以CFP10/ESAT6融合蛋白為抗原的酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)在脊柱結(jié)核感染輔助診斷中的應(yīng)用價(jià)值

袁　凱，梁　德，吳雪瓊，姚珍松，晉大祥，楊志東，張順聰，丁金勇，江曉兵，陳建庭

1廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院脊柱骨科，廣州 510405

2中國(guó)人民解放軍第309醫(yī)院全軍結(jié)核病研究所全軍結(jié)核病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100091

3南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院脊柱骨科，廣州 510515

?

以CFP10/ESAT6融合蛋白為抗原的酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)在脊柱結(jié)核感染輔助診斷中的應(yīng)用價(jià)值

袁凱1，梁德1，吳雪瓊2，姚珍松1，晉大祥1，楊志東1，張順聰1，丁金勇1，江曉兵1，陳建庭3

1廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院脊柱骨科，廣州 510405

2中國(guó)人民解放軍第309醫(yī)院全軍結(jié)核病研究所全軍結(jié)核病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100091

3南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院脊柱骨科，廣州 510515

摘要：目的評(píng)價(jià)以CFP10/ESAT6融合蛋白為抗原的酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)(ELISPOT)技術(shù)在脊柱結(jié)核感染輔助診斷中的應(yīng)用價(jià)值。方法選取2012年5月至2013年12月廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院脊柱骨科和南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院脊柱骨科收治的疑似脊柱結(jié)核患者91例，根據(jù)臨床和細(xì)菌性診斷結(jié)果分為脊柱結(jié)核組(n=52)和對(duì)照組(n=39)。采用ELISPOT試驗(yàn)檢測(cè)脊柱結(jié)核組和對(duì)照組外周血單個(gè)核細(xì)胞，觀察斑點(diǎn)形成細(xì)胞的數(shù)量?；颊咄瑫r(shí)接受結(jié)核菌素(PPD)皮膚試驗(yàn)、血清抗結(jié)核抗體檢測(cè)、病灶病理學(xué)檢查、抗酸桿菌涂片和病灶結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)，比較不同檢測(cè)方法的敏感性、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值，分析不同檢測(cè)結(jié)果的一致性。結(jié)果52例脊柱結(jié)核患者中共47例接受病灶活檢穿刺病理檢查，其中41例病理證實(shí)為結(jié)核。ELISPOT試驗(yàn)在脊柱結(jié)核診斷中的敏感性、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值分別為82.7%、87.2%、89.6%和79.1%；PPD皮膚試驗(yàn)的敏感性、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值分別為61.5%、46.2%、60.4%和47.4%；血清抗結(jié)核抗體試驗(yàn)的敏感性、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值分別為55.8%、61.5%、65.9%和51.1%。在脊柱結(jié)核患者中，ELISPOT試驗(yàn)的陽(yáng)性率顯著高于PPD皮膚試驗(yàn)(82.7%比61.5%，χ2=5.786，P=0.016)和血清抗結(jié)核抗體試驗(yàn)(82.7%比55.8%，χ2=8.847，P=0.003)，與病理學(xué)檢查比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(82.7%比87.2%，χ2=0.396，P=0.529)。ELISPOT試驗(yàn)與病理學(xué)檢查一致性較好(87.2%，κ=0.498，P=0.001)。結(jié)論以CFP10/ESAT6融合蛋白為抗原的ELISPOT法應(yīng)用于脊柱結(jié)核診斷有良好的敏感性和特異性，可作為脊柱結(jié)核感染輔助診斷的有效方法。

關(guān)鍵詞：脊柱結(jié)核；酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)；CFP10/ESAT6融合蛋白；輔助診斷

Diagnostic Value of Enzyme-linked Immunospot Assay Using CFP10/ESAT6 Fusion Protein as Antigen in Spinal Tuberculosis

YUAN Kai1，LIANG De1，WU Xue-qiong2，YAO Zhen-song1，JIN Da-xiang1，YANG Zhi-dong1，ZHANG Shun-cong1，DING Jin-yong1，JIANG Xiao-bing1，CHEN Jian-ting3

1Department of Spine Orthopedics，the First Affiliated Hospital of Guangzhou University of

