膳食補(bǔ)充亮氨酸可通過抑制泛素-蛋白酶體削弱增齡小鼠骨骼肌萎縮

夏 志,趙 艷,尚畫雨,葉菊菲,楊力源,孫君志,熊偉平,蘇全生

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膳食補(bǔ)充亮氨酸可通過抑制泛素-蛋白酶體削弱增齡小鼠骨骼肌萎縮

夏 志1,趙 艷2,尚畫雨3,葉菊菲4,楊力源5,孫君志4,熊偉平6,蘇全生4

目的：探討膳食補(bǔ)充亮氨酸對增齡所致骨骼肌萎縮的影響及可能機(jī)制。方法：13月齡雄性ICR小鼠根據(jù)體重隨機(jī)分為補(bǔ)充亮氨酸(Leu)、補(bǔ)充丙氨酸(Ala)以及空白對照組(NC)，Leu和Ala組分別在飼料中添加5%比例亮氨酸和3.4%比例丙氨酸8周，NC組飼喂普通飼料。末次給食后禁食17 h處死小鼠，便攜式血糖儀檢測血糖；ELISA法檢測血清胰島素、IGF-1；分光光度法檢測血尿素氮；氨基酸分析儀檢測血漿游離氨基酸譜；HE染色觀察肌纖維適應(yīng)性及病理性改變；BCA法定量蛋白后，Western Blotting法檢測Ub、Atrogin-1、MuRF-1及MHCⅡ的蛋白表達(dá)。結(jié)果：與NC組和Ala組小鼠相比，添加5%亮氨酸(Leu組)未顯著影響小鼠體重、采食量，血糖、胰島素水平與IGF-1無顯著變化，血尿素氮水平顯著下降；血漿游離亮氨酸含量升高而丙氨酸、甘氨酸和谷氨酸含量下降；腓腸白肌濕重/體重比值、肌纖維橫截面積及直徑均表現(xiàn)出增長的趨勢，但增幅并不顯著；骨骼肌纖維圓形化、核中心化病變顯著減少；腓腸白肌總蛋白含量、MHCⅡ蛋白表達(dá)顯著增加，而Ub、Atrogin-1及MuRF-1的蛋白表達(dá)均顯著下降。Ala組與NC組小鼠相比各指標(biāo)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論：亮氨酸能夠削弱老年前期小鼠骨骼肌萎縮，其機(jī)制可能與亮氨酸對泛素-蛋白酶體系統(tǒng)的抑制有關(guān)。

亮氨酸；骨骼?。环核?蛋白酶體；蛋白質(zhì)降解；萎縮

骨骼肌隨著年齡的增長而出現(xiàn)進(jìn)行性萎縮，并隨衰老進(jìn)程的發(fā)展而加劇。盡管這種變化主要因蛋白質(zhì)合成的減少所致，但蛋白質(zhì)降解在其發(fā)生發(fā)展過程中同樣具有重要作用[30]。

越來越多的研究顯示，氨基酸可調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成[9]與分解[4]，而亮氨酸(Leucine，Leu)則是其中最受關(guān)注的研究靶點。Rieu I[27]研究組采用不同劑量Leu進(jìn)行補(bǔ)充后發(fā)現(xiàn)，添加5% Leu可能有助于血漿Leu含量達(dá)到維持骨骼肌細(xì)胞內(nèi)外最佳比例的水平，促使蛋白質(zhì)更好地實現(xiàn)正性平衡。但就氨基酸調(diào)節(jié)骨骼肌蛋白質(zhì)降解的分子機(jī)制而言，目前卻知之甚少[29]。近年有零星研究提示，Leu在促進(jìn)蛋白質(zhì)合成的同時也可以削弱肌肉蛋白質(zhì)降解[22]。但其經(jīng)泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(ubiquitin-proteasome system,UPS)誘導(dǎo)骨骼肌蛋白質(zhì)水解抑制的分子機(jī)理目前仍未闡明[15]。本研究擬通過對自然增齡小鼠進(jìn)行肌肉組織病理學(xué)、UPS中泛素(Ubiquitin，Ub)、E3泛素連接酶：肌萎縮蛋白Fbox-1(Muscle atrophy F-box，也稱Atrogin-1)與肌肉環(huán)指蛋白-1(Muscle ring finger protein-1，MuRF-1)等蛋白質(zhì)降解關(guān)鍵蛋白以及反映骨骼肌快肌質(zhì)量的肌球蛋白重鏈Ⅱ(Myosin heavy chain Ⅱ，MHCⅡ)表達(dá)的檢測，探討膳食補(bǔ)充Leu對增齡所致骨骼肌萎縮的預(yù)防作用及其可能性機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物與分組

