兩種有害藻對輪蟲繁殖和中華絨螯蟹溞狀幼體變態(tài)率的影響

楊霞，孫娜，李永函，李曉東

(1．大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，遼寧大連116023;2．盤錦光合蟹業(yè)有限公司，遼寧盤錦124200)

赤潮通常是指某些浮游植物、原生動(dòng)物和其他微生物在水體中過度繁殖或聚集而使海水變色并造成危害的一種生態(tài)異?，F(xiàn)象，尤其是有毒赤潮發(fā)生時(shí)，常伴有魚、貝等大量死亡，赤潮已成為海灣或近海人工養(yǎng)殖的巨大威脅［1］。近年來，赤潮發(fā)生的頻次和累計(jì)面積呈增長趨勢，21世紀(jì)前10年的赤潮發(fā)生頻次和規(guī)模是20世紀(jì)后50年的2倍多，其危害程度也日益增加。赤潮藻類主要有夜光藻Noctiluca scintillans、亞歷山大藻Alexandrium、海洋卡盾藻 Chattonella marina、海洋原甲藻 Prorocentrum micans等，裸甲藻Gymnodinium sp．也是赤潮藻類的主要成分［2］。

海水池塘養(yǎng)殖業(yè)的興起，使原本發(fā)生在海洋中的赤潮有了在池塘中出現(xiàn)的可能，并危害到了養(yǎng)殖動(dòng)物［3-4］，特別是隨著養(yǎng)殖動(dòng)物生態(tài)育苗模式在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中的推廣應(yīng)用［5-7］，這種現(xiàn)象發(fā)生得更為頻繁，如中華絨螯蟹Eriocheir sinensis土池育苗時(shí)，伴隨著單產(chǎn)的提高和池塘富營養(yǎng)化的加劇，赤潮發(fā)生的幾率顯著提高，蟹苗成活率受到了嚴(yán)重影響。近年來，筆者對蟹苗池、補(bǔ)水池、小球藻池、輪蟲池等不同類型水體的觀察發(fā)現(xiàn)，輪蟲池塘中的裸甲藻赤潮發(fā)生率極低，這可能與輪蟲攝食裸甲藻有關(guān)。本研究中，以兩種有害藻與中華絨螯蟹溞狀幼體、褶皺臂尾輪蟲為試驗(yàn)對象，研究了四者的相互關(guān)系，以期探索池塘赤潮的有效防控措施。

1 材料與方法

1.1 材料

裸甲藻 (圖1)由大連市國家海洋環(huán)境監(jiān)測中心提供且尚未定種，使用f/2培養(yǎng)液培養(yǎng)。異冒藻Heterocapsa sp．(圖2)采自盤錦光合蟹業(yè)有限公司三角洲分公司的海水沉淀池，在實(shí)驗(yàn)室里提純并培養(yǎng)，培養(yǎng)液采用f/2營養(yǎng)鹽配方，此藻種由國家海洋局第三海洋研究所的顧海峰教授幫助鑒定。褶皺臂尾輪蟲Brachionus plicatilis用三角洲分公司輪蟲培養(yǎng)池的休眠卵在鹽度為26的海水中孵化獲得。中華絨螯蟹Eriocheir sinensis H．Mlne-Edwards溞狀幼體采自三角洲分公司河蟹育苗池。

1.2 方法

1．2．1 裸甲藻對中華絨螯蟹溞狀幼體變態(tài)的影響試驗(yàn) 設(shè)置 2．000×105、1．000×105、0．500×105、0．250×105、0．125×105cells/mL 5 個(gè)裸甲藻密度組，同時(shí)以海水作為對照組，每個(gè)密度組設(shè)3個(gè)平行，試驗(yàn)在盛有300 mL溶液的燒杯中進(jìn)行，每個(gè)燒杯中放入20只蟹苗，試驗(yàn)按溞狀幼體Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ期分5次完成，記錄并計(jì)算每期溞狀幼體的變態(tài)率。

圖1 裸甲藻普通光學(xué)顯微照片F(xiàn)ig.1 Ordinary light microscopic graphy of alga Gymnodinium sp．

