刺參性腺中6種磷脂含量的HPLC-ELSD分析

朱瑤，陳慧民，盧航，高銘陽(yáng)，溫馨，胡建恩

(大連海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧大連116023)

中國(guó)共有140多種海參，其中大約有20種可食用［1］。海參含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、微量元素、黏多糖、脂肪酸，是滋補(bǔ)珍品。國(guó)內(nèi)外有大量關(guān)于海參體壁營(yíng)養(yǎng)成分的研究報(bào)道，但關(guān)于海參加工副產(chǎn)物的研究較少。海參性腺又稱為海參花，是高級(jí)美味的食材。與海參體壁相比，海參性腺中還含有豐富的性腺色素、磷脂等，但對(duì)海參性腺磷脂的研究目前卻尚未見(jiàn)報(bào)道。

海洋磷脂是重要的功能性組分，以磷脂酰膽堿和磷脂酰乙醇胺為主。海洋磷脂中含有大量二十二碳六烯酸 (DHA)和二十碳五烯酸 (EPA)等ω-3不飽和脂肪酸［2］，具有較高的生物活性。磷脂分析常用的方法有薄層色譜 (TLC)、高效液相色譜(HPLC)、質(zhì)譜 (MS)、氣質(zhì)聯(lián)用 (C-MS)技術(shù)等，隨著質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，更為強(qiáng)大的LC-MS方法也用于磷脂的定向定量分析中。LC-MS方法不僅能將磷脂組間分離定量，還有助于檢測(cè)未分離的同類磷脂化合物［3-4］。HPLC是目前磷脂分離和定性定量分析中最常用的方法，紫外檢測(cè)器 (UV)和蒸發(fā)光散射檢測(cè)器 (ELSD)是常用檢測(cè)器。其中，ELSD的響應(yīng)信號(hào)獨(dú)立于分子中的雙鍵數(shù)目，也比UV檢測(cè)器更為靈敏，并且ELSD在梯度洗脫程序中能提供穩(wěn)定的基線［5］，因此，ELSD越來(lái)越多地用于磷脂的高效液相色譜分析。

正相色譜分離不同種類的磷脂主要基于頭部基團(tuán)極性大小;而反相色譜分離磷脂主要基于磷脂上脂肪酸?；湹氖杷圆煌?。但相比而言，后者一般分離度較差，峰重合嚴(yán)重［3］。正相色譜分析磷脂的流動(dòng)相一般分為兩類:正己烷-異丙醇-水體系和氯仿-甲醇-水 (氨水)體系。前者多使用等度洗脫，分離過(guò)程中往往存在分離時(shí)間長(zhǎng)、峰形擴(kuò)散嚴(yán)重、定量不穩(wěn)定等問(wèn)題［6］;而后者因氯仿本底吸收很高，故搭配ELSD檢測(cè)器進(jìn)行梯度洗脫，對(duì)磷脂的分離效果較好。Narváez-Rivas等［7］使用氯仿-甲醇-水體系，加入三乙胺和氨水調(diào)節(jié)pH，對(duì)伊比利亞豬皮下脂肪中的心磷脂 (CL)、磷脂酰乙醇胺 (PE)、磷脂酰肌醇 (PI)、磷脂酰絲氨酸(PS)、磷脂酰膽堿 (PC)、鞘磷脂 (SM)和溶血磷脂酰膽堿 (LPC)等7種磷脂進(jìn)行了分析，均分離良好，定量穩(wěn)定。但是高效液相色譜儀中存在聚合物材質(zhì)的配件在氯仿中可能發(fā)生溶脹或收縮，影響機(jī)器的氣密性和使用壽命。本研究中，使用聚醚醚酮(PEEK)作為正相整體硅膠柱的包覆材料，為了保護(hù)高效液相色譜儀及硅膠柱，選擇正己烷-異丙醇-水體系作為流動(dòng)相梯度洗脫，對(duì)刺參性腺中的磷脂組成進(jìn)行分析，旨在為刺參性腺中磷脂的測(cè)定提供一種簡(jiǎn)單、快捷、準(zhǔn)確的分析方法，也為刺參性腺的加工利用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

刺參性腺由大連濱海海洋生物有限公司提供，于-20℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

PC、PE、PI、PS、SM、LPC標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;正己烷、異丙醇均為色譜級(jí)，購(gòu)自瑞典Oceanpak公司;氯仿、甲醇、冰乙酸等其他試劑均為分析純。高效液相色譜儀為日立LaChrom Elite系列，色譜柱為默克公司Chromolith?Performance-Si型正相硅膠色譜柱 (100 mm×4．6 mm)，蒸發(fā)光檢測(cè)器為Alltech 2000。