ActaAcadMedSin，2015,37(1)：44-49

脊柱結(jié)核是最常見(jiàn)的骨關(guān)節(jié)結(jié)核，約占骨結(jié)核的50%，占所有結(jié)核的1%~3%[1]。脊柱結(jié)核發(fā)病隱匿，進(jìn)展遲緩，癥狀體征不明顯，因此早期診斷非常困難。傳統(tǒng)的結(jié)核病檢測(cè)方法(結(jié)核菌素試驗(yàn)、涂片染色鏡檢、結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)和分子生物學(xué)方法)檢出率明顯低于肺內(nèi)結(jié)核，嚴(yán)重影響患者的預(yù)后，致殘率高。

酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)(enzyme-linked immunespot，ELISPOT)是根據(jù)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)原理建立的一種體外檢測(cè)單細(xì)胞水平特異性抗體分泌細(xì)胞功能的免疫學(xué)技術(shù)。目前的T-SPOT.TB試劑盒(英國(guó)Oxford Immunotec公司)是采用結(jié)核分枝桿菌特異的早期分泌抗原靶6kDa蛋白(early secretory antigentic target 6kDa protein，ESAT- 6)和培養(yǎng)濾液蛋白10(culture filtrate protein 10，CFP10)多肽刺激結(jié)核致敏T淋巴細(xì)胞分泌干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)，并應(yīng)用ELISPOT檢測(cè)分泌IFN-γ的T淋巴細(xì)胞[2]。近年來(lái)，采用ELISPOT 技術(shù)定量檢測(cè)外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)對(duì)結(jié)核分枝桿菌抗原的特異性釋放反應(yīng)開(kāi)始被廣泛用于肺外結(jié)核感染的診斷[3]，但將其單純應(yīng)用于脊柱結(jié)核感染診斷的研究較少。本研究初步探討以CFP10/ESAT6融合蛋白為抗原的ELISPOT技術(shù)用于輔助診斷脊柱結(jié)核感染的應(yīng)用價(jià)值。

對(duì)象和方法

對(duì)象選取2012年5月至2013年12月廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院脊柱骨科和南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院脊柱骨科收治的疑似脊柱結(jié)核患者91例。自行設(shè)計(jì)患者信息采集表，收集基本臨床信息和臨床結(jié)果，并對(duì)受試者出院進(jìn)一步隨訪。根據(jù)患者最終的臨床診斷和細(xì)菌學(xué)診斷結(jié)果，由不知曉ELISPOT結(jié)果的主治醫(yī)師將入選患者按照以下標(biāo)準(zhǔn)分為脊柱結(jié)核組(n=52)和對(duì)照組(n=39)。

脊柱結(jié)核組入選標(biāo)準(zhǔn)為：(1)患者影像學(xué)具備脊柱結(jié)核特征；(2)術(shù)前或術(shù)中活檢病灶標(biāo)本培養(yǎng)出結(jié)核分枝桿菌，或者病灶組織標(biāo)本病理檢查符合結(jié)核改變；(3)菌種鑒定排除非結(jié)核分枝桿菌感染；(4)脊柱結(jié)核患者抗結(jié)核治療少于2周；(5)排除HIV感染。該組包括男31例，女21例，平均年齡(42.3±18.4)歲(2~86歲)；合并高血壓3例，乙肝5例，梅毒2例，強(qiáng)直性脊柱炎1例，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎2例，系統(tǒng)性紅斑狼瘡2例，肝硬化1例，肺結(jié)核7例；參考Jung等[4]的診斷標(biāo)準(zhǔn)，有10例脊柱結(jié)核患者合并免疫功能缺陷。

對(duì)照組入選標(biāo)準(zhǔn)為：(1)非脊柱結(jié)核疾病住院患者；(2)與脊柱結(jié)核組無(wú)血緣關(guān)系；(3)排除結(jié)核分枝桿菌感染；(4)影像學(xué)檢查無(wú)結(jié)核表現(xiàn)；(5)無(wú)結(jié)核患者接觸史；(6)排除HIV感染。該組包括男17例，女22例，平均年齡(46.5±13.9)歲(18~69歲)；其中確診為腰椎間盤(pán)突出癥16例，頸椎病6例，脊柱轉(zhuǎn)移瘤5例，脊柱椎管內(nèi)腫瘤8例，化膿性脊柱炎4例；脊柱轉(zhuǎn)移瘤患者中有2例合并免疫功能缺陷[4]。