13月齡ICR小鼠36只，雄性，SPF級，體重48.6±0.5 g，購自成都達(dá)碩實驗動物有限公司，合格證號為SCXK(川)2008-24。單籠飼養(yǎng)，自由攝食、攝水。因更換墊料時多只小鼠發(fā)生嚴(yán)重咬傷，為避免組織修復(fù)對蛋白代謝的影響而將其全部剔除，最終納入23只小鼠進(jìn)入實驗統(tǒng)計。小鼠根據(jù)體重隨機(jī)納入空白對照(NC組，n=8)、添加丙氨酸(Ala組，n=8)和添加亮氨酸(Leu組，n=7)3個處理組，普通飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。適應(yīng)結(jié)束后NC處理組繼續(xù)進(jìn)食普通飼料，Ala和Leu處理組小鼠則進(jìn)食各自配方料，干預(yù)8周。每日稱重、記錄采食量(給食量-殘食量)。飼養(yǎng)環(huán)境控制為22℃±1.5℃室溫，光照12 h。

1.2 飼料配制

在普通國標(biāo)飼料基礎(chǔ)上，Leu處理組小鼠進(jìn)食飼料內(nèi)添加5%比例Leu，Ala處理組小鼠進(jìn)食飼料中則添加3.4%比例非必需氨基酸丙氨酸[14,19]，配為等氮對照飼料。采用替換等量玉米粉的方式進(jìn)行氨基酸添加，以使各處理組小鼠所攝入粗蛋白基本一致。Leu組飼料的消化能、粗蛋白、鈣、總磷與有效磷含量分別為14.21 MJ/kg、24.6%、1.19%、1.07%與0.87%。Leu組、Ala組及NC組飼料的氨基酸含量如表1所示[2]。

表1 本研究增齡小鼠飼料中氨基酸含量一覽表
Table 1 The Content of Amino Acids in Diet (%)

普通維持料Basaldiet丙氨酸配方料Alaninediet亮氨酸配方料Leucinediet必需氨基酸Essentialaminoacids亮氨酸Leucine1.451.426.51精氨酸Argnine1.131.041.06組氨酸Histidine0.690.710.62異亮氨酸Isoleucine0.640.620.62賴氨酸Lysine1.171.151.10蛋氨酸Methionine0.450.500.54苯丙氨酸Phenylalanine0.790.860.86蘇氨酸Threonine0.710.710.70纈氨酸Valine0.780.820.79非必需氨基酸Non-essentialaminoacids丙氨酸Alanine1.114.831.04天冬氨酸Asparticacid1.811.721.72半胱氨酸Cystine0.110.170.20谷氨酸Glutamicacid4.064.014.05甘氨酸Glycine0.970.930.92脯氨酸Proline1.391.381.30絲氨酸Serine0.970.940.94酪氨酸Tyrosine0.390.460.47氨基酸總量Totalaminoacids18.6222.2723.44

1.3 主要儀器與試劑

主要試劑：常規(guī)試劑購自國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心、國藥、成都科龍或金山試劑公司，均為分析純或優(yōu)級純。Leu(BBI，LB0922)；丙氨酸(BBI，AD0022)；小鼠胰島素ELISA試劑盒(Mercodia，10-1247-01)；IGF-1 ELISA試劑盒(Rapidbio，2R691)；BUN測試盒(南京建成，C013-1)；蛋白提取試劑(Thermo，T-MER，78510)；蛋白酶抑制劑混合片(Roche，11836153001)；BCA蛋白定量試劑盒(Thermo，23235)；Ub(Ab14372)、Atrogin-1(Ab168327)、MuRF-1(Ab172479)及MHC Ⅱ(Ab51263)蛋白表達(dá)一抗(Abcam)，HRP-標(biāo)記二抗(Jackson，115-035-003、111-035-003)；蛋白marker(Fermentas，SM6210)；ECL Plus(Millipore，WBKLS0010)。

