉雷，周　磊，李玉龍，肖　刻，翁習生

中國醫(yī)學科學院　北京協(xié)和醫(yī)學院　北京協(xié)和醫(yī)院骨科，北京 100730

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大鼠激素性股骨頭壞死模型的建立和評價

董玉雷，周磊，李玉龍，肖刻，翁習生

中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院北京協(xié)和醫(yī)院骨科，北京 100730

摘要：目的建立大鼠激素性股骨頭壞死動物模型，并進行影像學和病理評價。方法將30只成年雄性SD大鼠隨機分為兩組：實驗組給予腹腔注射兩次脂多糖(20 μg/kg)，每次間隔24 h，24 h后肌肉注射大劑量甲強龍(40 mg/kg)，連續(xù)注射3次，每次間隔24 h，對照組給予等量生理鹽水。4周后兩組各隨機處死5只大鼠。8周后處死剩余全部大鼠。大鼠雙側股骨標本行微計算機斷層掃描，觀察骨小梁微觀結構變化，計算骨小梁參數(shù)。股骨頭脫鈣處理后行HE染色組織病理學檢查。結果根據(jù)病理切片結果，實驗組有12只出現(xiàn)骨壞死表現(xiàn)，建模成功率80%。4周時實驗組病理切片出現(xiàn)空骨陷窩，8周時HE染色可觀察到空骨陷窩、骨小梁斷裂、纖維結構增生。8周時實驗組微計算機斷層掃描顯示骨小梁結構紊亂、斷裂、囊變，骨小梁定量分析顯示骨小梁相對體積(實驗組:0.55±0.13，對照組:0.68±0.12;P<0.05)、相對面積(實驗組:20.45±5.13，對照組:24.00±5.20；P<0.05)、骨小梁數(shù)量(實驗組:5.67±0.50，對照組:6.24±0.96；P<0.05)等指標明顯低于對照組。結論脂多糖聯(lián)合大劑量甲強龍可成功建立大鼠激素性股骨頭壞死動物模型，使用高分辨微計算機斷層掃描可進行骨小梁形態(tài)和結構的定性定量分析，與HE染色病理切片具有較好的一致性。

關鍵詞：糖皮質(zhì)激素；股骨頭壞死；微計算機斷層掃描

ActaAcadMedSin，2015,37(2)：152-156

糖皮質(zhì)激素是許多風濕免疫疾病重要的治療手段，然而激素性股骨頭壞死已經(jīng)成為高發(fā)病率、高致殘率的疾病。Fukushima等[1]研究顯示激素性股骨頭壞死已居非創(chuàng)傷性股骨頭壞死的首位(51%)。其確切的發(fā)病機制尚不明確。建立科學的股骨頭壞死動物模型對研究股骨頭壞死具有重要的意義。目前的股骨頭壞死動物模型較多[2]，但造模方式及評價方法仍然未達成一致。高分辨微計算機斷層掃描可以清楚地觀察骨小梁形態(tài)，結合軟件重建分析能夠定量分析骨小梁參數(shù)，已經(jīng)成為骨形態(tài)計量學研究的重要工具[3]。本研究通過脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)聯(lián)合甲強松建立大鼠股骨頭壞死動物模型，并使用micro-CT進行定性定量評價，結合HE染色組織形態(tài)學檢查，建立和評價大鼠激素性股骨頭壞死模型。

材料和方法

實驗動物及模型制作成年雄性SD大鼠由北京維通利華公司提供，共30只，年齡12周，體重400～450 g，在中國醫(yī)學科學院腫瘤醫(yī)院動物房按照標準飼養(yǎng)條件飼養(yǎng)，溫度22～26 ℃，濕度37%～42%，光照按12 h晝夜交替，自由攝食飲水，每籠2只。適應性喂養(yǎng)1周后隨機分為兩組，每組15只，精確稱重后，實驗組腹腔注射LPS(20 μg/kg，美國Sigma公司)兩次，每次間隔24 h。24 h后兩側臀肌交替注射甲強龍(40 mg/kg，美國輝瑞公司)3次，每次間隔24 h。對照組腹腔及臀肌注射生理鹽水。飼養(yǎng)4周后每組隨機處死5只，取出雙側股骨標本，中性甲醛溶液固定，繼續(xù)飼養(yǎng)至8周后處死剩余全部大鼠，取出雙側股骨標本，中性甲醛溶液固定。