本研究方案經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有入選患者均簽署知情同意書(shū)。

主要儀器及設(shè)備酶聯(lián)斑點(diǎn)分析儀為美國(guó)Cellular Techology Ltd.公司產(chǎn)品，由中國(guó)人民解放軍第309醫(yī)院結(jié)核病研究所免費(fèi)進(jìn)行檢測(cè)；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板為美國(guó)MILIPOR公司產(chǎn)品。CFP10/ESAT6融合蛋白由中國(guó)人民解放軍第309醫(yī)院結(jié)核病研究所提供[5]；結(jié)核菌素純蛋白衍生物(purified protein derivative，PPD)購(gòu)自廣州龍成藥業(yè)有限公司；鏈親和素-堿性磷酸酶、5-溴- 4-氯- 3-吲哚磷酸鹽(5-bromo- 4-chloro- 3-indolyl phosphate，BCIP)和硝基藍(lán)四氮唑(nitro blue tetrazolium，NBT)底物、人IFN-γ捕獲抗體和人IFN-γ檢測(cè)抗體購(gòu)自瑞士Mabtech AB公司；植物血凝素購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；淋巴細(xì)胞分離液(Ficoll-Paque PLUS)購(gòu)自美國(guó)GE公司；人抗結(jié)核桿菌酶聯(lián)免疫分析試劑盒購(gòu)自上海奧普生物醫(yī)藥有限公司；羅氏培養(yǎng)管購(gòu)自河南美凱生物有限公司。

ELISPOT試驗(yàn)包被微孔板上每孔加入100 μl稀釋IFN-γ捕獲單克隆抗體，4 ℃冰箱過(guò)夜。每位患者采集3~4 ml外周血，用淋巴細(xì)胞分層液分離(23 ℃，2500 r/min，離心20 min)、提純PBMC，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至2.5×106/L。

每個(gè)樣本使用3個(gè)孔檢測(cè)分泌IFN-γ的T細(xì)胞：在陰性對(duì)照孔內(nèi)加入完全細(xì)胞培養(yǎng)液50 μl，在陽(yáng)性對(duì)照孔內(nèi)加入陽(yáng)性對(duì)照植物血凝素50 μl，在檢測(cè)孔內(nèi)加入CFP10/ESAT6融合蛋白50 μl。在3個(gè)孔內(nèi)加入100 μl含2.5×105個(gè)PBMC的懸液，將微孔板置于37 ℃含5%CO2的孵箱中孵育20 h。棄上清液，裂解細(xì)胞后，用200 μl 1×PBS洗板7次，每次l min。每孔加入100 μl的檢測(cè)抗體，37 ℃孵育1 h。洗板后，每孔加入100 μl鏈親和素-堿性磷酸酶，室溫孵育30 min。洗板后，每孔加入100 μl新鮮配制的BICP/NBT底物。顯色15 min，可見(jiàn)板底顯示紫色斑點(diǎn)，用滅菌水洗板終止反應(yīng)。每1個(gè)點(diǎn)代表1個(gè)分泌IFN-γ的T細(xì)胞，采用酶聯(lián)斑點(diǎn)分析儀計(jì)數(shù)著色的斑點(diǎn)。

結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：陰性對(duì)照孔和陽(yáng)性對(duì)照孔起質(zhì)量控制作用。根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)受試者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲線確定的陽(yáng)性閾值[6]，陽(yáng)性結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)為：(1)空白對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)<17時(shí)，檢測(cè)孔斑點(diǎn)數(shù)-空白對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)≥17；(2)空白對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)≥17時(shí)，檢測(cè)孔斑點(diǎn)數(shù)≥空白對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)×2。如果不符合上述標(biāo)準(zhǔn)且陽(yáng)性對(duì)照孔正常(陽(yáng)性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)應(yīng)>20個(gè)或遍布整個(gè)反應(yīng)孔)，檢測(cè)結(jié)果為陰性(圖1)。

