酶法酯交換制備食品專用油脂的研究

鄭東磊，葛遠(yuǎn)飛，易劍鋒，龐 敏，2

（1.合肥工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，安徽合肥 230009；2.安徽省農(nóng)產(chǎn)品加工省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽合肥 230009）

近年來，心血管疾病、肥胖病、動(dòng)脈粥樣硬化等疾病的發(fā)病率逐年上升，而反式脂肪酸（TFA）的存在則是引起這一系列疾病的主要因素之一[1-4]。TFA廣泛存在于人造奶油、起酥油、類可可脂等“部分氫化植物油”，源于其生物氫化、油脂氫化及熱處理工藝過程[5-7]。FDA已于2015年將“部分氫化植物油”移出GRAS名單，近期將在食品行業(yè)全面禁用“部分氫化植物油”。研究開發(fā)營養(yǎng)健康、塑性優(yōu)良的不含反式脂肪酸專用油脂，對(duì)豐富食品專用油脂種類，保障人造奶油行業(yè)健康發(fā)展具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

酶催化酯交換是利用生物酶為催化劑進(jìn)行的酯交換反應(yīng)，是一種可以生產(chǎn)具有特殊性能油脂的改性方法，其原理是通過引起?；闹匦路植?、甘油三酯中脂肪酸的重排來改變油脂的理化性質(zhì)[8]。相比于傳統(tǒng)化學(xué)酯交換，酶催化酯交換技術(shù)能有目的性地實(shí)現(xiàn)甘油基上不同脂肪酸位置重排，從而完成油脂的改性，近些來得到了較廣泛的研究，Kowalska D等人[9]以牛油硬脂和菜籽油為原料進(jìn)行酯交換油脂與其物理混合油脂對(duì)比，得出酯交換油脂具有較低的固體脂肪含量和良好的抗氧化特性。Zhu T等人[10]采用酶法催化棕櫚硬脂和大豆油來制取速凍食品特種油脂，得出酯交換后油脂的固體脂肪含量有所下降，結(jié)晶主要為β'晶型，是理想的速凍食品專用脂肪。

茶籽油是我國特有的木本油脂，含有豐富的必需脂肪酸、亞麻酸，具有和橄欖油類似的高油酸含量，富含VE、角鯊烯等，被譽(yù)為“東方橄欖油”[11]。牛油具有植物油脂所不可比擬的風(fēng)味物質(zhì)、特殊營養(yǎng)、固脂含量和起酥性能，但牛油基產(chǎn)品易起砂，破壞產(chǎn)品的柔軟性，而通過酯交換可以很好地提高以牛油為基料的混合油脂使用性能[12-15]。試驗(yàn)采用酶催化酯交換技術(shù)，開展以牛油、茶籽油和棕櫚硬脂為原料的不含反式脂肪酸專用油脂制備工藝的研究，利用響應(yīng)面法優(yōu)化酯交換反應(yīng)條件以得出最優(yōu)工藝參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛油，重慶帥克食品有限公司提供；一級(jí)茶籽油，安徽舒城華銀茶葉有限公司提供；棕櫚硬脂，廣州天意化工集團(tuán)有限公司提供；Lipozyme RM IM，諾維信公司提供；正己烷、甲醇、異丙醇，均為色譜純；無水乙醇、無水硫酸鈉，均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Heizbad Hei-VAP型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，德國Heizbad公司產(chǎn)品；AR2140型分析天平，梅特勒-托利多儀器有限公司產(chǎn)品；Q200型差示掃描量熱儀，美國TA儀器公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 酯交換油脂的制備

將牛油、棕櫚硬脂加熱融化后按照一定的質(zhì)量比（牛油、茶籽油、棕櫚硬脂）加入到圓底燒瓶中，搖勻后加入一定比例的固定化脂肪酶Lipozyme RM IM，設(shè)定旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀轉(zhuǎn)速為70 r/min，抽取真空，恒溫反應(yīng)一定時(shí)間，待反應(yīng)結(jié)束后及時(shí)去除固定化脂肪酶，醇洗去除游離脂肪酸和單甘脂等雜質(zhì)，旋蒸去掉殘余的乙醇，得到酯交換產(chǎn)物即酯交換油脂。

1.3.2 滑動(dòng)熔點(diǎn)的測定

根據(jù)AOCS Official Method Cc 3-25方法測定酯交換油脂的滑動(dòng)熔點(diǎn)[12]。

1.3.3 固體脂肪指數(shù)（SFI） 測定

利用油料油脂檢測與分析法測定油酯的固體脂肪指數(shù)[13]。

1.3.4 酯交換油脂制備工藝優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

設(shè)定底物比（牛油∶茶籽油∶棕櫚硬脂） X1為5∶5∶4，6∶4∶4，7∶3∶4，8∶2∶4，9∶1∶4；酶添加量X2為2.5%，3.0%，3.5%，4.0%，4.5%；反應(yīng)時(shí)間X3為0，1，2，3，4，5 h；反應(yīng)溫度X4為50，60，70，80，90℃進(jìn)行單因素試驗(yàn)。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)四因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)，考查酶催化酯交換工藝參數(shù)對(duì)酯交換產(chǎn)物滑動(dòng)熔點(diǎn)的影響。