主要儀器：日本Hitachi L8800型與德國Sykam S433D型氨基酸分析儀；美國Thermo MultiSkan3型酶標(biāo)儀；上海光儀722型分光光度計；美國強(qiáng)生穩(wěn)豪型ONETOUCH Ultra血糖儀及配套試劑條；美國Bio-Rad電泳儀；北京凱元Mini P-4電泳槽；德國Leica組織包埋機(jī)(EG1160)與切片機(jī)(RM2165)。

1.4 取材

小鼠在末次飼食后禁食17 h以使其處于吸收后狀態(tài)，同時避免末次進(jìn)食對蛋白質(zhì)代謝的急性影響。稱重后以0.3 ml/100g BW劑量腹腔注射10%水合氯醛進(jìn)行麻醉并摘眼球取血，分別制備血清和血漿用于血清胰島素、IGF-1、BUN及游離氨基酸分析；快速分離腓腸肌外側(cè)頭腓腸白肌[17]用于Western Blotting測試與形態(tài)學(xué)分析，液氮速凍處理并置于超低溫冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 實驗指標(biāo)的測定

1.5.1 一般指標(biāo)測試

血糖采用便攜式血糖儀進(jìn)行測試，用試劑條吸取血樣后讀數(shù)；血清胰島素與IGF-1采用ELISA法進(jìn)行測試，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，孵育溫度25℃，檢測波長450 nm；BUN含量按照測試盒說明書操作，分光光度計讀出OD值后，計算出尿素氮含量；檢測血漿游離氨基酸含量時，先沉淀蛋白并轉(zhuǎn)移上清，沉糖并沉淀膠質(zhì)后再次移取全量上清至干燥箱60℃真空揮干，最后定容并過濾膜進(jìn)樣分析。色譜條件為：1)色譜柱：4.6×60 mm，陽離子樹脂，Hitachi 2622SC；2)檢測波長：570 nm，440 nm；3)洗脫液流量：0.4 ml/min；4)反應(yīng)液流量：0.35 ml/min；5)柱溫：57℃；6)反應(yīng)溫度：135℃；病理學(xué)觀察采用常規(guī)HE切片染色，切片拍照后采用Image-pro plus 6.0軟件測量肌纖維橫截面積(Cross sectional area，CSA)與直徑。出現(xiàn)圓形化與核中移現(xiàn)象的肌纖維則依據(jù)“全或無”原則，在各處理組各只動物的肌肉組織切片中一旦發(fā)現(xiàn)圓形化與核中移現(xiàn)象即記為1例[3]。

1.5.2 Western Blotting

測試在第三軍醫(yī)大學(xué)完成。取100 mg肌肉組織置于EP管中，加入哺乳動物組織蛋白提取試劑(加蛋白酶抑制劑，10 ml T-MER加1片)500 μl，然后用眼科剪將肌肉組織剪成1～2 mm3碎粒，再用內(nèi)切式組織勻漿器進(jìn)行勻漿，每次15 s，勻漿3～5次以使未剔凈筋膜充分粉碎。此后吸出混懸液至EP管內(nèi)，4℃以12 000 rpm轉(zhuǎn)速離心20 min并吸取上清液。采用BCA法進(jìn)行蛋白定量，檢測完畢后，據(jù)每次上樣120 μg的標(biāo)準(zhǔn)將蛋白進(jìn)行分裝，用PBS將上清液體積補(bǔ)足20 μl，加入5X 蛋白上樣緩沖液5 μl并用封口膜將EP管封好，煮沸變性10 min，之后置于-80℃凍存?zhèn)溆?。配?5%分離膠與5%濃縮膠，濃縮膠恒壓80 V約30～40 min，分離膠恒壓120 V，溴酚藍(lán)至板底后停止電泳。轉(zhuǎn)膜時先用無水甲醇將0.22/0.45 μm PVDF膜激活后300 mA恒流條件下MHC Ⅱ轉(zhuǎn)膜150 min，Atrogin-1、MuRF-1為50 min，Ub為30 min。封閉后分別進(jìn)行一抗(Ub 1∶1 000、Atrogin-1 1∶1 000、MuRF-1 1∶1 000、MHC 1∶3 000、GAPDH 1∶5 000)和二抗(1∶50 000～1∶200 000)孵育。此后用ECL plus使目的條帶發(fā)出綠色熒光并壓片檢測二抗信號，壓片時間視熒光強(qiáng)弱而定。目的條帶判斷參考說明書條帶大小，據(jù)預(yù)染蛋白marker位置判斷蛋白大體位置，若在目的條帶大小位置附近僅出現(xiàn)1條條帶，即認(rèn)定為目的條帶。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