ELISPOT試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)化與質(zhì)量控制由于ELISPOT試驗(yàn)的敏感性很高[6]，斑點(diǎn)形成容易受到諸多因素影響。本課題組前期的相關(guān)研究已建立了一套標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)操作規(guī)范[6]。該項(xiàng)檢測(cè)由1名經(jīng)過(guò)嚴(yán)格ELISPOT檢測(cè)培訓(xùn)的人員完成，并且檢測(cè)過(guò)程中確保了實(shí)驗(yàn)設(shè)備、試劑、耗材的選擇標(biāo)準(zhǔn)化。

抗酸桿菌涂片及抗結(jié)核抗體檢測(cè)將術(shù)前穿刺和術(shù)中收集的膿液標(biāo)本經(jīng)離心沉淀，少量生理鹽水混勻沉淀物，均勻涂抹于載玻片上，自然干燥后行抗酸染色鏡檢。采用人抗結(jié)核桿菌酶聯(lián)免疫分析試劑盒檢測(cè)抗結(jié)核抗體。

結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)將術(shù)前穿刺和術(shù)中收集的膿液標(biāo)本經(jīng)消化處理，接種于羅氏培養(yǎng)管內(nèi)，37 ℃培養(yǎng)4~8周，每周觀察1次，記錄培養(yǎng)結(jié)果。

PPD皮膚試驗(yàn)在抽完靜脈血(ELISPOT使用)后，吸取0.1 ml PPD稀釋液(含5 U PPD)注射于前臂掌側(cè)皮內(nèi)。于注射后72 h檢查注射部位反應(yīng)，硬結(jié)的橫徑及縱徑的平均數(shù)≥5 mm為陽(yáng)性。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，以敏感性、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值來(lái)評(píng)價(jià)各種檢測(cè)方法；計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)，兩兩樣本率的比較采用χ2分割法；不同檢測(cè)方法間一致性比較采用Kappa一致性相關(guān)分析；P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

標(biāo)本獲取及檢測(cè)情況入選的91例患者均接受了ELISPOT、PPD皮膚試驗(yàn)和血清抗結(jié)核抗體檢測(cè)。脊柱結(jié)核組中有47例接受了活檢穿刺病理檢測(cè)，42例行抗酸桿菌涂片檢查，40例行結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)(表1)。

ELISPOT試驗(yàn)與臨床常用診斷方法比較脊柱結(jié)核組中病灶抗酸桿菌涂片和結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)的陽(yáng)性率分別為35.7%和57.5%。本研究91例患者中，ELISPOT試驗(yàn)呈陽(yáng)性結(jié)果的有48例(圖1)。PPD皮膚試驗(yàn)的敏感性、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值分別為61.5%、46.2%、60.4%和47.4%；血清抗結(jié)核抗體試驗(yàn)的敏感性、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值分別為55.8%、61.5%、65.9%和51.1%；ELISPOT試驗(yàn)的敏感性、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值分別為82.7%、87.2%、89.6%和79.1%。在脊柱結(jié)核組中，ELISPOT試驗(yàn)的總體陽(yáng)性率顯著高于PPD皮膚試驗(yàn)(P=0.016)和血清抗結(jié)核抗體試驗(yàn)(P=0.003)(表1)。經(jīng)配對(duì)χ2檢驗(yàn)，脊柱結(jié)核組中ELISPOT試驗(yàn)結(jié)果與PPD皮膚試驗(yàn)(P=0.013)和血清抗結(jié)核抗體試驗(yàn)(P=0.003)結(jié)果比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.688)(表2)。對(duì)脊柱結(jié)核組患者中ELISPOT試驗(yàn)結(jié)果與PPD皮膚試驗(yàn)、抗結(jié)核抗體試驗(yàn)和病理學(xué)檢查結(jié)果進(jìn)行一致相關(guān)性分析的結(jié)果顯示，病理學(xué)檢查與ELISPOT試驗(yàn)結(jié)果一致性較好(87.2%，κ=0.498，P=0.001，表3)。