響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 底物比（牛油∶茶籽油∶棕櫚硬脂）對(duì)酯交換油脂滑動(dòng)熔點(diǎn)的影響

底物比分別設(shè)定 5∶5∶4，6∶4∶4，7∶3∶4，8∶2∶4，9∶1∶4，在酶添加量3.5%，反應(yīng)溫度70℃條件下反應(yīng)3.5 h。

底物比對(duì)酯交換油脂滑動(dòng)熔點(diǎn)的影響見圖1。

圖1 底物比對(duì)酯交換油脂滑動(dòng)熔點(diǎn)的影響

由圖1可知，酯交換油脂的滑動(dòng)熔點(diǎn)隨著牛油所占比例的增大，滑動(dòng)熔點(diǎn)逐漸升高，由5∶5∶4的32.5℃左右升高到9∶1∶4的39.4℃左右，大致呈正相關(guān)。當(dāng)油脂滑動(dòng)熔點(diǎn)近似于人體體溫（37℃）時(shí)，油脂可以在口腔內(nèi)完全融化，不會(huì)有蠟感和黏口感。綜合考慮，選取最佳底物比為7∶3∶4。

2.1.2 酶添加量對(duì)酯交換油脂滑動(dòng)熔點(diǎn)的影響

酶添加量分別設(shè)定2.5%，3.0%，3.5%，4.0%，4.5%，在底物比7∶3∶4，反應(yīng)溫度70℃條件下反應(yīng)3.5 h。

酶添加量對(duì)酯交換油脂滑動(dòng)熔點(diǎn)的影響見圖2。

圖2 酶添加量對(duì)酯交換油脂滑動(dòng)熔點(diǎn)的影響

由圖2可知，當(dāng)固定化脂肪酶添加量低于3.5%時(shí)，隨著酶添加量增加，酯交換反應(yīng)體系的滑動(dòng)熔點(diǎn)下降。這歸因于反應(yīng)底物與酶分子接觸的幾率大大增加，從而提高了酯交換反應(yīng)的效率，降低了反應(yīng)體系的滑動(dòng)熔點(diǎn)。當(dāng)酶添加量高于3.5%時(shí)，反應(yīng)趨于平衡，反應(yīng)體系的滑動(dòng)熔點(diǎn)基本不變化。從經(jīng)濟(jì)效率等方面綜合考慮，選取酶添加量3.5%進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化試驗(yàn)。

2.1.3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)酯交換油脂滑動(dòng)熔點(diǎn)的影響

反應(yīng)時(shí)間分別設(shè)定0，1，2，3，4，5 h，在底物比7∶3∶4，酶添加量3.5%，反應(yīng)溫度70℃條件下反應(yīng)。

反應(yīng)時(shí)間對(duì)酯交換油脂滑動(dòng)熔點(diǎn)的影響見圖3。

圖3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)酯交換油脂滑動(dòng)熔點(diǎn)的影響

由圖3可知，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間較短時(shí)，滑動(dòng)熔點(diǎn)較高，隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，滑動(dòng)熔點(diǎn)逐漸降低，說明隨著酯交換反應(yīng)的進(jìn)行，脂肪酸發(fā)生重排。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間小于4 h時(shí)，滑動(dòng)熔點(diǎn)下降較快；當(dāng)反應(yīng)時(shí)間大于4 h時(shí)，滑動(dòng)熔點(diǎn)趨向于平緩，說明反應(yīng)已經(jīng)達(dá)到平衡，由于反應(yīng)時(shí)間的延長會(huì)增加?；霓D(zhuǎn)移幾率和副反應(yīng)的發(fā)生，能耗也隨之增加，所以綜合考慮選取最佳的反應(yīng)時(shí)間為3.5 h。

2.1.4 反應(yīng)溫度對(duì)酯交換油脂滑動(dòng)熔點(diǎn)的影響

反應(yīng)溫度分別設(shè)定50，60，70，80，90℃，在底物比7∶3∶4，酶添加量3.5%，反應(yīng)時(shí)間3.5 h條件下反應(yīng)。

