對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗菌藥不敏感腸桿菌科細(xì)菌耐藥性分析

李春娟董愛(ài)英韓曉燕

（1河北聯(lián)合大學(xué)，河北 唐山 063000；2河北聯(lián)合大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科）

對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗菌藥不敏感腸桿菌科細(xì)菌耐藥性分析

李春娟1董愛(ài)英2韓曉燕2

（1河北聯(lián)合大學(xué)，河北 唐山 063000；2河北聯(lián)合大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科）

目的：了解我院臨床分離的對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗菌藥不敏感的腸桿菌科細(xì)菌對(duì)常用抗菌藥物的耐藥性。方法：收集2013年4月-2014年3月我院臨床分離的30株對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗菌藥不敏感的腸桿菌科細(xì)菌，使用由美國(guó)BD公司生產(chǎn)的Phoenix-100全自動(dòng)細(xì)菌鑒定/藥敏系統(tǒng)進(jìn)行菌株鑒定和藥敏試驗(yàn)，產(chǎn)碳青霉烯酶的表型確證采用改良Hodge試驗(yàn)。結(jié)果：30株對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗菌藥不敏感的腸桿菌科細(xì)菌對(duì)多黏菌素、阿米卡星和復(fù)方新諾明的敏感率較高，依次為100.0%，73.3%和66.7%；對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗菌藥亞胺培南和美羅培南的耐藥率分別為100.0%和86.7%；對(duì)氨芐西林、頭孢菌素類(lèi)、含β-內(nèi)酰胺酶抑制劑的復(fù)合制劑和單環(huán)β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗菌藥的耐藥率均為100.0%；對(duì)其余抗菌藥的耐藥率均在60.0%以上。30株菌的改良Hodge試驗(yàn)陽(yáng)性率為86.7%（26/30）。結(jié)論：對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗菌藥不敏感的腸桿菌科細(xì)菌對(duì)常用抗菌藥物表現(xiàn)為高度多重耐藥，為高產(chǎn)碳青霉烯酶菌株。為防止產(chǎn)碳青霉烯酶基因的流行，臨床應(yīng)合理使用抗菌藥物并加強(qiáng)對(duì)腸桿菌科細(xì)菌產(chǎn)碳青霉烯酶的監(jiān)測(cè)。

腸桿菌科細(xì)菌；碳青霉烯酶；耐藥性分析

碳青霉烯類(lèi)抗菌藥是抗菌譜廣，抗菌活性強(qiáng)的β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗菌藥，因其對(duì)絕大多數(shù)由質(zhì)?；蛉旧w介導(dǎo)的β-內(nèi)酰胺酶都有較高的穩(wěn)定性[1]以及毒性低等特點(diǎn)，已經(jīng)成為治療嚴(yán)重細(xì)菌感染最主要的抗菌藥物之一，被稱為治療革蘭陰性菌感染的最后一道防線[2]，是目前治療產(chǎn)超廣譜 β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）和頭孢菌素酶（AmpC）的多重耐藥腸桿菌科細(xì)菌引起感染最有效的抗菌藥物[3]。近年來(lái)，碳青酶烯類(lèi)抗菌藥耐藥腸桿菌科細(xì)菌所致感染爆發(fā)的報(bào)道呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，其耐藥機(jī)制主要是產(chǎn)生碳青霉烯酶，給臨床抗感染治療帶來(lái)了嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。為了解對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗菌藥不敏感的腸桿菌科細(xì)菌的臨床分布及耐藥情況，現(xiàn)將30株對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗菌藥不敏感的腸桿菌科細(xì)菌對(duì)常用抗菌藥物的耐藥性報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 菌株來(lái)源

收集我院2013年4月 -2014年3月臨床標(biāo)本中分離的腸桿菌科細(xì)菌，篩選出對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗菌藥不敏感的腸桿菌科細(xì)菌30株。

1.2 儀器與試劑

美國(guó)BD公司生產(chǎn)的Phoenix-100全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀及BD公司的配套試劑，溫州市康泰生物科技有限公司生產(chǎn)的培養(yǎng)基，英國(guó)Oxoid公司的藥敏紙片。