討論

目前脊柱結(jié)核的診斷主要依據(jù)患者的臨床表現(xiàn)、影像學(xué)檢查及病灶的病理改變。細(xì)菌學(xué)檢查是脊柱結(jié)核確診的重要方法，但其培養(yǎng)技術(shù)仍然滯后，陽(yáng)性率較低，現(xiàn)行的實(shí)驗(yàn)室病原學(xué)檢測(cè)及菌種鑒定方法遠(yuǎn)不能滿足臨床輔助診斷的需求[7]。本研究中脊柱結(jié)核組患者病灶結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)的陽(yáng)性率僅為57.5%。免疫學(xué)檢查的價(jià)值雖然不如細(xì)菌學(xué)檢查，但較為簡(jiǎn)便、快速，又有一定的敏感性和特異性，不失為輔助診斷結(jié)核病的有效方法，尤其適用于肺外結(jié)核患者[8]。

近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的ELISPOT技術(shù)是一種新型的免疫酶技術(shù)，為早期發(fā)現(xiàn)結(jié)核病提供了新的方向[9- 10]。在結(jié)核性胸膜炎、皮膚結(jié)核、骨結(jié)核等肺外結(jié)核的輔助診斷中，ELISPOT顯示了良好的敏感性和特異性[11- 14]。Hill等[15]研究表明，以CFP10/ESAT6融合蛋白刺激T淋巴細(xì)胞可取得同樣的檢測(cè)效果。本課題組前期研究證實(shí)，以CFP10/ESAT6融合蛋白為抗原的ELISPOT技術(shù)在肺結(jié)核中有良好的診斷效果[16]。劉菲等[17]研究結(jié)果表明，ESAT6/CFP10-ELISPOT可作為輔助診斷初治肺結(jié)核的較為準(zhǔn)確的方法。本研究也顯示了以CFP10/ESAT6融合蛋白為抗原的ELISOPT技術(shù)在脊柱結(jié)核輔助診斷中的應(yīng)用價(jià)值，而且通過(guò)基因工程大量制備重組蛋白的費(fèi)用低于多肽合成，故本方法可以明顯降低檢測(cè)費(fèi)用。

本研究中，ELISPOT技術(shù)在脊柱結(jié)核患者中的診斷陽(yáng)性率為82.7%，顯著高于PPD皮膚試驗(yàn)的61.5%和血清抗結(jié)核抗體試驗(yàn)的55.8%。Lai 等[13]采用T-SPOT.TB試劑盒檢測(cè)骨結(jié)核的陽(yáng)性率為86.7%(其中9例脊柱結(jié)核的陽(yáng)性率為100%)，但該試劑盒的特異性為61.9%，本研究所采用ELISOPT的特異性為87.2%。脊柱結(jié)核組52例患者中有47例接受了病灶組織活檢，其中經(jīng)病理確診的41例患者中有37例ELISPOT結(jié)果呈陽(yáng)性；病灶結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性的23例患者ELISPOT結(jié)果均為陽(yáng)性。在脊柱結(jié)核患者中，ELISPOT試驗(yàn)的陽(yáng)性率與病理學(xué)結(jié)果的陽(yáng)性率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且一致性較好。上述結(jié)果提示，CFP10/ESAT6-ELISPOT技術(shù)可為脊柱結(jié)核感染患者提供有效的輔助診斷依據(jù)，特別是在患者病灶無(wú)法獲得、暫無(wú)細(xì)菌學(xué)結(jié)果時(shí)。

表 1　脊柱結(jié)核組中ELISPOT試驗(yàn)與臨床常用結(jié)核診斷方法的比較(n=52)

ELISPOT：酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)；PPD：結(jié)核菌素純蛋白衍生物；與ELISPOT比較，aP=0.016，bP=0.003

ELISPOT：enzyme-linked immunospot；PPD：tuberculin purified protein derivative；aP=0.016，bP=0.003 compared with ELISPOT

A.對(duì)照組(非脊柱結(jié)核疾病)ELISPOT結(jié)果陰性；B.脊柱結(jié)核組ELISPOT結(jié)果陽(yáng)性

A. negative result of ELISPOT assay in a patient in the control group(non-spinal tuberculosis)；B. positive result of ELISPOT assay in a patient in the spinal tuberculosis group

圖 1ELISPOT檢測(cè)外周血中分泌干擾素-γ的淋巴細(xì)胞的代表性結(jié)果

Fig 1Representative results of ELISPOT assay detecting interferon-γ-secreting lymphocytes in peripheral blood

