SIRT1在NMDA誘導(dǎo)的皮層神經(jīng)元凋亡中的作用觀察

衛(wèi)美辰，楊小榮

SIRT1在NMDA誘導(dǎo)的皮層神經(jīng)元凋亡中的作用觀察

衛(wèi)美辰，楊小榮

摘要：目的觀察沉默信息調(diào)節(jié)因子(silent information regulator 1，SIRT1)在NMDA誘導(dǎo)的大鼠皮層神經(jīng)元凋亡中的作用。方法培養(yǎng)大鼠原代皮層神經(jīng)元，給予NMDA(100 μmol/L，2 h)建立興奮性神經(jīng)毒模型；應(yīng)用Caspase-3活性分析和Annexin V染色方法，檢測(cè)細(xì)胞凋亡。結(jié)果SIRT1激活劑白藜蘆醇(Resveratrol，RSV)拮抗NMDA引起的細(xì)胞凋亡，而SIRT1抑制劑Sirtinol(10 μmol/L)取消RSV(25 μmol/L)的保護(hù)作用。結(jié)論在NMDA誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程中，激活SIRT1發(fā)揮保護(hù)作用，而抑制SIRT1則參與神經(jīng)損傷。

關(guān)鍵詞：沉默信息調(diào)節(jié)因子1；NMDA；細(xì)胞凋亡；神經(jīng)保護(hù)

NMDA誘導(dǎo)的興奮性神經(jīng)毒造成神經(jīng)損傷，并導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的死亡，早期認(rèn)為主要以壞死為主。NMDA也可通過引起凋亡參與興奮性神經(jīng)毒引起的神經(jīng)元死亡[1]。沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silent information regulator 1，SIRT1)作為NAD+依賴的脫乙?；?，通過對(duì)組蛋白及多種非組蛋白的去乙酰化修飾，參與基因轉(zhuǎn)錄、能量代謝以及細(xì)胞衰老過程的調(diào)節(jié)[2，3]。近年研究發(fā)現(xiàn)，SIRT1具有明顯的神經(jīng)保護(hù)作用。但SIRT1對(duì)NMDA誘導(dǎo)的皮層神經(jīng)元凋亡是否發(fā)揮保護(hù)作用尚不明確。

本研究采用NMDA(100 μmol/L，2 h)興奮毒細(xì)胞模型誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，應(yīng)用Caspase-3活性分析和Annexin V染色方法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，通過給予SIRT1激活劑白藜蘆醇(Resveratrol，RSV)和/或 SIRT1抑制劑Sirtinol，觀察SIRT1在NMDA誘導(dǎo)的皮層神經(jīng)元凋亡中的作用。

1材料與方法

1.1試劑Neurobasal和B27添加劑購(gòu)自Gibco，Caspase-3活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Abcam，guava Nexin試劑盒購(gòu)自Guava，RSV和Sirtinol購(gòu)自Sigma。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)取新生1 d～3 d的大鼠，常規(guī)手術(shù)，分離制成大鼠皮層單細(xì)胞懸液。細(xì)胞懸液經(jīng)1 000 g離心5 min，棄上清，用培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，按5×104個(gè)/mL的濃度，在37 ℃、5%CO2的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。

2結(jié)果

2.1SIRT1在NMDA引起Caspase-3活性增高中的作用預(yù)先應(yīng)用SIRT1抑制劑Sirtinol(10 μmol/L)與神經(jīng)元預(yù)孵育2 h，之后加入SIRT1激活劑RSV(25 μmol/L)再孵育12 h，采用Caspase-3活性測(cè)定細(xì)胞凋亡。結(jié)果顯示，RSV可以有效抑制NMDA引起的Caspase-3活性增高，使Caspase-3活性降低33.63%(P<0.05)；Sirtinol可以有效阻斷RSV的作用；NMDA受體拮抗劑MK-801完全阻斷NMDA的作用。詳見圖1。

圖1　SIRT1在NMDA引起Caspase-3活性增高的作用

2.2SIRT1在NMDA引起細(xì)胞凋亡中的作用Annexin-V染色結(jié)果顯示，用RSV預(yù)處理后，NMDA誘導(dǎo)的細(xì)胞早期凋亡和晚期凋亡比例分別降低了22.9%和72.1%；而Sirtinol拮抗了這種作用；MK-801完全阻斷NMDA的作用。詳見圖2。

圖2　SIRT1在NMDA引起細(xì)胞凋亡中的作用

3討論

谷氨酸作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)，當(dāng)在突觸間隙中過度積聚時(shí)，可以激活突觸后膜NMDA受體，使胞外Ca2+內(nèi)流，激活多種蛋白酶，過度產(chǎn)生自由基。這些因素共同作用，引起神經(jīng)元損傷甚至死亡，產(chǎn)生興奮性神經(jīng)毒效應(yīng)[4]。越來越多的證據(jù)表明，NMDA誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞死亡是一個(gè)完善且有效的神經(jīng)損傷模型，它是引起多種神經(jīng)退行性疾病的一種重要發(fā)病機(jī)制[5]。