1.3 質(zhì)控菌株

銅綠假單胞菌ATCC27853，大腸埃希菌ATCC 25922，金黃色葡萄球菌ATCC25923，肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705，肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1706。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 藥敏試驗(yàn)使用由美國(guó)BD公司生產(chǎn)的Phoenix-100全自動(dòng)細(xì)菌鑒定/藥敏系統(tǒng)，按儀器操作說(shuō)明進(jìn)行菌株鑒定和藥敏試驗(yàn)，結(jié)果判讀依照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所（CLSI）2012年標(biāo)準(zhǔn)[4]進(jìn)行。

1.4.2 改良Hodge試驗(yàn)①使用無(wú)菌生理鹽水將大腸埃希菌ATCC25922菌懸液調(diào)至0.5麥?zhǔn)蠞岫龋⒂蒙睇}水進(jìn)行1∶10稀釋。②用棉簽將稀釋后菌液均勻涂布于MH瓊脂平板上，干燥3～10 m in，中間貼美羅培南紙片。③使用10μL接種環(huán)挑取3～ 5個(gè)過(guò)夜生長(zhǎng)待測(cè)菌落或質(zhì)控菌株，垂直于美羅培南紙片從紙片邊緣開(kāi)始劃線，長(zhǎng)度為20～25 mm，（35±2）℃孵育16～20 h。④結(jié)果判讀：如果在被測(cè)菌株與大腸埃希菌ATCC25922抑菌圈交匯處大腸埃希菌生長(zhǎng)增強(qiáng)，即為改良Hodge試驗(yàn)陽(yáng)性，產(chǎn)碳青霉烯酶。肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705為陽(yáng)性質(zhì)控菌、肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1706為陰性質(zhì)控菌。

1.4.3 數(shù)據(jù)分析采用世界衛(wèi)生組織細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)網(wǎng)Whonet 5.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果

2.1 菌株分布及標(biāo)本資料

我院2013年4月 -2014年3月臨床標(biāo)本中分離出對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗菌藥不敏感的腸桿菌科細(xì)菌共30株，其中肺炎克雷伯菌16株，占53.3%，陰溝腸桿菌12株，占40.0%。這些細(xì)菌來(lái)自不同的科室，主要分布在重癥醫(yī)學(xué)科 15株（50.0%），神經(jīng)內(nèi)科重癥病房8株（26.7%）?；颊咂骄挲g約為74歲，多有較嚴(yán)重的呼吸道疾病，心腦血管疾病，嚴(yán)重外傷，重癥感染等基礎(chǔ)疾病，平均住院時(shí)間7.7個(gè)月，見(jiàn)表1。

2.2 藥敏試驗(yàn)

30株對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗菌藥不敏感的腸桿菌科細(xì)菌對(duì)多黏菌素、阿米卡星和復(fù)方新諾明的敏感率較高，依次為100.0%，73.3%和66.7%；對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗菌藥亞胺培南和美羅培南的耐藥率分別為100.0%和86.7%；對(duì)氨芐西林、頭孢菌素類(lèi)、含β-內(nèi)酰胺酶抑制劑的復(fù)合制劑和單環(huán)β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗菌藥的耐藥率均為100.0%；對(duì)其余抗菌藥的耐藥率均在60.0%以上，見(jiàn)表2。

表1 30株細(xì)菌標(biāo)本資料

2.3 碳青霉烯酶表型確證試驗(yàn)

30株腸桿菌科細(xì)菌，26株改良Hodge試驗(yàn)陽(yáng)性 ，陽(yáng)性率為86.7%。

3 討論

碳青霉烯類(lèi)抗菌藥抗菌譜廣，抗菌活性強(qiáng)，殺菌作用快，因此是目前治療ESBLs或AmpC的多重耐藥腸桿菌科細(xì)菌引起感染最有效的抗菌藥物。1998-2004年美國(guó)的SENTRY監(jiān)測(cè)中，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗菌藥耐藥的腸桿菌科細(xì)菌。然而近幾年，隨著碳青霉烯類(lèi)抗菌藥在臨床上的大量應(yīng)用，對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗菌藥不敏感的腸桿菌科細(xì)菌在不斷出現(xiàn)。中國(guó)CHINET細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)報(bào)道，2005-2010年臨床分離對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗菌藥耐藥腸桿菌科細(xì)菌從0.4%上升到8.5%[5]。