體重與每日平均采食量時程變化采用Repeated measures ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計。處死前體重為禁食稱重，故對初始、末次干預(yù)后(第8周體重)和處死前體重比較采用配對t檢驗法。其他指標(biāo)采用One-way ANOVA進(jìn)行分析，據(jù)方差齊性選擇相應(yīng)P值判斷。P<0.05時，認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

與Leu組小鼠相比，NC及Ala組小鼠毛發(fā)脫落情況嚴(yán)重且毛色枯黃、缺少光澤，精神萎靡、行動遲緩、少動而嗜睡。2.2 體重與采食量的變化

據(jù)本研究組前期相關(guān)報道[2]，組間效應(yīng)分析及獨立樣本t檢驗顯示，添加Leu并未造成兩組小鼠體重、平均采食量及總采食量產(chǎn)生具有統(tǒng)計學(xué)意義的差異(P>0.05，圖1、圖2、表3)；與NC組相比亦是如此(P>0.05)，但處死前體重差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。組內(nèi)效應(yīng)結(jié)果顯示，時間因素對于體重與平均采食量的影響具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，時間×分組交互作用無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。提示，小鼠體重與平均采食量有隨時間變化的趨勢，但時間因素的作用并不因分組的不同而不同。

就組內(nèi)縱向與組間橫向比較而言，體重差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。提示，3組小鼠在實驗期內(nèi)體重較為穩(wěn)定且添加Leu或丙氨酸對體重所造成的影響并不顯著(圖1)。平均采食量組內(nèi)縱向比較結(jié)果與體重一致，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明各組小鼠在實驗期內(nèi)的平均每日采食量較為穩(wěn)定。盡管組間橫向比較結(jié)果略有不同，但也僅在第4周時NC組與Leu組之間(P<0.05)、第5周時Ala組與Leu組之間(P<0.05)觀察到了具有統(tǒng)計學(xué)意義的平均每日采食量差異(圖2)。

圖1 本研究補(bǔ)充亮氨酸對增齡小鼠體重的影響示意圖Figure 1. Effect of Leucine Supplementation on Body Weight of Mice注：*P<0.05,** P<0.01。

2.3 血漿游離氨基酸含量的變化

Leu組小鼠與Ala、NC組小鼠相比僅血漿游離Leu水平顯著升高(P<0.01)，丙氨酸(P<0.01)、谷氨酸(P<0.01)與甘氨酸(P<0.05)血漿游離水平低于Ala組且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，但與NC組相比差異不顯著；其他13種游離氨基酸的水平均未見具有統(tǒng)計學(xué)意義的組間差異(表2)。

2.4 血糖、血清IGF-1、胰島素及血清尿素氮含量的變化

經(jīng)8周干預(yù)，血糖、血清胰島素與IGF-1含量的組間差異未見統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。NC組與Ala組小鼠BUN水平相近，但與Leu相比差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)(表3)。

圖2 本研究補(bǔ)充亮氨酸對增齡小鼠平均采食量的影響示意圖Figure 2. Effect of Leucine Supplementation on Average Daily Food Intake(X±SD,n=7～8)注：* P<0.05 vs. Leu group,** P<0.01 vs. Leu group。

表2 本研究增齡小鼠血漿氨基酸含量一覽表Table 2 Content of Plasma Free Amino Acids

注：*P<0.05 vs. Ala group,**P<0.01 vs. Ala group,#P<0.05 vs. NC group,##P<0.01 vs. NC group。

2.5 腓腸白肌形態(tài)學(xué)的變化

NC、Ala與Leu 3個處理組小鼠腓腸白肌濕重/體重百分比值、纖維CSA以及直徑如表4與圖3 A、B、C所示。經(jīng)8周不同處理干預(yù)后，組間濕重/體重百分比值、纖維CSA及直徑的組間多重比較結(jié)果P值均大于0.05，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但Leu處理組各指標(biāo)均值均表現(xiàn)出升高的趨勢。

