具有AHL 降解能力的海洋微生物的篩選與鑒定

趙 晶，李 天，金黎明，權(quán)春善

(大連民族學(xué)院 生物技術(shù)與資源利用國(guó)家民委－教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連116605)

群體感應(yīng)(quorum sensing，QS)是廣泛存在于細(xì)菌個(gè)體及種群之間的信息交流機(jī)制，細(xì)菌能夠感知自身合成信號(hào)分子的濃度變化，當(dāng)信號(hào)分子濃度達(dá)到閾值時(shí)，能夠啟動(dòng)一系列基因的表達(dá)，從而調(diào)控多種生物學(xué)功能，包括致病力、生物發(fā)光、抗生素的產(chǎn)生以及生物膜的形成等。酰基高絲氨酸內(nèi)酯(acyl homoserine lactones，AHLs)是革蘭氏陰性細(xì)菌的主要信號(hào)分子［1－3］。對(duì)AHLs 進(jìn)行生物降解，能夠有效抑制革蘭氏陰性細(xì)菌的群體感應(yīng)［4－6］，對(duì)于阻斷病原菌的發(fā)病機(jī)制、降低其致病性具有重要意義。

自從在革蘭氏陰性菌中發(fā)現(xiàn)AHL 調(diào)控的群體感應(yīng)系統(tǒng)以來(lái)，研究者從陸生微生物中篩選、鑒定出多種具有AHL 降解能力的微生物［7－10］。但海洋中具有AHL 降解能力的微生物資源尚未得到充分開發(fā)。本研究從西南印度洋海泥中篩選具有AHL 降解能力的菌株，以豐富具有AHL 降解能力的微生物資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 海泥

本實(shí)驗(yàn)所用的海泥樣品由中國(guó)大洋生物樣品館提供，采自西南印度洋海區(qū)，樣品編號(hào)分別為DY115 －20V－S16 －TVG6、DY115 －20V －S12 －TVG4、DY115 － 21IV － S1 － TVG1 和DY115 －21IV－S11 －TVG8，實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 報(bào)告菌株

報(bào)告菌株為紫色視桿菌Chromobacterium Violaceum 026，由新加坡分子與細(xì)胞生物學(xué)研究所Lianhui Zhang 教授饋贈(zèng)。該指示菌為野生型紫色視桿菌的mini－Tn5 突變體，不能產(chǎn)生紫色色素。外源AHLs 能夠激活其QS 系統(tǒng)(CviI/R)，使其產(chǎn)生紫色色素。

1.2 試劑

信號(hào)分子N － 己?；呓z氨酸內(nèi)酯(C6 －HSL)由本實(shí)驗(yàn)室制備，合成方法按照參考文獻(xiàn)［11］進(jìn)行?；蚪MDNA 提取試劑盒購(gòu)自福際生物技術(shù)有限公司，PCR 用Taq 酶、dNTPs 等試劑及電泳用Marker、loading buffer 等試劑購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 培養(yǎng)基

LB 培養(yǎng)基:蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，蒸餾水定容至1 L，pH 7.2。培養(yǎng)基中加入2 %瓊脂即為相應(yīng)固體培養(yǎng)基。121 ℃滅菌15 min。

海洋微生物富集培養(yǎng)基:NaCl 1.0 g，KCl 0.5 g，MgCl20. 4 g，CaCl20. 1 g，Na2SO40. 15 g，K2HPO40.2 g，2 －嗎啉乙磺酸(MES)1.0 g，蒸餾水定容至1 L，pH 5.5，121 ℃滅菌15 min。滅菌后在無(wú)菌環(huán)境下加入己?；呓z氨酸內(nèi)酯(C6 －HSL)0.5 g。

MM 培養(yǎng)基:KH2PO44.5 g，(NH4)2SO42.0 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，K2HPO410.5 g，蒸餾水定容至1 L，pH 5.5，121 ℃滅菌15 min。