Micro-CT檢查Micro-CT由中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所完成，使用Siemens小動物micro-PET/CT行股骨近端掃描并使用Inveon工作站軟件進行三維重建。掃描電壓為60 kV，電流400 μA，掃描長度20 mm，分辨率10 μm，使用Inveon analysis工作站進行重建，選取股骨頭冠狀面骨骺線中點下方1 mm內(nèi)的全部50個層面作為感興趣區(qū)域進行骨小梁參數(shù)分析(圖1)。隨后，骨體積/總體積、骨面積/骨體積、骨小梁厚度、骨小梁數(shù)量通過軟件自動計算。

組織病理學檢查將股骨置入中性甲醛溶液固定72 h后，使用30% 甲酸脫鈣3 d，脫鈣完全后梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片厚度4 μm，常規(guī)HE染色，使用顯微鏡在100倍視野下觀察。股骨頭壞死的診斷標準為空骨陷窩形成或骨細胞核固縮，伴有周圍骨髓細胞壞死[4]。具有至少1處壞死病灶的大鼠可以認為出現(xiàn)股骨頭壞死。

結果

大體觀察結果所有大鼠均存活，未出現(xiàn)明顯并發(fā)癥。成年大鼠股骨頭直徑約2 mm，表面覆蓋一層軟骨。實驗組股骨頭可見軟骨下壞死灶，顏色暗紅。對照組股骨頭軟骨光滑，顏色均一(圖2)。

A.橫斷面手動區(qū)分皮質(zhì)骨和松質(zhì)骨，骨小梁和骨髓通過閾值功能自動區(qū)分；B.冠狀面顯示感興趣區(qū)域

A.on the cross-section the cortical bone and spongy bone were separated manually，and the trabeculae and the bone marrow were separated automatically by the threshold function；B.the region of interest shown in the coronary view

圖 1微計算機斷層掃描骨小梁參數(shù)分析時感興趣區(qū)域的選擇和分析

Fig 1The region of interest chosen and the identification of trabeculae in micro-CT

A.實驗組，可見到片狀軟骨下出血壞死，軟骨較??；B對照組，軟骨面光滑，顏色均一

A.the femoral head from the experimental group showed necrotic lesion of the bone under the relatively thin cartilage；B.the femoral head from the control group showed relatively smooth and white cartilage

圖 24周時大鼠股骨頭壞死大體標本

Fig 2The gross specimen observation of the femoral head at 4 weeks

Micro-CT結果8周時實驗組大鼠股骨頭可見到軟骨面變薄，軟骨下骨壞死、囊變，骨小梁稀疏。對照組軟骨面均勻，厚度大，軟骨下松質(zhì)骨骨小梁致密、排列有序(圖3)。定量分析股骨頭中心單位體積內(nèi)的松質(zhì)骨骨小梁參數(shù)，結果顯示實驗組的骨小梁相對體積、面積、數(shù)量均明顯低于對照組(P=0.002，P=0.036，P=0.024)。骨小梁厚度兩組比較差異無統(tǒng)計學意義(P=0.388)(表1)。

組織病理學變化4周時可見實驗組有空骨陷窩形成，而對照組骨細胞及細胞核染色均勻。8周時實驗組可見骨小梁斷裂，排列紊亂，骨小梁間距增大，空骨陷窩明顯增多，有點狀骨髓壞死出血，并出現(xiàn)纖維結構增生。根據(jù)股骨頭壞死診斷標準，實驗組4周時有4/5只出現(xiàn)股骨頭壞死，8周時有8/10只出現(xiàn)骨壞死，共有12/15只出現(xiàn)股骨頭壞死，建模成功率為80%。對照組骨小梁排列規(guī)律，間隔較小，軟骨面光滑(圖4)。

A.造模組，顯示股骨頭軟骨下骨壞死，部分囊變，骨小梁稀疏；B.對照組，顯示股骨頭形態(tài)良好，骨小梁致密

A.the femoral head from the experimental group showed necrotic lesion under the cartilage，the cystic lesion formed，and the trabeculae were few and scattered；B.the femoral head from the control group did not show any obvious lesion and the trabeculae were fine and close