表 2　脊柱結(jié)核組ELISPOT檢測(cè)與PPD皮膚試驗(yàn)、抗結(jié)核抗體試驗(yàn)和病理學(xué)檢查的配對(duì)比較(n)

表 3　脊柱結(jié)核組中ELISPOT試驗(yàn)與PPD皮膚試驗(yàn)、抗結(jié)核抗體試驗(yàn)和病理學(xué)檢查的一致性分析

本研究也存在一些不足。在入選的52例脊柱結(jié)核患者中，有10例合并免疫功能缺陷，其中僅1例PPD皮膚試驗(yàn)呈陽(yáng)性，5例ELISPOT結(jié)果呈陽(yáng)性。PPD皮膚試驗(yàn)結(jié)果在很大程度上受患者免疫功能的影響，合并免疫功能缺陷的結(jié)核患者PPD陽(yáng)性率較低[4]，因此本研究中PPD陽(yáng)性率偏低。由于這部分病例較少，筆者沒(méi)有分亞組討論ELISPOT技術(shù)在脊柱結(jié)核合并免疫功能缺陷患者中的診斷應(yīng)用價(jià)值，可作為下一步研究的方向。同時(shí)，本研究組計(jì)劃進(jìn)一步通過(guò)多中心、大樣本研究，驗(yàn)證ELISPOT技術(shù)在脊柱結(jié)核感染診斷中的應(yīng)用價(jià)值。綜上，以CFP10/ESAT6融合蛋白為抗原的ELISPOT技術(shù)檢測(cè)脊柱結(jié)核感染有良好的敏感性和特異性，可考慮作為脊柱結(jié)核感染的重要輔助診斷方法。

參考文獻(xiàn)

[1]Wasay M，Arif H，Khaealani B，et al. Neuroimaging of tuberculous myelitis：analysis of ten cases and review of literature [J]. J Neuroimaging，2006，16(3)：197- 205.

[2]Kim SH，Choi SJ，Kim HB，et al. Diagnostic usefulness of a T-cell based assay for extrapulmonary tuberculosis [J]. Arch Intern Med，2007，167(20)：2255- 2259.

[3]Norbis L，Alagna R，Tortoli E，et al. Challenges and perspectives in the diagnosis of extrapulmonary tuberculosis [J]. Expert Rev Anti Infect Ther，2014，12(5)：633- 647.

[4]Jung JY，Lim JE，Lee HJ，et al. Questionable role of interferon-γ assays for smear-negative pulmonary TB in immunocompromised patients [J]. J Infect，2012，64(2)：188- 196.

[5]陽(yáng)幼榮，吳雪瓊，張俊仙，等. 結(jié)核分枝桿菌CFP10-ESAT6重組融合蛋白抗原血清學(xué)診斷價(jià)值[J].中國(guó)感染控制雜志，2011，10(4)：241- 243，247.

[6]Wu XQ，Li QK，Liang Y，et al. Clinical evaluation of a homemade enzyme-linked immunospot assay for the diagnosis of active tuberculosis in China [J]. Mol Biotechnol，2011，47(1)：18- 25.

[7]劉麗英，董小青，王丹敏.幾種常見(jiàn)的結(jié)核桿菌快速檢測(cè)方法[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2004，14(3)：341- 342.

[8]霍菲菲，張麗帆，劉曉清. 評(píng)價(jià)γ干擾素釋放分析T-SPOT.TB在肺外結(jié)核病診斷中的敏感性[J]. 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，31(4)：449- 452.

[9]Cho OH，Park KH，Kim SM，et al. Diagnostic performance of T-SPOT.TB for extrapulmonary tuberculosis according to the site of infection [J]. J Infect，2011，63(5)：362- 369.

[10]施建黨，王自立.非典型脊柱結(jié)核的早期診斷[J]. 中國(guó)脊柱脊髓雜志，2010，20(5)：432- 434.

[11]Lee LN，Chou CH，Wang JY，et al. Enzyme-linked immunospot assay for interferon-gamma in the diagnosis of tuberculous pleurisy [J]. Clin Microbiol Infect，2009，15(2)：173- 179.

