霜霉菌侵染對三裂葉豚草葉綠體和木質(zhì)素作用的影響

楊 紅，呂國忠，趙志慧，孫曉東，劉紹芹，蘇 丹

(1.大連民族學院 環(huán)境與資源學院，遼寧 大連116605;2.黑龍江八一農(nóng)墾大學 會計學院，黑龍江 大慶163319)

外來入侵物種(invasive alien species，IAS)對自然生態(tài)系統(tǒng)、生物多樣性造成了嚴重危害，中國僅幾種主要外來入侵物種所造成的經(jīng)濟損失就高達574 億元［1］。三裂葉豚草(Ambrosia trifida L. )又名大破布草，英文名giant ragweed，是菊科(Compositae)豚草屬植物，原產(chǎn)北美，近年來在中國東北、華北地區(qū)不斷蔓延危害［2］。三裂葉豚草植株的競爭和適應能力很強，其產(chǎn)生的花粉嚴重污染環(huán)境，對人類健康和作物生產(chǎn)形成巨大威脅，是高度危險的外來入侵物種。目前，三裂葉豚草的防治方法主要以化學防治和人工拔除為主，但隨著抗磺草胺類除草劑三裂葉豚草種群的出現(xiàn)［3-4］，使化學防治也面臨嚴峻挑戰(zhàn)［5］。因此，尋找更為有效的防控方法一直是豚草防治的一項重要工作。專性寄生菌被很多研究者認為是非常好的生防因子［6-9］。早在40 年前北美洲就報道了普通豚草(A. artemisiifolia)上的霜霉病［10-11］，相繼匈牙利有豚草霜霉病的發(fā)生［12-14］，之后劉紹芹等，報道了中國豚草軸霜霉菌引起的三裂葉豚草霜霉?。?5］。從超微結構和分子細胞學角度研究病菌與寄主的相互關系是當代植物病理學中極受重視的研究領域之一［16-18］。蒼耳軸霜霉菌是專性寄生菌，劉紹芹曾對包括玉米、小麥、水稻、大豆等23 種不同寄主接種蒼耳軸霜霉菌，結果表明，該菌只能成功侵染蒼耳，而對其他寄主無侵染力，因此可作為重要防治三裂葉豚草的生防菌資源［19］。

本文利用生物電鏡技術和細胞化學方法對蒼耳軸霜霉菌侵染過程中對寄主葉片中的葉綠體和木質(zhì)素的影響進行初步探索，為深入研究蒼耳軸霜霉菌的致病機理奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

將2012 年秋季于沈陽農(nóng)業(yè)大學校園采集的健康、飽滿的三裂葉豚草種子播種于直徑9 cm 的溫室花盆中，待幼苗長至2 ～4 對葉時接種。蒼耳軸霜霉菌采集于2013 年5 月28 日至6 月15 日，加水配制成100 個·mL-1孢子懸浮液，采用噴霧法接種，保濕培養(yǎng)12 h 后，溫室內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，取發(fā)病葉片進行顯微與超微結構觀察。

1.2 木質(zhì)素沉積的染色觀察

分別將健康和感病的三裂葉豚草葉片用直徑4 mm 的打孔器打成圓片，置于95 %酒精和冰醋酸(體積比1∶1)的混合液中固定24 h，再將材料放于飽和水合氯醛中透明一周后再轉入無水乙醇中放置2 d，存于蒸餾水中。用1 mL 1 %間苯三酚(溶于70 %乙醇中)處理透明過的葉片組織3～6 min，吸干水，用1 mol·L-1的鹽酸處理2 ～5 min，在恒溫展臺加熱95 ℃30 min 以上，待葉片透明變色后觀察［20］。

1.3 透射電鏡樣品的制備及觀察

透射電鏡樣品的制備參考付洪蘭的方法［21］。取新鮮的帶有霜霉菌的病葉，將其切成1 ～2 mm的樣品。用1 % ～5 %戊二醛前固定、1 %鋨酸后固定，經(jīng)丙酮逐級脫水、環(huán)氧樹脂浸透、包埋劑包埋，通過超薄切片機制作5 ×10-1～7 ×10-1nm 的切片，自然干燥。用4 % 醋酸雙氧鈾與枸椽酸鉛滴染后，進行JEM -2000EX 透射電子顯微鏡觀察。