就病理改變而言，NC組小鼠腓腸白肌出現(xiàn)圓形化纖維7例，中央核纖維6例；Ala組圓形化與中央核纖維分別出現(xiàn)5例和6例；而Leu組小鼠出現(xiàn)異常肌纖維的頻數(shù)明顯下降，僅有1例出現(xiàn)圓形化纖維，未見核中移現(xiàn)象(圖3 D、E、F)。

表3 本研究增齡小鼠采食總量、血糖、血清胰島素、IGF-1與血尿素氮含量一覽表

注：**P<0.01 vs. Ala group，##P<0.01 vs. NC group。

空白對照組NCGroup添加丙氨酸組AlaGroup添加亮氨酸組LeuGroup肌重/體重比值MWW/BWW(%)0.89±0.330.90±0.120.99±0.13纖維橫截面積FiberCSA(AU)10776.00±1345.011661.10±2771.913305.60±2244.1纖維直徑FiberDiameter(AU)113.70±7.4116.80±12.4124.10±12.5圓形化纖維頻數(shù)Incidenceofroundedfiber(C/s)751核中心化纖維頻數(shù)Incidenceofcentralnucleus(C/s)660

圖3 本研究補(bǔ)充亮氨酸對腓腸白肌纖維形態(tài)學(xué)的影響示意圖

(HE Staining)A:NC group(×200);B:Ala group(×200);C:Leu Group(×200);D:NC group(×400);E:Ala group(×400);F:Leu group(×400).Black rows show mucleolus moved toward the center of fibers,pentagrams show rounded fibers.n=7～8.

2.6 腓腸白肌蛋白總量的變化

Leu組小鼠腓腸白肌蛋白總量較Ala組增長23%，較NC組增長24%，組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但Ala與NC組之間蛋白總量水平差異并不具有統(tǒng)計學(xué)意義(表5)。

2.7 蛋白分解代謝關(guān)鍵蛋白表達(dá)的變化

經(jīng)8周不同處理，各處理組小鼠腓腸白肌內(nèi)與骨骼肌蛋白質(zhì)降解相關(guān)的蛋白表達(dá)水平如圖4所示，Leu組小鼠Ub(圖4-A)、MuRF-1(圖4-B)及Atrogin-1(圖4-C)蛋白表達(dá)量相對NC與Ala組較低(P<0.01)，變化均具有統(tǒng)計學(xué)意義。MHC Ⅱ(圖4-D)蛋白表達(dá)量則較NC與Ala組為高，同樣具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

3 分析與討論

3.1 增齡對骨骼肌量的影響

就機(jī)體的生長發(fā)育曲線而言，生長期中肌肉體積及力量逐漸增長，并在25 歲左右達(dá)到平臺期，保持5～10年之后便開始以每年約1%的速率下降，而在60歲以后隨著衰老進(jìn)程的繼續(xù)，肌肉萎縮的速率將會更快[21]。這種隨著年齡增長而出現(xiàn)的骨骼肌萎縮現(xiàn)象具有較高的流行性，在65～70歲人群中流行性介于10%～24%之間，而在年齡超過80歲的人群中則可達(dá)30%～50%[10,12]。就小鼠而言，在10～12月齡即會出現(xiàn)骨骼肌的選擇性萎縮[11]。伴隨著這一現(xiàn)象的發(fā)生發(fā)展，快肌將會出現(xiàn)顯著的萎縮，而慢肌體積則較為穩(wěn)定。因此，在相關(guān)研究中可以觀察到II型肌纖維數(shù)量、CSA及直徑的減小，而I型肌纖維變化則不顯著[18]。從分子水平而言，則表現(xiàn)為MHC II表達(dá)顯著下降，而MHC I表達(dá)相對穩(wěn)定[26]；同時出現(xiàn)肌纖維的圓形化以及肌核中心化等骨骼肌病理性改變[3]。

空白對照組NCGroup添加丙氨酸組AlaGroup添加亮氨酸組LeuGroup蛋白含量Proteincontent69.12±5.1770.03±5.8386.00±8.03*#

注：*P<0.05 vs. Ala group，#P<0.05 vs. NC group。

圖4 本研究補(bǔ)充亮氨酸對腓腸白肌Ub、MuRF-1、Atrogin-1、MHCⅡ蛋白表達(dá)影響示意圖Figure 4. Effect of Leucine Supplementation on the Expression of Ub,MuRF-1、Atrogin-1 and MHCⅡ in White Gastrocnemius Muscle注：** P<0.01 vs. Ala group，## P<0.01 vs. NC group。