圖2 異冒藻電鏡照片F(xiàn)ig.2 Electronic microscopic graphy of alga Gymnodinium sp．

1．2．2 異冒藻對中華絨螯蟹溞狀幼體變態(tài)的影響試驗(yàn) 試驗(yàn)分組及試驗(yàn)方法同“1．2．1”節(jié)，試驗(yàn)按溞狀幼體Ⅰ、Ⅱ期分2次完成，記錄并計(jì)算每期溞狀幼體的變態(tài)率。

1．2．3 不同初始密度的裸甲藻對輪蟲生存和繁殖的影響試驗(yàn) 設(shè)置 1．728×105cells/mL(133．06 mg/L)、0．575 × 105cells/mL(44．28mg/L)、0．288×105cells/mL(22．18 mg/L)3 個(gè)裸甲藻初始密度組，試驗(yàn)在略大于5 mL的醫(yī)用玻璃瓶中進(jìn)行，每個(gè)密度組中做兩種處理 (第一種加輪蟲5個(gè)，另一種不加輪蟲，作為裸甲藻生物量變化觀察的對照)，各加入 5 mL藻液，以密度為 34．56×105cells/mL的蛋白核小球藻Chlorella pyrenoides和空白海水作為對照組。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)平行，放入光照為2000 lx的培養(yǎng)箱中，鹽度為26，溫度為 (20±0．5)℃，試驗(yàn)共進(jìn)行96 h，試驗(yàn)開始后分別在12、24、48、72、96 h取樣觀察，每次從每個(gè)處理組隨機(jī)取3個(gè)小瓶，加碘液固定，在顯微鏡下觀察并記錄輪蟲的存活數(shù)、掛卵量和裸甲藻數(shù)量。

裸甲藻的生物量是在顯微鏡下測量并計(jì)算一定數(shù)量的裸甲藻體積而換算得出的。

1．2．4 不同初始密度的異冒藻對輪蟲生存和繁殖的影響試驗(yàn) 設(shè)置 1．728×105cells/mL(103．68 mg/L)、0．575 × 105cells/mL(34．50mg/L)、0．288×105cells/mL(17．28 mg/L)3 個(gè)異冒藻初始密度組，其密度 (數(shù)量)與裸甲藻一致 (通過濃縮和稀釋方法配制)，其他試驗(yàn)條件與方法同“1．2．3”節(jié)。

1．2．5 輪蟲攝食裸甲藻的試驗(yàn) 輪蟲投放密度設(shè)置為 0(對照)、7．5、15、30 ind．/mL，試驗(yàn)容器為500 mL的燒杯，每個(gè)燒杯中放入500 mL密度為0．288×105cells/mL的裸甲藻液，然后放入4種不同密度的輪蟲，每個(gè)輪蟲密度組設(shè)3個(gè)平行，試驗(yàn)共進(jìn)行96 h，試驗(yàn)開始后分別在24、48、72、96 h取樣，在顯微鏡下觀察并記錄輪蟲的存活數(shù)和裸甲藻的數(shù)量。

1．2．6 輪蟲攝食異冒藻的試驗(yàn) 輪蟲投放密度設(shè)置為0(對照)、15、30、60 ind．/mL，試驗(yàn)容器為500 mL的燒杯，每個(gè)燒杯放入500 mL密度為0．72×104cells/mL的異冒藻液，其他試驗(yàn)條件與方法同 “1．2．5”節(jié)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。用 SPSS 17．0軟件進(jìn)行單因素方差分析，用Duncan法進(jìn)行多重比較，顯著性水平設(shè)為0．05。

2 結(jié)果與分析

2.1 裸甲藻對中華絨螯蟹溞狀幼體變態(tài)的影響

從表1可見:在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，裸甲藻對Ⅰ、Ⅱ期溞狀幼體有毒性作用，而對Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ期溞狀幼體毒性不顯著;隨著藻密度的升高，Ⅰ、Ⅱ期溞狀幼體的變態(tài)率降低;當(dāng)裸甲藻密度為2．000×105cells/mL時(shí)，Ⅰ、Ⅱ期溞狀幼體的變態(tài)率均只有13．33%±7．64%，顯著低于對照組及其他藻密度組 (P＜0．05)。