表2 30株細(xì)菌對(duì)抗菌藥物的耐藥率及敏感率

腸桿菌科細(xì)菌包括大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、陰溝腸桿菌等常見(jiàn)的重要條件致病菌，可引起腹腔、泌尿道、血液、呼吸道等多個(gè)部位的感染。本研究中我院2013年4月 -2014年3月臨床標(biāo)本中分離出對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗菌藥不敏感的腸桿菌科細(xì)菌共30株，其中以肺炎克雷伯菌最多（16株，53.3%），其次為陰溝腸桿菌（12株，40.0%）。這些細(xì)菌來(lái)自不同的科室，主要分布在重癥醫(yī)學(xué)科（15株，50.0%）、神經(jīng)內(nèi)科重癥病房（8株，26.7%）。這兩個(gè)科室多為老年及危重癥患者，基礎(chǔ)疾病嚴(yán)重，長(zhǎng)期使用大劑量廣譜抗菌藥，機(jī)體免疫力低下，有些患者須進(jìn)行氣管切開(kāi)及機(jī)械通氣、留置導(dǎo)尿管、胃管、靜脈留置導(dǎo)管等侵入性治療，這些都易導(dǎo)致耐碳青霉烯類(lèi)抗菌藥菌株的產(chǎn)生。由表1還可以看出，30株細(xì)菌所分離自的患者平均年齡約為74歲，多有較嚴(yán)重的呼吸道疾病如重癥肺炎、慢性阻塞性肺疾病，心腦血管疾病如腦梗死、腦出血，嚴(yán)重外傷，重癥感染等基礎(chǔ)疾病，平均住院時(shí)間7.7個(gè)月。這是因?yàn)槔夏耆松眢w虛弱，抵抗力低下，加之患有較嚴(yán)重的基礎(chǔ)疾病，病程普遍較長(zhǎng)需要長(zhǎng)期住院治療，這些都是耐藥菌產(chǎn)生的誘發(fā)因素。

碳青霉烯酶能水解青霉素類(lèi)、頭孢菌素類(lèi)、單環(huán)β-內(nèi)酰胺類(lèi)和碳青酶烯類(lèi)等抗菌藥[6]，故可表現(xiàn)為對(duì)抗菌藥物的高度耐藥，給臨床治療帶來(lái)很大困難，應(yīng)引起臨床高度重視[7]。本研究中對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗菌藥不敏感的腸桿菌科細(xì)菌對(duì)常見(jiàn)抗菌藥物也表現(xiàn)為高度多重耐藥，對(duì)氨芐西林、頭孢菌素類(lèi)、含β-內(nèi)酰胺酶抑制劑的復(fù)合制劑和單環(huán)β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗菌藥的耐藥率均為 100%；對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗菌藥亞胺培南和美羅培南的耐藥率也分別達(dá)到了100%和86.7%；對(duì)其余抗菌藥的耐藥率均在60%以上，而對(duì)多黏菌素的敏感率最高（100%）、其次為阿米卡星（73.3%）和復(fù)方新諾明（66.7%）。多黏菌素屬多肽類(lèi)抗菌藥，系窄譜慢效殺菌藥，對(duì)繁殖期和靜止期細(xì)菌均有殺菌作用，主要作用于細(xì)菌胞漿膜，同時(shí)也可進(jìn)入細(xì)菌體內(nèi)影響核質(zhì)和核糖體的功能，對(duì)革蘭陰性桿菌具有強(qiáng)大抗菌活性，不易耐藥。但由于對(duì)其藥物代謝、藥物效應(yīng)動(dòng)力學(xué)和不良反應(yīng)缺少了解，多黏菌素的臨床應(yīng)用較少，因此敏感率最高。阿米卡星和慶大霉素同為氨基苷類(lèi)抗菌藥，但本研究中對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗菌藥不敏感的腸桿菌科細(xì)菌對(duì)二者的敏感率卻相差很大，前者為73.3%，后者為20.0%，主要原因是細(xì)菌所產(chǎn)生的氨基苷類(lèi)鈍化酶以AAC（3）-Ⅱ?yàn)橹鳎瑢?duì)前者的水解能力較弱。該類(lèi)藥物對(duì)輕度感染者可單用，但中、重度感染者則需與其他藥物聯(lián)合應(yīng)用，且用藥期間應(yīng)注意耳毒性和腎毒性。