1.4 方法

1.4.1 菌株富集及分離純化

以C6 －HSL 作為菌株生長(zhǎng)的唯一碳源及能源，將制備的海洋微生物富集培養(yǎng)基分裝于直徑15 cm 的試管中，每管3 mL。將海泥樣品以3 %的接種量接種于富集培養(yǎng)基中，于30 ℃、130 r·min－1搖床震蕩培養(yǎng)1 周左右，連續(xù)3 次富集培養(yǎng)后的菌液在LB 瓊脂培養(yǎng)平板上利用稀釋涂布法和劃線分離法進(jìn)行分離純化。

1.4.2 篩選菌株的AHL 降解能力檢測(cè)

分離純化后得到的菌株分別用接種環(huán)取一環(huán)，接于LB 培養(yǎng)基中，于30 ℃、180 r·min－1搖床震蕩培養(yǎng)。取7 mL 對(duì)數(shù)晚期培養(yǎng)液于無(wú)菌離心管中，4℃、8 000 r·min－1條件下離心5 min。取100 μL 上清液于無(wú)菌EP 管中，加等體積MM 培養(yǎng)基和1 μL 的信號(hào)分子C6 －HSL 溶液(0.2 mg·mL－1)，30 ℃共培養(yǎng)4 h;同時(shí)，于離心后菌體沉淀中加入0.5 mL 無(wú)菌水使其充分懸浮。取100 μL 菌懸液于無(wú)菌EP 管中，加等體積MM 培養(yǎng)基和1 μL 信號(hào)分子溶液，30 ℃共培養(yǎng)4 h。報(bào)告菌株C. Violaceum 026 于LB 瓊脂培養(yǎng)平板劃線，30℃培養(yǎng)12 ～16 h。將LB 瓊脂培養(yǎng)平板用滅菌小刀切割成4 條，排列整齊。在平板一側(cè)點(diǎn)報(bào)告菌株C. Violaceum 026，菌株間隔為0.5 cm。在平板另一側(cè)，距離最近的報(bào)告菌株點(diǎn)樣1 cm 處按次序分別上樣:無(wú)菌水5 μL、上清液與AHL 共培養(yǎng)物5 μL、菌體懸浮液與AHL 共培養(yǎng)物5 μL、1μg·mL－1的AHL 溶液5 μL，30 ℃培養(yǎng)箱過(guò)夜培養(yǎng)。48 h 后觀察顯色反應(yīng)。

1.4.3 菌株形態(tài)鑒定

將具有較強(qiáng)AHL 降解能力的菌株分別于LB瓊脂平板上劃線，30℃過(guò)夜培養(yǎng)。菌落形態(tài)觀察、革蘭氏染色及芽孢染色按照微生物實(shí)驗(yàn)手冊(cè)進(jìn)行。

1.4.4 16S rDNA PCR 擴(kuò)增和序列分析

利用基因組DNA 提取試劑盒提取具有AHL降解能力的菌株基因組DNA，以其為模板進(jìn)行16S rDNA PCR 擴(kuò)增。采用細(xì)菌16S rDNA 擴(kuò)增通用引物，正向引物16S －8f:5' － AGAGTTTGATCCTGGCTCAG － 3'，反 向 引 物16S － 1525:5' －AAAGGAGGTGATCCAGCC － 3'。PCR 反 應(yīng) 條 件為:95 ℃5 min;94 ℃30 s，50 ℃30 s，72 ℃1 min，30 個(gè)循環(huán);72 ℃10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)后，由寶生物工程(大連)有限公司測(cè)序。將所測(cè)菌株的16S rDNA 序列與GenBank 核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行比對(duì)。利用MEGA 5 軟件進(jìn)行同源性分析，建立系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品富集培養(yǎng)及菌株分離純化

利用富集培養(yǎng)基對(duì)海泥中微生物進(jìn)行富集，一周后培養(yǎng)基變渾濁，證明海泥中存在能夠利用AHL 的微生物。分離純化后從西南印度洋海泥中共篩選出5 株可能具有C6 －HSL 降解活性的菌株，分別命名為S1、S2、S3、S4、S5(如圖1)。