2.2 異冒藻對中華絨螯蟹溞狀幼體變態(tài)的影響

從表2可見:異冒藻對Ⅰ、Ⅱ期溞狀幼體的變態(tài)率有顯著影響，隨著異冒藻密度的增加，溞狀幼體的變態(tài)率降低;當(dāng)異冒藻密度為 2．000×105cells/mL時(shí)，Ⅰ、Ⅱ期溞狀幼體的變態(tài)率分別為11．67%±7．64%、26．67%±17．56%，均顯著低于對照組及其他藻密度組 (P＜0．05);當(dāng)異冒藻密度為0．500×105cells/mL及以下時(shí)，Ⅰ期溞狀幼體的變態(tài)率與對照組無顯著性差異 (P＞0．05);當(dāng)異冒藻密度為1．000×105cells/mL及以下時(shí)，Ⅱ期溞狀幼體的變態(tài)率與對照組無顯著性差異 (P＞0．05)。

表1 中華絨螯蟹各發(fā)育期溞狀幼體在不同密度裸甲藻下的變態(tài)率Tab.1 Metamorphosis rate of various developmental zoea of Chinese mitten handed crab Eriocheir sinensis under different concentrations of alga Gymnodinium sp.

表2 中華絨螯蟹Ⅰ、Ⅱ期溞狀幼體在不同密度異冒藻下的變態(tài)率Tab.2 Metamorphosis rate in zoeaⅠand zoeaⅡof Chinese mitten handed crab Eriocheir sinensis under the different concentrations of alga Heterocapsa sp.

2.3 不同密度裸甲藻對輪蟲數(shù)量的影響

從表3可見:96 h時(shí)，隨著裸甲藻初始密度的增加，輪蟲數(shù)量減少;低密度組輪蟲數(shù)量最多，為(41．67±5．31)ind．，與空白組有顯著性差異 (P＜0．05);中密度組輪蟲數(shù)量次之，為 (40．67±17．67)ind．，與空白組有顯著性差異 (P＜0．05);高密度組輪蟲數(shù)量最少，為 (4．67±2．89)ind．，與空白組無顯著性差異 (P＞0．05);以上各組輪蟲數(shù)量均顯著低于小球藻組 (P＜0．05)。

2.4 不同密度異冒藻對輪蟲數(shù)量的影響

從表4可見:96 h時(shí)，隨著異冒藻密度的增加，輪蟲數(shù)量減少;低密度組輪蟲數(shù)量最多，為(26．33± 12．01)ind．，與空白組有顯著性差異(P＜0．05);中密度組輪蟲數(shù)量次之，為 (5．00±6．08)ind．，與空白組無顯著性差異 (P＞0．05);高密度組輪蟲全部死亡;以上各組輪蟲數(shù)量均顯著低于小球藻組 (P＜0．05)。

2.5 不同密度裸甲藻對輪蟲產(chǎn)卵量的影響

從表5可見:在中、高密度裸甲藻組中，輪蟲的初次產(chǎn)卵時(shí)間、初次產(chǎn)卵量無顯著性差異 (P＞0．05)，但小球藻組的初次產(chǎn)卵量明顯高于其他各組 (P＜0．05);96 h時(shí)，隨著裸甲藻初始密度的減小，輪蟲產(chǎn)卵量增加，低密度組輪蟲產(chǎn)卵量最多，為 (47．00±14．73)ind．，中密度組輪蟲產(chǎn)卵量次之，為 (32．00±17．00)ind．，高密度組輪蟲產(chǎn)卵量最少，為 (4．67±1．53)ind．，空白組產(chǎn)卵量為0，且中、低密度組的產(chǎn)卵量顯著高于高密度組(P＜0．05);24、72、96 h時(shí)，以上各組輪蟲產(chǎn)卵量均顯著低于小球藻組 (P＜0．05)。