反應(yīng)溫度對(duì)酯交換油脂滑動(dòng)熔點(diǎn)的影響見圖4。

圖4 反應(yīng)溫度對(duì)酯交換油脂滑動(dòng)熔點(diǎn)的影響

由圖4可知，當(dāng)反應(yīng)溫度較低（50～60℃） 時(shí)，反應(yīng)體系的滑動(dòng)熔點(diǎn)比較高，即滑動(dòng)熔點(diǎn)下降較少（未反應(yīng)時(shí)滑動(dòng)熔點(diǎn)43.0℃左右），則表明酯交換反應(yīng)速率較緩，可能是當(dāng)溫度比較低的時(shí)候，酶活較低，催化效率低。當(dāng)溫度逐漸增加時(shí)，酶的催化效率逐漸升高；當(dāng)反應(yīng)溫度大于70℃時(shí)，滑動(dòng)熔點(diǎn)下降趨勢(shì)平緩，并逐漸達(dá)到平衡，溫度繼續(xù)升高，滑動(dòng)熔點(diǎn)不再下降，考慮到較高的溫度可能會(huì)導(dǎo)致酶失活，增加甘油三酯的水解和酰基轉(zhuǎn)移等副反應(yīng)發(fā)生的幾率。綜合考慮，選取最佳反應(yīng)溫度為70℃。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)Design Expert 8.0提供的模型，以底物比（X1）、酶添加量（X2）、反應(yīng)時(shí)間（X3）、反應(yīng)溫度（X4）4個(gè)因素為自變量，以3次試驗(yàn)所測得酯交換產(chǎn)物滑動(dòng)熔點(diǎn)的平均值為響應(yīng)值（Y）。

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果

利用響應(yīng)面分析軟件進(jìn)行多元回歸擬合，以滑動(dòng)熔點(diǎn)（Y）與底物配比、酶添加量、反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)溫度之間建立的響應(yīng)面回歸模型如下：

對(duì)其試驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行方差分析。

響應(yīng)面二次回歸方程模型方差分析結(jié)果見表3。

通過響應(yīng)面方差分析結(jié)果可以看出，X1，X2，X3，X4，X12對(duì)滑動(dòng)熔點(diǎn)Y的影響都非常顯著；X2X3對(duì)滑動(dòng)熔點(diǎn)的比較顯著，具有交互作用。模型整體擬合度非常顯著 （p＜0.05），并且 R2=98.16%，R2Adj=96.32%，預(yù)測性可達(dá)到90.70%，說明該模型的建立與試驗(yàn)擬合度良好，具有很高的可信度。

2.3 酯交換油脂制備最優(yōu)工藝確定與驗(yàn)證

表3 響應(yīng)面二次回歸方程模型方差分析結(jié)果

統(tǒng)計(jì)分析后，根據(jù)油脂滑動(dòng)熔點(diǎn)接近于人體體溫時(shí)可以在口腔內(nèi)完全融化，不會(huì)有黏口感和蠟感，所以優(yōu)化試驗(yàn)時(shí)以37℃為最優(yōu)條件，得到最優(yōu)酶催化酯交換反應(yīng)條件為底物比7.55∶2.45∶4.00（牛油∶茶籽油∶棕櫚硬脂），酶添加量3.65%，反應(yīng)時(shí)間3.85 h，反應(yīng)溫度72.6℃。通過驗(yàn)證試驗(yàn)得到的油脂實(shí)際滑動(dòng)熔點(diǎn)為36.8℃，與理論值較為接近，誤差小于1%。

2.4 酯交換反應(yīng)前后油脂的固體脂肪指數(shù)分析

酯交換反應(yīng)前后油脂的固體脂肪指數(shù)見圖5。

圖5 酯交換反應(yīng)前后油脂的固體脂肪指數(shù)

固體脂肪指數(shù)是衡量人造奶油等專用油脂品質(zhì)的重要指標(biāo)之一，它與油脂的涂抹性、口溶性和外觀等有著密切的聯(lián)系。由圖5可知，油脂酯交換前后油脂的固體脂肪指數(shù)反生了明顯變化，在10～40℃時(shí)，原料油脂經(jīng)酯交換反應(yīng)后，固體脂肪指數(shù)大大下降，說明經(jīng)過酯交換反應(yīng)高熔點(diǎn)甘油三酯含量大大降低，固體脂肪含量大大減少；在接近人體體溫時(shí)，固體脂肪指數(shù)由原來的20%左右，降至5%左右，說明油脂在人口中幾乎可以全部融化，增加了油脂的口感，極大地降低了油脂的粗糙感和砂粒感；同時(shí)在20～35℃內(nèi)，固體脂肪指數(shù)曲線是一條陡峭的融化曲線，說明油脂在口中可以急劇融化，吸收熱量給人一種清爽的口感，酯交換油脂是理想的食品專用油脂。

3 結(jié)論

通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化分析得到酶催化酯交換反應(yīng)最優(yōu)工藝條件為底物比7.55∶2.45∶4.00（牛油∶茶籽油∶棕櫚硬脂），酶添加量3.65%，反應(yīng)時(shí)間3.85 h，反應(yīng)溫度72.6℃。在最優(yōu)反應(yīng)條件下，酯交換油脂的滑動(dòng)熔點(diǎn)近似于人體體溫，固體脂肪指數(shù)較反應(yīng)前大大降低，并對(duì)建立的模型進(jìn)行了驗(yàn)證，證明其具有高可信度。酯交換反應(yīng)后產(chǎn)物油脂的固體脂肪指數(shù)降低，可作為良好的替代氫化油的人造奶油基料油。