圖1 分離純化菌株的形態(tài)特征

2.2 所篩菌株的AHL 降解能力檢測(cè)

將初篩所得的5 株海洋菌進(jìn)行AHL 降解能力檢測(cè)，以C.Violaceum 026 為報(bào)告菌株，以無(wú)菌水為陰性對(duì)照、C6 －HSL 為陽(yáng)性對(duì)照，采用瓊脂切條法進(jìn)行AHL 降解能力確定(如圖2)?？梢奡1、S4、S5 3 株菌培養(yǎng)液進(jìn)行離心后，其上清液與C6 －HSL 的共培養(yǎng)物和菌體懸浮液與C6 －HSL 的共培養(yǎng)物均能使報(bào)告菌株C. Violaceum 026 顯紫色，表明這3 株菌不能分泌降解C6 －HSL 的酶;相反地，S2、S3 的菌體懸浮液與C6 －HSL 的共培養(yǎng)物不能使報(bào)告菌顯紫色，其上清液與C6 －HSL 的共培養(yǎng)物則能夠使菌體顯紫色。結(jié)果表明，S2、S3 菌株的菌體懸浮液具有很強(qiáng)的C6 －HSL 降解能力，可能含有胞內(nèi)AHL 降解酶。

圖2 菌株S1、S2、S3、S4、S5 AHL 降解能力鑒定

2.3 具有AHL 降解能力的菌株鑒定

2.3.1 形態(tài)特征鑒定

對(duì)S2、S3 菌株進(jìn)行形態(tài)特征鑒定(見表1)，確定這2 株菌均為革蘭氏陽(yáng)性菌，屬芽孢桿菌。

表1 S2、S3 形態(tài)特征鑒定

2.3.2 16S rDNA PCR 擴(kuò)增和系統(tǒng)發(fā)育分析

對(duì)菌株S2、S3 的基因組DNA 提取后進(jìn)行瓊脂糖電泳(如圖3)，以基因組為模板分別進(jìn)行16S rDNA PCR 擴(kuò)增(如圖4)，電泳檢測(cè)得到二條約1 500 bp的產(chǎn)物，與預(yù)期的大小一致。對(duì)S2、S3 的16S rDNA 測(cè)序，分別得到1 467 bp 大小的序列。將菌株S2、S3 的16S rDNA 序列與GenBank 中已登記的16S rDNA 序列進(jìn)行同源性比對(duì)，發(fā)現(xiàn)S2、S3 與芽孢桿菌屬的16S rDNA 自然類聚。

圖3 S2、S3 基因組DNA 電泳圖

圖4 S2、S3 的16S rDNA PCR 產(chǎn)物的電泳檢測(cè)

選取14 株與其同源性較高的序列，與菌株S2、S3 分別構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(如圖5)。可以發(fā)現(xiàn)S2、S3 與Bacillus amyloliquefaciens strain VJ －1 的親緣關(guān)系最近。

圖5 菌株S2、S3 以16SrDNA 為基礎(chǔ)的細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育樹

3 結(jié) 論

本研究主要對(duì)西南印度洋海泥中的AHL 降解菌進(jìn)行篩選及鑒定。以C6 －HSL 為唯一碳源和能源對(duì)海泥中微生物進(jìn)行富集，篩選得到5 株形態(tài)不同的菌株。采用瓊脂切條檢測(cè)法，利用紫色視桿菌C. Violaceum 026 對(duì)5 株菌進(jìn)行AHL 降解能力檢測(cè)，確定菌株S2、S3 可能含有胞內(nèi)AHL降解酶。經(jīng)菌株形態(tài)和16SrDNA 序列分析，菌株S2、S3 均為芽孢桿菌屬。選取芽孢桿菌屬14 個(gè)種的16s rDNA 基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，菌株S2、S3 與B. amyloliquefaciens 的親緣關(guān)系最近，初步確定這2 株菌為解淀粉芽孢桿菌。

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