2.6 不同密度異冒藻對輪蟲產(chǎn)卵量的影響

從表6可見:24 h時(shí)，在不同密度異冒藻組中，輪蟲的初次產(chǎn)卵時(shí)間和初次產(chǎn)卵量無顯著差異(P＞0．05)，但小球藻組的初次產(chǎn)卵量明顯高于其他各組 (P＜0．05);隨著異冒藻的初始密度的減小，輪蟲產(chǎn)卵量增加，96 h時(shí)，低密度組輪蟲的產(chǎn)卵量最多，為 (7．67±4．93)ind．，中密度組輪蟲產(chǎn)卵量次之，為 (2．67±2．08)ind．，高密度組輪蟲產(chǎn)卵量為0;在各個(gè)時(shí)間段，以上各組輪蟲產(chǎn)卵量均顯著低于小球藻組 (P＜0．05)。

表3 輪蟲在不同密度裸甲藻下的數(shù)量變化Tab.3 Quantity of rotifer Brachionus plicatilis under different densities of alga Gymnodinium sp. ind．

表4 輪蟲在不同密度異冒藻下的數(shù)量變化Tab.4 Quantity of rotifer Brachionus plicatilis under different densities of alga Heterocapsa sp. ind．

表5 輪蟲暴露在不同密度裸甲藻下的產(chǎn)卵量Tab.5 Egg number of rotifer Brachionus plicatilis at different densities of alga Gymnodinium sp. ind．

表6 輪蟲暴露在不同密度異冒藻下的產(chǎn)卵量Tab.6 Egg number of rotifer Brachionus plicatilis at different densities of alga Heterocapsa sp. ind．

2.7 不同輪蟲培養(yǎng)密度下裸甲藻生物量的變化

從圖3可見，各輪蟲密度組與對照組相比，裸甲藻生物量均呈下降趨勢，24 h時(shí)下降最為明顯，輪蟲投放最小密度 (7．5 ind．/mL)時(shí)，裸甲藻生物量為 2．87 mg/L，與對照組 (生物量為 16．64 mg/L)相比有顯著性差異 (P＜0．05)。

圖3 不同輪蟲培養(yǎng)密度下裸甲藻生物量的變化Fig.3 Changes in biomass of alga Gymnodinium sp.under different rotifer culture densities

2.8 不同輪蟲培養(yǎng)密度下異冒藻生物量的變化

從圖4可見:輪蟲投放密度為60 ind．/mL時(shí)，異冒藻生物量呈下降趨勢，24 h時(shí)，異冒藻生物量下降最快，由4．32 mg/L減少到1．93 mg/L，與對照組 (4．51 mg/L)相比有顯著性差異 (P＜0．05)，24 h后其生物量緩慢下降;而其他輪蟲密度組異冒藻的生物量整體呈上升趨勢。

圖4 不同輪蟲培養(yǎng)密度下異冒藻生物量的變化Fig.4 Changes in biomass of alga Heterocapsa sp.under different rotifer culture densities