1.2 方法

1．2．1 總脂的提取 刺參性腺總脂的提取根據(jù)Folch等［8］的方法稍作改進(jìn)。將刺參性腺用流水解凍，使用高速組織勻漿機(jī)進(jìn)行勻漿。取小部分勻漿液進(jìn)行水分含量的測(cè)定，其余勻漿液以1∶10(g∶mL)的比例與氯仿-甲醇 (體積比為2∶1)溶液混合，攪拌，靜置10 min后抽濾，收集濾液，對(duì)濾渣重復(fù)兩次上述操作。將上述所得濾液合并至分液漏斗中，加入1/5體積的0．9%NaCl溶液，振蕩搖勻后靜置過(guò)夜，收集下層氯仿層，通過(guò)無(wú)水硫酸鈉脫水后，于45℃下真空旋蒸至干，旋蒸瓶中殘余物即為刺參性腺總脂。

1．2．2 磷脂的純化 取100 g硅膠濕法裝柱，待柱子平衡過(guò)夜后，稱取刺參性腺總脂約600 mg用少量氯仿溶解后上樣，依次用5倍柱體積的氯仿洗脫中性脂，3倍柱體積的丙酮洗脫糖脂和色素，再用甲醇將磷脂洗脫下來(lái)［2，9］，分別收集并稱重，記錄各部分含量。將磷脂溶于氯仿中，于-20℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1．2．3 HPLC-ELSD磷脂樣品的制備 吸取適量柱層析刺參性腺磷脂樣品 (PLs)氯仿溶液，用氮?dú)獯蹈珊缶_稱取殘余物質(zhì)量，按照一定濃度溶解于HPLC級(jí)正己烷-異丙醇 (體積比為3∶1)混合液中。使用前用0．22 μm孔徑的有機(jī)相濾膜過(guò)濾。

1．2．4 刺參性腺磷脂的高效液相色譜分析 用高效液相色譜儀搭配Alltech 2000蒸發(fā)光檢測(cè)器，采用三元梯度洗脫，流動(dòng)相A為正己烷 (含0．04%三乙胺)，流動(dòng)相B為異丙醇，流動(dòng)相C為13%乙酸溶液，洗脫流速為1．5 mL/min，柱溫25℃［10］。梯度洗脫程序如表1所示。

表1 梯度洗脫流動(dòng)相組成Tab.1 Composition of ternary gradient mobile phase

蒸發(fā)光檢測(cè)器采用分流模式，以空氣作為霧化氣，氣體流速為1．7 L/min，漂移管溫度為45℃。將PE、PI、PS、PC、SM、LPC標(biāo)準(zhǔn)品配制成濃度為0．6～1．0 mg/mL的溶液，分別單獨(dú)進(jìn)樣，記錄出峰時(shí)間，以對(duì)刺參性腺中的磷脂進(jìn)行定性。同時(shí)將磷脂標(biāo)準(zhǔn)品溶液梯度稀釋進(jìn)樣，以磷脂標(biāo)品含量為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用外標(biāo)法對(duì)刺參性腺磷脂中6種磷脂進(jìn)行定量。同時(shí)，對(duì)PE、PI、PS、PC、SM、LPC 6種標(biāo)準(zhǔn)樣品同一濃度重復(fù)進(jìn)樣3次，記錄峰面積，計(jì)算各類磷脂峰面積的平均值、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差與變異系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 刺參性腺中脂質(zhì)的基本組成

經(jīng)測(cè)定，刺參性腺中總脂含量為 (16．33±0．42)%(干質(zhì)量)，其中磷脂占總脂的 (49．31±0．76)%，糖脂和色素的含量為 (42．11±0．89)%，而中性脂僅占 (8．09±0．93)%。因此，刺參性腺脂質(zhì)具有低膽固醇、高磷脂、高糖脂的特性，具有良好的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。

2.2 混合磷脂標(biāo)準(zhǔn)品及刺參性腺磷脂的高效液相色譜分析

按洗脫程序，PE、PI、PS、PC、SM 和 LPC標(biāo)準(zhǔn)品混合物以及刺參性腺磷脂樣品均能達(dá)到基線分離 (圖1、圖2)且峰形良好，成單峰。每次分析均能在15 min內(nèi)完成，平衡9 min后進(jìn)下一樣品。ELSD的輸出信號(hào)與進(jìn)樣量的對(duì)應(yīng)關(guān)系比較復(fù)雜，故HPLC-ELSD用于定量分析不能采用面積歸一法。理論上，ELSD響應(yīng)值與樣品質(zhì)量為y=axb的指數(shù)函數(shù)關(guān)系，也有研究發(fā)現(xiàn)，在一定濃度范圍內(nèi)，ELSD 的響應(yīng)值與樣品質(zhì)量呈線性相關(guān)［2，7］。本試驗(yàn)中在以下標(biāo)準(zhǔn)品濃度范圍內(nèi)梯度稀釋進(jìn)樣:PE(0．25～20．00 μg)，PI(0．13～10．00 μg)，PS(0．50～ 16．00 μg)，PC(0．44 ～ 35．00 μg)，SM(0．06～6．00 μg)，LPC(0．50～20．00 μg)。以標(biāo)準(zhǔn)品含量為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，以y=axb指數(shù)函數(shù)模型和y=a+bx線性關(guān)系模型分別進(jìn)行擬合，結(jié)果兩種模型的R2均大于0．99。