目前，關(guān)于增齡致使骨骼肌發(fā)生進(jìn)行性萎縮的機(jī)理有較多學(xué)說，但蛋白質(zhì)代謝的紊亂被公認(rèn)為重要的影響因素[7,8]，這可能是因為骨骼肌萎縮的本質(zhì)仍在于蛋白質(zhì)分解率超過合成率，機(jī)體處于負(fù)氮平衡狀態(tài)。盡管目前較多學(xué)者認(rèn)為這一現(xiàn)象主要是因骨骼肌蛋白質(zhì)合成減少所致，但近年的研究發(fā)現(xiàn)，在合成率下降的同時蛋白質(zhì)分解代謝水平也有升高，提示，蛋白質(zhì)分解率的升高對這一現(xiàn)象的發(fā)生發(fā)展亦有影響[30]。

隨著年齡的增長，機(jī)體響應(yīng)合成刺激的能力亦隨增齡而進(jìn)行性下降，加之消化、吸收能力的降低，使得機(jī)體在膳食攝入常量蛋白質(zhì)的情況下仍難以有效保證蛋白質(zhì)的沉積[23]，從而提示需要進(jìn)行額外的蛋白質(zhì)補(bǔ)充。氨基酸作為蛋白質(zhì)合成底物，相對于攝入蛋白質(zhì)而言能夠更好的避免消化與吸收功能下降的限制，有效逆轉(zhuǎn)蛋白質(zhì)代謝平衡紊亂。越來越多的研究顯示，必需氨基酸，尤其是Leu可積極促進(jìn)蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)，不僅可促進(jìn)蛋白質(zhì)合成[7]，同時還具有抑制蛋白質(zhì)降解的作用[22]，從而在預(yù)防和延緩增齡性肌肉萎縮向Sarcopenia發(fā)展方面可能具有重要潛力[7]，為利用Leu干預(yù)增齡所致的骨骼肌萎縮提供了理論線索。

3.2 泛素-蛋白酶體系統(tǒng)在骨骼肌萎縮過程中的作用

UPS是調(diào)節(jié)骨骼肌蛋白質(zhì)降解的主要途徑，在蛋白質(zhì)降解的控制方面發(fā)揮特殊效應(yīng)[15,24]。UPS依賴的蛋白質(zhì)降解具有很高的可調(diào)控性。在這一系統(tǒng)內(nèi)，靶蛋白的賴氨酰殘基可被Ub這種76個氨基酸的蛋白質(zhì)連續(xù)的結(jié)合并對其進(jìn)行標(biāo)記，使其在蛋白酶體內(nèi)進(jìn)行降解。目前已知兩種主要的肌肉特異性E3泛素連接酶MuRF1和Atrogin-1是UPS的重要組成部分[13]。有證據(jù)顯示，萎縮肌肉內(nèi)蛋白水解程度的提高主要是UPS蛋白質(zhì)降解的活化所導(dǎo)致的[5]，在包括糖尿病[33]、惡病質(zhì)[16]、腎衰[25]以及衰老[32]在內(nèi)的多種類型的肌肉萎縮過程中，肌肉均表現(xiàn)出一系列共同的適應(yīng)性變化，如泛素-蛋白復(fù)合物、mRNA編碼泛素和多種蛋白酶體亞基。因此，UPS是調(diào)節(jié)骨骼肌蛋白質(zhì)降解的一個主要途徑，且這一系統(tǒng)在控制肌肉體積方面具有重要作用[15]。

從老年前期開始，隨著衰老進(jìn)程的繼續(xù)，骨骼肌在UPS的作用下發(fā)生萎縮，表現(xiàn)為瘦體重的下降，而由于脂肪的增多則可能表現(xiàn)為體重的不變甚至增加，這一現(xiàn)象被稱為Sarcopenic肥胖[28]。本研究發(fā)現(xiàn)，雖然Leu組小鼠體重與Ala和NC組小鼠相比未見顯著增長，但因為本研究采用的是13月齡小鼠，且從肌肉濕重、肌蛋白總量及肌纖維CSA與直徑的變化來看，其肌肉含量高于對照組，因此，研究者分析認(rèn)為這可能恰好在一定程度上佐證了Leu的降體脂作用，與Vianna D[31]最近的研究結(jié)果一致。