3 討論

3.1 有害藻對中華絨螯蟹溞狀幼體存活及變態(tài)的影響

在養(yǎng)殖生產(chǎn)中，養(yǎng)殖池塘很容易引起有害藻爆發(fā)，從而危害養(yǎng)殖動(dòng)物。2008年8月3日，三角洲分公司C16蝦池 (4669 m2)水色土黃，異冒藻生物量達(dá)到140 mg/L，導(dǎo)致池中日本對蝦大量死亡;2012年，三角洲分公司C區(qū)15#蟹苗池發(fā)生異冒藻赤潮，異冒藻生物量達(dá)到70 mg/L，最后該池產(chǎn)量只有平均產(chǎn)量的1/4。本試驗(yàn)結(jié)果也表明，兩種有害藻均對中華絨螯蟹溞狀幼體的存活和變態(tài)有影響，且隨著藻密度的增大，對溞狀幼體的毒性也明顯增強(qiáng)。有害藻毒素的來源可能是溞狀幼體攝食了本身具有毒性的藻，也可能是藻分泌到水體中的胞外物質(zhì)。裸甲藻的產(chǎn)毒機(jī)制非常復(fù)雜，其毒素可能來源于細(xì)胞內(nèi)部或細(xì)胞表面，也可能是次生代謝物質(zhì)［8］。宋嫻麗等［9］研究赤潮異灣藻對牙鲆早期發(fā)育的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，赤潮異彎藻表面存在一層多糖類分子，這種多糖蛋白在魚腮表面的累積導(dǎo)致魚類死亡。有害赤潮藻毒素也可能是一種細(xì)胞分泌的胞外物質(zhì)，它在細(xì)胞內(nèi)合成并分泌于細(xì)胞表面或釋放到水體中［10］。本試驗(yàn)結(jié)果表明，兩種有害藻對中華絨螯蟹溞狀幼體各個(gè)發(fā)育時(shí)期的變態(tài)率影響不同，在一定范圍內(nèi)，對Ⅰ、Ⅱ期溞狀幼體有明顯的毒害作用，而對Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ期溞狀幼體的毒害作用較小，這可能是由于Ⅰ、Ⅱ期溞狀幼體個(gè)體小，抵抗力比較弱，而Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ期溞狀幼體個(gè)體變大，抵抗力也增強(qiáng)的原因，Zhao等［11］在研究不同發(fā)育階段中華絨螯蟹對氨氮的耐受性時(shí)發(fā)現(xiàn)，隨著溞狀幼體的變態(tài)發(fā)育，幼體對氨氮的耐受性提高，這與本研究結(jié)果同理。

3.2 有害藻對輪蟲生存和繁殖的影響

本試驗(yàn)結(jié)果表明，兩種藻對輪蟲的繁殖雖然都有影響，但是在藻濃度較低的情況下輪蟲仍然可以掛卵并繁殖，攝食效果試驗(yàn)也證明，在有害藻密度較低時(shí)，可以通過足量密度的輪蟲攝食來控制其生長。據(jù)報(bào)道，輪蟲所攝食餌料的最大直徑為22～30 μm，以15 μm 以下最為理想［12］。本試驗(yàn)中的兩種藻粒徑均小于15 μm，在輪蟲的可攝食范圍內(nèi)。當(dāng)水體中有害藻的密度較小，其產(chǎn)生的毒素尚未危及輪蟲生存時(shí)［10］，輪蟲可以通過攝食的方式抑制有害藻繁殖。謝志浩等［12］在研究塔瑪亞歷山大藻對褶皺臂尾輪蟲生活史特征的影響中發(fā)現(xiàn)，在不同亞歷山大藻密度下，褶皺臂尾輪蟲維持了一定的種群增長。王麗平等［13］研究表明，東海原甲藻在密度為1×104～3×104cells/mL時(shí)，輪蟲能夠以其為食并進(jìn)行生長繁殖。另外，也有利用其他餌料生物來攝食有害藻類的研究，如在低藻密度條件下，鹵蟲幼體能以雙胞旋溝藻為食并維持其生命［14］，孫雷等［15］也發(fā)現(xiàn)了橈足類刺尾紡錘水蚤攝食赤潮生物海洋原甲藻。在生產(chǎn)中筆者也曾經(jīng)嘗試用輪蟲來防治有害藻，如2012年5月，三角洲分公司的3個(gè)苗池出現(xiàn)異冒藻，由于及時(shí)投放輪蟲 (投放密度為1．3×104ind．/L)，異冒藻得到了有效控制。在中華絨螯蟹生態(tài)育苗前期，輪蟲又是蟹苗的主要餌料，利用這一食物鏈關(guān)系將這種生物防控方法應(yīng)用到生態(tài)蟹苗的實(shí)際生產(chǎn)中會取得很好的效果。

在本試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)兩種害藻密度 (數(shù)量)相同時(shí)，裸甲藻組的輪蟲數(shù)量和產(chǎn)卵量均高于異冒藻組，而且裸甲藻個(gè)體較大，其生物量大于異冒藻，這充分說明了后者對輪蟲的數(shù)量和產(chǎn)卵量影響較大，即生物量較小的異冒藻其毒性反而較大。這可能是不同種間的差異造成的。

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