圖 3股骨頭微計算機斷層掃描二維重建圖像

Fig 3The two-dimensional micro-CT reconstruction image of the femoral head

表 1　股骨頭感興趣區(qū)域骨小梁參數(shù)分析結果對比(x-±s)

圖 4股骨頭組織病理學染色結果(HE染色，×100)

Fig 4The histopathological appearance of the femoral head(HE stained，×100)

討論

激素性股骨頭壞死的發(fā)病機制目前仍不清楚，尚無特異性的治療手段。建立科學的動物模型對激素性股骨頭壞死發(fā)病機制的研究具有重要意義。目前股骨頭壞死的動物模型包括雞、鴯鹋、大鼠、兔、犬、羊等[2]。兔比較經(jīng)濟、易于飼養(yǎng)，是最常用的激素性股骨頭壞死模型。鴯鹋因其獨特的股骨頭塌陷現(xiàn)象在髖關節(jié)生物力學方面的研究具有重要的意義[5]。但是鴯鹋不是標準實驗動物，來源有限，與人類基因差異較大，不適合大規(guī)模推廣。大鼠體積適中，生理和藥理特性與人類非常相近，生長繁殖較快，飼養(yǎng)簡便，股骨頭大小適合進行影像學和病理學研究，因而是目前重要的股骨頭壞死動物模型。由于激素性股骨頭壞死主要見于成年人，所以選用成年大鼠能夠更好的模擬臨床。

股骨頭壞死動物模型的造模方法包括異體血清加激素、LPS加激素、單純激素等[6- 8]。臨床上，系統(tǒng)性紅斑狼瘡、腎病綜合征等是應用激素較多且容易發(fā)生股骨頭壞死的疾病，其共同點是應用激素前體內(nèi)已出現(xiàn)血液和脈管系統(tǒng)的基礎病變。利用LPS或異體血清首先造成動物的免疫反應和血管炎，繼而使用激素建模的方式，發(fā)生骨壞死時間更早，效果更明顯，更符合臨床實際，被較多學者采用。本研究采用的是LPS加大劑量甲強龍的方法。劑量與童培建等[9]的報道相同。大于另一些學者的劑量[8，10]。一方面，這和大鼠與兔的物種差異有關；另一方面，大劑量激素的主要副作用是感染導致動物死亡的風險。本研究無1例大鼠出現(xiàn)死亡，這可能與良好飼養(yǎng)環(huán)境和較低的飼養(yǎng)密度有關。

近年來，隨著小動物影像學檢測技術的進步，使小動物股骨頭壞死的評價更為精確。本研究采用的Siemens Inveon Micro-PET/CT 還可以進行活體動態(tài)成像，分辨率達微米級，可清楚地顯示骨小梁等微觀結構，同時結合軟件可以進行定量分析骨小梁相關參數(shù)和骨密度等指標，成為骨質(zhì)疏松領域和骨形態(tài)學領域研究的重要工具[11]。本研究采用的是標本掃描，較活體掃描能夠更清晰地顯示骨小梁結構，避免動物呼吸帶來的偽影。骨小梁參數(shù)分析顯示骨體積分數(shù)和骨小梁數(shù)量實驗組均明顯低于對照組，表明實驗組的骨小梁結構出現(xiàn)了破壞，出現(xiàn)了骨質(zhì)疏松的表現(xiàn)。組織病理學仍然是診斷骨壞死的金標準，股骨頭壞死的病理特征早期主要是骨細胞凋亡[12]和骨髓壞死，晚期出現(xiàn)骨小梁結構紊亂、斷裂，伴有纖維結構增生。本研究4周時可明顯觀察到空骨陷窩形成，但骨小梁結構尚可。8周時，已經(jīng)可以觀察到骨小梁結構紊亂斷裂，周圍纖維結構增生，在微計算機斷層掃描顯示為囊變，與文獻報道一致[4]，表明本研究動物模型能夠模擬股骨頭壞死的表現(xiàn)。另外，本研究顯示微計算機斷層掃描能夠清晰地顯示骨小梁，但是對于早期的骨細胞壞死尚無法顯示。隨著分子影像學等技術的進步，未來可逐漸取代病理切片用于小動物股骨頭壞死的診斷。