3.3 補(bǔ)充亮氨酸對泛素-蛋白酶體系統(tǒng)與骨骼肌萎縮的影響

Leu是目前必需氨基酸中最具有促蛋白合成潛力的一種，因此，學(xué)者們的關(guān)注主要集中于其通過促進(jìn)蛋白質(zhì)合成而削弱骨骼肌萎縮的作用，而其對UPS蛋白質(zhì)降解的影響卻鮮有探討[32]。直至近兩年才有零星證據(jù)報道了其在某些肌肉萎縮條件下對于UPS的影響，如癌癥惡病質(zhì)[20]、廢用性肌萎縮以及地塞米松誘導(dǎo)模型[6]等，且相關(guān)報道顯示，Leu可以抑制MuRF-1與Atrogin-1表達(dá)的上調(diào)并對肌肉CSA具有保護(hù)性作用。盡管如此，Leu對自然增齡所致肌肉萎縮條件下的UPS究竟呈何影響，目前未見報道。Leu干預(yù)肌肉萎縮的過程中究竟能否通過抑制UPS而產(chǎn)生保護(hù)性作用，尚有待澄清。

本研究從整體、細(xì)胞和分子水平分別觀察了Leu在小鼠8周增齡過程中對骨骼肌所產(chǎn)生的作用。結(jié)果表明，添加5%比例Leu并未顯著影響小鼠體重、采食量、血糖、IGF-1和胰島素水平。就骨骼肌形態(tài)學(xué)變化而言，盡管組間腓腸白肌濕重/體重百分比、腓腸白肌纖維CSA、肌纖維直徑未見具有統(tǒng)計學(xué)意義的差異，但從均值水平來看，Leu組仍高于NC與Ala組，在一定程度上仍說明了其干預(yù)骨骼肌萎縮的潛力。研究者認(rèn)為，由于本研究旨在觀察Leu對增齡所致肌肉萎縮的預(yù)防作用，加之動物處死時僅15月齡，可能使得NC與Ala組小鼠肌肉的萎縮性變化并不顯著。此外，本研究所采用的動物為小鼠，單側(cè)腓腸白肌僅重100 mg左右。因此，取材時剪切位置、清洗后的吸干程度、肌腱修剪程度、筋膜剔凈與否均直接影響骨骼肌濕重數(shù)值，使得各處理組動物相關(guān)指標(biāo)的組間多重比較結(jié)果未見顯著性差異。盡管本研究的形態(tài)學(xué)差異并不具有統(tǒng)計學(xué)意義，但從判斷肌肉萎縮的病理學(xué)變化觀察到，Leu組小鼠圓形化及中心核纖維僅出現(xiàn)1例和0例，Ala組分別出現(xiàn)5例與6例，而NC組則分別出現(xiàn)了7例和6例，提示，Leu組小鼠肌肉萎縮程度明顯受到了抑制。

就蛋白水平的變化而言，Leu組小鼠骨骼肌蛋白含量(P<0.05)與MHC Ⅱ(P<0.01)顯著高于Ala組與NC組小鼠，而UPS關(guān)鍵蛋白Ub(P<0.01)、Atrogin-1(P<0.01)及MuRF-1(P<0.01)的表達(dá)水平則均降低。提示，Leu添加抑制了UPS活性，對骨骼肌具有保護(hù)作用。BUN水平的組間差異亦表明，Leu減少了增齡小鼠機(jī)體蛋白質(zhì)與氨基酸的分解代謝，進(jìn)一步佐證了膳食添加Leu削弱骨骼肌蛋白質(zhì)降解的作用。此外，血漿游離氨基酸水平的組間差異，一方面表明了Leu的特殊作用；另一方面，Leu與Ala組小鼠相比甘氨酸、谷氨酸水平的顯著降低亦提示，Ala組小鼠的蛋白質(zhì)分解代謝水平高于Leu組，因而導(dǎo)致兩種非必需氨基酸游離含量的升高，至于NC組所表現(xiàn)出的較低游離氨基酸水平則可能與該組小鼠飼料中粗蛋白含量與氨基酸總量較低有關(guān)[1]。而結(jié)合血清胰島素與IGF-1的水平來考慮，推測Leu對骨骼肌UPS的影響可能是經(jīng)由非胰島素和IGF-1途徑實現(xiàn)的，但具體的機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