SIRT1是在哺乳動(dòng)物中首先被發(fā)現(xiàn)的Sirtuin去乙酰化酶家族成員，也是目前研究最多、最為深入的Sirtuin蛋白?，F(xiàn)有研究已證實(shí)SIRT1在腦缺血、AD、HD和PD等多種神經(jīng)損傷模型中具有明顯的保護(hù)效應(yīng)[6-8]。但SIRT1在NMDA誘導(dǎo)的皮層神經(jīng)細(xì)胞凋亡中是否發(fā)揮保護(hù)作用尚不明確。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SIRT1激動(dòng)劑RSV能夠拮抗NMDA誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡，表現(xiàn)為使NMDA誘導(dǎo)的Caspase-3活性降低，細(xì)胞凋亡減少；而SIRT1抑制劑Sirtinol能夠阻斷RSV對(duì)NMDA損傷的拮抗效應(yīng)，說明RSV 的保護(hù)作用是通過活化SIRT1而實(shí)現(xiàn)的。因此，在NMDA誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程中，激活SIRT1發(fā)揮保護(hù)作用，而抑制SIRT1則參與神經(jīng)損傷。

SIRT1作為一種去乙酰化酶，可以作用于P53、NF-κB、PGC-1α、LKB1、TSC2、HSF1等多種底物使其發(fā)生去乙?；瑓⑴c多種損傷過程的調(diào)節(jié)。相關(guān)研究顯示，SIRT1可以通過去乙?；蛲黾せ畹鞍譌OXOs來抑制其轉(zhuǎn)錄，使神經(jīng)元細(xì)胞免于凋亡[9]；SIRT1通過使HSF1(heat shock factor 1，HSF1)去乙?；?，促進(jìn)HSF1與Hsp70啟動(dòng)子結(jié)合，激活Hsp70，減少細(xì)胞凋亡[10]。

SIRT1可能通過其去乙?；饔谜{(diào)節(jié)多種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的活性，從而對(duì)各種神經(jīng)損傷發(fā)揮保護(hù)作用。

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(本文編輯王雅潔)·綜述與進(jìn)展·

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)論著/研究·

收稿日期：(2014-07-22)

通訊作者：楊小榮，E-mail：842904087@qq.com

中圖分類號(hào)：R338R285

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1672-1349.2015.13.009

文章編號(hào)：1672-1349(2015)13-1498-02

作者單位：山西醫(yī)科大學(xué)(太原 030001)

1.2.2NMDA毒性誘導(dǎo)將培養(yǎng)神經(jīng)元在NMDA(100 μmol/L)和Gly(10 μmol/L)溶液中孵育2 h，再進(jìn)行后續(xù)的細(xì)胞凋亡檢測(cè)。SIRT1激活劑RSV在NMDA誘導(dǎo)之前預(yù)孵育12 h，SIRT1抑制劑Sirtinol在RSV孵育前2 h加入。

1.2.3Caspase-3活性測(cè)定將細(xì)胞接種在96孔板中，在NMDA作用后的20 h，用Caspase-3檢測(cè)試劑盒測(cè)定細(xì)胞的Caspase-3活性。在PBS中漂洗、收集細(xì)胞；在50 μL細(xì)胞裂解液中孵育細(xì)胞10 min后，再離心5 min(10 000 g)。取上清測(cè)定蛋白濃度，將每個(gè)蛋白樣品(50 μg～200 μg)稀釋至50 μL細(xì)胞裂解液中；將50 μL的2×反應(yīng)緩沖液(含10 mmol / L的DTT)加入各樣品中；再加入5 μL的DEVD-pNA(4 mmol / L)底物溶液，并在37 ℃作用1.5 h；最后在(400～405)nm處測(cè)定OD值。

1.2.4Annexin-V染色將細(xì)胞接種在96孔板中，在NMDA作用后的24 h，用Annexin-V染色方法檢測(cè)細(xì)胞凋亡。在PBS中收集、重懸細(xì)胞；在100 μL細(xì)胞懸浮液中加入100 μL 的Nexin試劑，室溫避光反應(yīng)20 min；通過Guava系統(tǒng)獲得細(xì)胞樣品?；罴?xì)胞(Annexin V-/7-AAD- )、早期凋亡細(xì)胞(Annexin V+/7-AAD-)、晚期凋亡/死亡細(xì)胞(Annexin V+/7-AAD+)和核碎片(AnnexinV/7-AAD+)分布的百分比用Guava Nexin軟件進(jìn)行分析。