改良Hodge試驗(yàn)是CLSI推薦用于檢測(cè)碳青霉烯酶表型的有效方法，此方法的敏感性和特異性均＞ 90%[8]。30株腸桿菌科細(xì)菌，26株改良Hodge試驗(yàn)陽(yáng)性，陽(yáng)性率為86.7%。說(shuō)明對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗菌藥不敏感的腸桿菌科細(xì)菌為高產(chǎn)碳青霉烯酶菌株。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）常作為檢測(cè)碳青霉烯酶基因的金標(biāo)準(zhǔn)[9]，因此對(duì)耐藥菌株產(chǎn)碳青霉烯酶的基因確證與基因分型有待進(jìn)一步研究。

腸桿菌科細(xì)菌產(chǎn)碳青霉烯酶情況日益增多，這些菌株又常常合并 ESBLs和AmpC，菌株表現(xiàn)為高度多重耐藥，可供選擇的抗菌藥物非常有限，臨床對(duì)于產(chǎn)酶菌株引起感染的治療數(shù)據(jù)非常少。因此臨床應(yīng)加強(qiáng)細(xì)菌對(duì)抗菌藥物耐藥性的監(jiān)測(cè)，并根據(jù)病原菌的種類(lèi)以及藥敏試驗(yàn)結(jié)果制定有效且合理的治療方案，以減少產(chǎn)碳青霉烯酶菌株的產(chǎn)生和流行[10]。

[1] 魏麗華，余蘭.腸桿菌科細(xì)菌產(chǎn)碳青霉烯酶研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)信息，2011，24（3）：1464-1466.

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Drug Resistance Analysis of Carbapenem-nonsusceptible Enterobacteriaceae

Li Chunjuan1，Dong Aiying2，Han Xiaoyan2（1 Hebei United University，Hebei Tangshan 063000，China；2 Clinical Laboratory Department of the A ffiliated Hospital of Hebei United University）

Objective:To understand the drug resistance of carbapenem-nonsusceptible Enterobacteriaceae to commonly used antim icrobial drugs.Methods:About 30 strains of carbapenem-nonsusceptible Enterobacteriaceae were isolated from the patients in our hospital from April 2013 to March 2014.The strain identification and drug susceptibility tests were performed by the use of Phoenix-100 automatic bacterial identification/drug susceptibility system produced by America BD company.The phenotyes of carbapenemase producing strains were identified by modified Hodge test.Results:The higher sensitive rates (100.0%，73.3%and 66.7%)of 30 strains of carbapenem-nonsusceptible Enterobacteriacea to polymyxin，am ikacin and cotrimoxazole were showed.The resistance rates of carbapenem antibiotics to im ipenem and meropenem were 100.0%and 86.7%.A ll the isolates were resistant to the commonly used ampicillin， cephalosporins， the compound preparation containing β-lactamase inhibitor and monobactams antibiotics，and the resistance rates to other antibiotics weremore than 60.0%.About 26 strains(86.7%)showed positive in the modified Hodge test.Conclusion:Carbapenem-nonsusceptible Enterobacteriaceae are high-yielding strains of carbapenemase w ith a high degree of multidrug resistance.To prevent such strains producing popular carbapenemase gene，antibiotics should be used reasonably in clinical practice and the monitoring the production of carbapenemases should be strengthened.

Enterobacteriaceae；Carbapenemase；Drug Resistance Analysis

10.3969/j.issn.1672-5433.2015.03.005

2014-12-19）

唐山市科技計(jì)劃項(xiàng)目（14130212a）

李春娟，女，在讀碩士。研究方向：病原微生物感染診斷。E-mail：lichunjuan1988@126.com

董愛(ài)英，女，教授。研究方向：臨床微生物檢驗(yàn)。通訊作者E-mail：heweijun@126.com