5%比例Leu能夠抑制骨骼肌蛋白質(zhì)降解，增加蛋白質(zhì)總量，改善肌纖維病理性變化，具有削弱增齡性肌肉萎縮的潛力，其機(jī)制可能與Leu抑制泛素-蛋白酶體系統(tǒng)活性、誘導(dǎo)MHC Ⅱ表達(dá)水平的增加有關(guān)。

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A Dietary Supplementation with Leucine is Capable to Attenuate Skeletal Muscle Atrophy through Inhibiting Ubiquitin-Proteasome in Pre-senile Mice

XIA Zhi1,ZHAO Yan2,SHANG Hua-yu3,YE Ju-fei4,YANG Li-yuan5,SUN Jun-zhi4,XIONG Wei-ping6,SU Quan-sheng4

Objective:To investigate the effect of leucine supplementation on muscle atrophy induced by ageing and preliminarily analyzes the possible mechanism.Methods:Thirteen-month-old male ICR mice were randomly divided into dietary leucine supplementation (Leu),alanine supplementation (Ala) and normal control group (NC) by body weight.Mice in leucine (Leu) and alanine (Ala) supplementation group were treated with normal chow diet supplemented with 5% leucine and 3.4% alanine respectively for 8 weeks,while normal control group were fed with normal diet.Seventeen hours of fasting after the last feeding,mice were sacrificed.The blood glucose was determined with a portable blood glucose meter.The level of BUN was detected by using spectrophotometry.The profile of plasma free amino acids was detected with an amino acids analyzer.The serum insulin and IGF-1 concentration were determined by ELISA.The skeletal muscle morphology was observed by using hematoxylin and eosin staining.The protein expression of Ub,Atrogin-1,MuRF-1 as well as MHCⅡ was detected by the method of Western blotting after BCA protein assay.Results:Compared with both NC and Ala group,the results showed that,leucine supplementation (Leu) did not change the level of body weight,food intake,blood glucose,serum insulin and IGF-1,while the level of BUN was significantly elevated;The content of plasma leucine was increased,content of alanine,glutamic acid and glycine were all depressed significantly.Although the wet ratio of wet white gastrocnemius muscle to body weight,cross-sectional area and diameter of fibers were not influenced significantly by leucine supplementation,still showed a tendency to increase.The incidence of rounded and central nucleus fibers was reduced.Moreover,total protein content,the protein expression of MHCⅡ were both elevated,while the expression of Ub,Atrogin-1 and MuRF-1 in white gastrocnemius muscle were significantly depressed.There weren’t statistically significant differences of all parameters between mice in NC and Ala group.Conclusion:Leucine supplementation significantly attenuates skeletal muscle atrophy in pre-senile mice,which may be correlated with inhibiting the activity of ubiquitin-proteasome system.

leucine;skeletalmuscle;ubiquitin-proteasome;proteindegradation;atrophy

1000-677X(2015)06-0049-08

10.16469/j.css.201506008

2014-10-08；

2015-05-16

江西省科技廳自然科學(xué)基金青年項目 (20142BAB215048)；四川省教育廳自然科學(xué)科研項目(13ZB0073)。

夏志(1982-)，男，土家族，湖北長陽人，講師，博士，主要研究方向為運動生理學(xué)，E-mail：xiazhi1982@163.com。

1.井岡山大學(xué) 體育學(xué)院，江西 吉安 343009；2.武漢體育學(xué)院 研究生院，湖北 武漢 430079；3.北京體育大學(xué) 運動人體科學(xué)學(xué)院，北京 100084；4.成都體育學(xué)院，四川 成都 610041；5.成都大學(xué) 體育學(xué)院，四川 成都 610106；6.保山學(xué)院 體育學(xué)院，云南 保山 678000。 1.Jinggangshan University,Ji’an 343009,China;2.Wuhan Sports University,Wuhan 430079,China;3.Beijing Sport University,Beijing 100084,China;4.Chengdu Sport University,Chengdu 610041,China;5.Chengdu University,Chengdu 610106,China;6.Baoshan University,Baoshan 678000,China.

G804.2

A