本研究建立了大鼠激素性股骨頭壞死模型，通過明確的病理切片診斷標準進行評價，無大鼠意外死亡，造模成功率高。配合高分辨微計算機斷層掃描，可清晰地顯示骨小梁微觀結構，同時結合骨小梁參數(shù)定量分析，可以定量比較骨小梁體積等數(shù)值。本研究不足之處是由于大鼠隔離飼養(yǎng)的限制性，無法對同一只動物進行影像上的動態(tài)觀察。目前臨床上股骨頭壞死早期的骨髓水腫主要依據(jù)核磁共振成像診斷，而微計算機斷層掃描對于早期骨小梁結構正常的股骨頭壞死顯示效果欠佳，未來使用小動物核磁共振和小動物正電子發(fā)射計算機斷層掃描，可以對股骨頭壞死早期的水腫和異常信號進行檢測，能夠更敏感和準確判斷股骨頭壞死。另外，由于大鼠股骨頭直徑小，且為四足動物，故無法完全模擬出類似人類的股骨頭壞死塌陷。所以對于髖關節(jié)生物力學相關的研究，可能選擇大動物更為適合。

綜上，使用LPS加大劑量甲強龍可以誘導成年SD雄性大鼠出現(xiàn)較高的股骨頭壞死率，使用微計算機斷層掃描和病理切片進行評價，可定性定量顯示及分析骨小梁結構和參數(shù)，對研究股骨頭壞死發(fā)病機制及不同干預措施的療效具有重要的意義。

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·論著·

DOI：10.3881/j.issn.1000- 503X.2015.02.004

Establishment and Assessment of Rat Models of Glucocorticoid-induced Osteonecrosis

DONG Yu-lei，ZHOU Lei，LI Yu-long，XIAO Ke，WENG Xi-sheng

Department of Orthopedics，PUMC Hospital，CAMS and PUMC，Beijing 100730，China

Corresponding author：WENG Xi-shengTel：010- 69152810，E-mail：xshweng@medmail.com.cn

ABSTRACT：ObjectiveTo establish the rat models of glucocorticoid-induced osteonecrosis and evaluate the osteonecrosis by high-resolution micro-CT and histomorphology.MethodsTotally 30 Sprague-Dawley male adult rats(age：12 weeks；body weight：400- 450 g)were randomized into two groups：one group received two doses of intraperitoneal injection of lipopolysaccharide(20 μg/kg)at an interval of 24 hours，24 hours later，the rats received three doses of intramuscular injection of methylprednisolone(40 mg/kg)at an interval of 24 hours；in the control group，the rats received same amount of normal saline.Four weeks later，5 rats in each group were sacrificed randomly.Eight weeks later，all the remaining rats were sacrificed and the femur specimens were scanned by micro-CT.The trabeculae parameters of the femoral head were calculated.The hematoxylin and eosin staining were performed to calculated the success rate.ResultsThe incidence of osteonecrosis was 80% in the experimental group.The micro-CT demonstrated broken and cystic degeneration.The quantitative analysis showed that the bone volume/total volume(experimental group：0.55±0.13vs. control group: 0.68±0.12;P<0.05)，bone surface area / bone volume(experimental group:20.45±5.13vs. control group: 24.00±5.20;P<0.05)，and trabeculae number(experimental group: 5.67±0.50vs. control group: 6.24±0.96;P<0.05)were significantly lower in experimental group than those in control group.ConclusionsA rat model of glucocorticoid-induced osteonecrosis was successfully established by lipopolysaccharide and methylpredniso- lone.High-resolution micro-CT is useful for the qualitative and quantitative analyses of the morphology and structure of trabeculae，showing good consistence with the histomorphological findings.

Key words：glucocorticoids；osteonecrosis；micro-CT

(收稿日期：2014- 12- 01)

中圖分類號:R681.8

文獻標志碼:A

文章編號：1000- 503X(2015)02- 0152- 05

通信作者：翁習生電話：010- 69152810，電子郵件：xshweng@medmail.com.cn

基金項目：國家自然科學基金(81272009)Supported by the National Natural Sciences Foundation of China(81272009)

·論著·