[12]Lai CC，Tan CK，Lin SH，et al. Diagnostic value of an enzyme-linked immunospot assay for interferon-γ in cutaneous tuberculosis[J]. Diagn Microbiol Infect Dis，2011，70(1)：60- 64.

[13]Lai CC，Tan CK，Liu WL，et al. Diagnostic performance of an enzyme-linked immunospot assay for interferon-γ in skeletal tuberculosis [J]. Eur J Clin Microbiol Infect Dis，2011，30(6)：767- 771.

[14]Cho OH，Park SJ，Park KH，et al. Diagnostic usefulness of a T-cell-based assay for osteoarticular tuberculosis [J].J Infect，2010，61(3)：228- 234.

[15]Hill PC，Jackson-Sillah D，F(xiàn)ox A，et al. ESAT- 6/CFP- 10 fusion protein and peptides for optimal diagnosis of Mycobacterium tuberculosis infection byexvivoenzyme-linked immunospot assay in the Gambia [J].J Clin Microbiol，2005，43(5)：2070- 2074.

[16]李嶠珂，吳雪瓊，陽(yáng)幼榮，等. CFP10/ESAT6融合蛋白-ELISPOT方法的建立及其在結(jié)核分枝桿菌感染診斷中的應(yīng)用價(jià)值[J]. 中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2010，26(6)：551- 554.

[17]劉菲，張宗德，操敏，等. 酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)檢測(cè)和結(jié)核菌素試驗(yàn)在初治肺結(jié)核中的輔助診斷價(jià)值[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，31(4)：443- 448.

·論著·

Traditional Chinese Medicine，Guangzhou 510405，China

2Army Tuberculosis Key Laboratory，Institute for Tuberculosis Research，the 309th

Hospital of PLA，Beijing 100091，China

3Department of Spine Orthopedics，Nanfang Hospital，Southern Medical University，Guangzhou 510515，China

Corresponding author：LIANG DeTel：020- 36591604，E-mail：liangde99@sina.com

ABSTRACT：ObjectiveTo establish a method of detecting spinal tuberculosis(TB)infection by enzyme-linked immunospot(ELlSPOT)assay and evaluate the value of CFP10/ESAT6 fusion protein for diagnosis of spinal TB.MethodsSuspected spinal TB patients were prospectively recruited in two hospitals(First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine；Nanfang Hospital，Southern Medical University)from May 2012 to December 2013. Data on clinical characteristics of the patients and conventional laboratory results were collected. Compare and analyze the positive detection rate in spinal TB diagnosis by different methods including ELISPOT detection and conventional detection methods. Results47 patients with spinal TB had available biopsy or surgical specimens for histopathological examination and 41 specimens had pathological features consistent with a diagnosis of TB infection. Among the spinal TB patients and non-TB disease patients，the overall sensitivity，specificity，positive predictive value，and negative predictive value of the ELISPOT assay in spinal TB diagnosis were 82.7%，87.2%，89.6%，and 79.1%，respectively；the 4 indexes of the PPD skin test were 61.5%，46.2%，60.4%，and 47.4%，respectively；those of the antibody detection were 55.8%，61.5%，65.9%，and 51.1%. The positive rate of ELISPOT was significantly higher than those of PPD skin test and antibody detection test(82.7% vs. 61.5%，χ2=5.786，P=0.016；82.7% vs. 55.8%，χ2=8.847，P=0.003)，but not significantly different from the positive rate of pathological examination(82.7% vs. 87.2%，χ2=0.396，P=0.529). Moderate agreement was found between pathological examination and the ELISPOT assay(87.2%，κ=0.498，P=0.001). ConclusionWith high sensitivity and specificity，the ELISPOT assay using CFP10/ESAT6 fusion protein as antigen is an effective technique for auxiliary diagnosis of spinal TB.

Key words：spinal tuberculosis；enzyme-linked immunospot assay；CFP10/ESAT6 fusion protein；auxiliary diagnosis

收稿日期：(2014- 05- 12)

DOI：10.3881/j.issn.1000- 503X.2015.01.008

中圖分類號(hào):R529.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào)：1000- 503X(2015)01- 0044- 06

通信作者：梁德電話：020- 36591604，電子郵件：liangde99@sina.com