圖1 6種磷脂混合標(biāo)準(zhǔn)品HPLC-ELSD圖譜Fig.1 HPLC-ELSD profile of six phospholipid standards

圖2 刺參性腺磷脂HPLC-ELSD圖譜Fig.2 HPLC-ELSD profile of phospholipids in gonad of sea cucumber Apostichopus japonicus

從表3可見(jiàn)，y=a+bx模型較y=axb模型擬合得更好。即在本研究選擇的濃度范圍內(nèi)，ELSD檢測(cè)器的輸出信號(hào)與進(jìn)樣量之間的關(guān)系是符合線性關(guān)系的，故選擇y=a+bx的線性關(guān)系模型作為磷脂定量的標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)刺參性腺中各類磷脂進(jìn)行定量。

表3 磷脂標(biāo)準(zhǔn)曲線方程及R2值Tab.3 Calibration curves and R2of the phospholipid standards

表4列出了磷脂標(biāo)準(zhǔn)品重復(fù)3次進(jìn)樣的峰面積的平均值、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差、變異系數(shù)值。由此可知，所有磷脂標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積重現(xiàn)性很好，變異系數(shù)值均小于3．5%。

表4 磷脂標(biāo)準(zhǔn)品峰面積的重現(xiàn)性Tab.4 Reproducibility of detector response of phospholipid standards

2.3 刺參性腺磷脂樣品分析

經(jīng)計(jì)算，刺參性腺中 PE、PI、PS、PC、SM磷脂的含量分別為(1．884±0．023)、(0．274±0．003)、 (0．847 ± 0．019)、 (4．637 ± 0．106)、(0．023±0．002)g/kg(磷脂樣品)，LPC 未檢出。PC、PE和PS 3種磷脂的含量較高，總含量達(dá)到7．368 g/kg(磷脂樣品)，其中 PC含量最高，為4．637 g/kg(磷脂樣品)，占總脂的22．86%，占性腺干質(zhì)量的3．73%。本試驗(yàn)中，除去已知的6種磷脂，刺參性腺磷脂中還存在其他兩種磷脂組分X1、X2，參考其他磷脂分析文獻(xiàn)，這兩種磷脂可能是磷脂酸 (PA)和磷脂酰甘油 (PG)，但也有文獻(xiàn)指出，可能存在與磷脂酰乙醇胺極性極為相近的縮醛磷脂酰乙醇胺 (pPE)［11］。對(duì)刺參性腺磷脂組成的分析還有待進(jìn)一步研究。

3 討論

海參性腺是一種珍貴的食材。研究發(fā)現(xiàn)，刺參性腺脂質(zhì)的脂肪酸組成中不飽和脂肪酸達(dá)到73．2%［12］，而其中的脂質(zhì)又多以磷脂的形式存在，因此，對(duì)刺參性腺中磷脂的研究具有重要的意義。磷脂本身作為功能性脂質(zhì)，在生命代謝活動(dòng)中有極其重要的作用，可以調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，降低血脂中甘油三酯和膽固醇水平。多烯磷脂酰膽堿為磷脂的一種，已在臨床上作為肝病輔助治療藥得到廣泛利用［13］，磷脂生物活性包括減肥、抗癌、降血糖等［14-16］，也必將越來(lái)越受到人們的重視。

對(duì)于刺參性腺所含磷脂的分析方法，從分離體系來(lái)看，正相整體硅膠柱由整片硅膠制成，不同于傳統(tǒng)硅膠柱由硅膠顆粒填充，因此，整體柱在一定程度上可以避免柱床塌陷的問(wèn)題。而且整體柱具有更高的孔隙度 (20 nm的大孔徑和13 nm的中孔徑)，允許流動(dòng)相在低壓下獲得很高的流速，最高可達(dá)9．0 mL/min，且不容易發(fā)生堵塞柱子的情況［5］。國(guó)外已有學(xué)者將整體柱用于磷脂的分析［5，7，17］，國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究中，利用正相整體硅膠柱為固定相，正己烷-異丙醇-乙酸水體系為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，與國(guó)內(nèi)外常用的磷脂分析方法相比，該方法可以在15 min內(nèi)對(duì)6種磷脂組分同時(shí)進(jìn)行分析，且分離效果良好，也可以應(yīng)用于其他來(lái)源的磷脂成分檢測(cè)。

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