2 結果與分析

2.1 霜霉菌侵入后三裂葉豚草木質(zhì)素沉積情況觀察

經(jīng)制片觀察，霜霉菌侵染三裂葉豚草葉片后，正常葉片葉脈導管界限清晰(如圖1a)，霜霉菌侵入葉片后導管間木質(zhì)素沉積量明顯增多，這表明霜霉菌的侵入，激發(fā)了三裂葉豚草葉片防御反應，侵染部位開始有木質(zhì)素的沉積。由圖1b 可以看到被侵染部位已嚴重木質(zhì)化。

圖1 病菌侵染對三裂葉豚草葉片木質(zhì)素的影響

2.2 霜霉菌侵入后三裂葉豚草葉綠體的超微結構觀察

通過對霜霉菌侵染的三裂葉豚草葉片的超微結構觀察，發(fā)現(xiàn)正常細胞中的細胞器較多，葉綠體形狀完整(如圖2a);而霜霉菌可以破壞葉片組織，使葉綠體膜破碎，內(nèi)含物流失而中空，從而導致葉片的光和能力降低，營養(yǎng)物質(zhì)下降，植株生長受到抑制，但對線粒體無明顯破壞作用(如圖2b)。

圖2 霜霉菌侵染對三裂葉豚草葉片葉綠體的影響

3 討 論

木質(zhì)素是植物體內(nèi)一種重要的物理抗菌物質(zhì)，在與病原菌相互作用中，寄主細胞壁木質(zhì)化是抗病反應的特征之一，有強固細胞壁、保護細胞免受病原菌侵害的作用［22］。本研究中，霜霉菌侵染三裂葉豚草后，出現(xiàn)木質(zhì)素明顯沉積。這與黃瓜霜霉病菌侵染黃瓜葉片后木質(zhì)素含量提高有相似之處［23］。木質(zhì)素含量的提高可以提高葉片細胞壁的木質(zhì)化程度，從而提高細胞壁的機械強度，阻止水分和營養(yǎng)向霜霉菌流動，在一定程度上限制霜霉菌侵染點向外擴散，控制病斑發(fā)展，同時大量木質(zhì)素積累也阻止了葉片其他部位對受侵染部位水分和營養(yǎng)的供給，致使豚草葉片的光能利用率降低，產(chǎn)生營養(yǎng)物質(zhì)的能力下降，三裂葉豚草的有效供給養(yǎng)分降低，從而抑制其營養(yǎng)生長及生殖生長。

通過對霜霉菌侵染后三裂葉豚草葉片結構的觀察，發(fā)現(xiàn)霜霉菌侵染對三裂葉豚草葉片光合代謝產(chǎn)生了較大影響。霜霉菌可以破壞葉片組織，使葉綠體膜破碎，內(nèi)含物流失而中空，導致葉片的光和能力降低，但對線粒體無明顯破壞作用，這說明霜霉菌侵染三裂葉豚草后，先以破壞植物葉綠體為主。而蒼耳柄銹菌侵染三裂葉豚草后，當葉片細胞即將壞死時，一些細胞器如線粒體、高爾基體等已先于葉綠體解體，使葉綠體中的淀粉粒逐漸減少，最終隨葉綠體的解體而迅速消失，進而改變了細胞膜的通透性，使細胞內(nèi)容物流失，最后導致細胞崩解，嚴重破壞三裂葉豚草的生長發(fā)育［24］，這與本研究中葉綠體先于線粒體受損的結果不一致。病菌侵入植物葉片后，往往都會不同程度造成寄主細胞器結構、功能上的損傷［18，25，26］，但致病菌及寄主互作機制卻會存在一定差異。由于豚草霜霉菌目前只能利用寄主繁殖，其發(fā)病條件會受到各種環(huán)境因子的影響，因此，有關霜霉菌侵染三裂葉豚草的組織細胞學變化還需深入研究，特別是有關蒼耳軸霜霉菌與三裂葉豚草之間的互作關系，將是充分發(fā)揮霜霉菌作為三裂葉豚草生物防治潛力因子的重要研究內(nèi)容。

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