胸腹水中提高腫瘤細(xì)胞檢出率方法的探討

譚衛(wèi)峰，劉慶猛，石丹

（紹興第二醫(yī)院，浙江 紹興312000）

胸腹水中提高腫瘤細(xì)胞檢出率方法的探討

譚衛(wèi)峰，劉慶猛，石丹

（紹興第二醫(yī)院，浙江 紹興312000）

目的探討胸、腹水中提高腫瘤細(xì)胞檢出率的方法。方法收集本院2013年1月～2014年1月期間胸、腹水67例，其中胸水45例，腹水22例，分別進(jìn)行常規(guī)涂片、細(xì)胞塊連續(xù)切片以及細(xì)胞塊免疫細(xì)胞化學(xué)染色三種方法的比較，分析三種方法的腫瘤細(xì)胞檢出率之間的區(qū)別。結(jié)果細(xì)胞塊免疫細(xì)胞化學(xué)染色的腫瘤細(xì)胞檢出率要高于常規(guī)涂片和細(xì)胞塊連續(xù)切片法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論胸腹水進(jìn)行離心沉淀后制作細(xì)胞塊，進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，能明顯提高惡性胸腹水的腫瘤細(xì)胞檢出率。

胸腹水；細(xì)胞塊；免疫組化；檢出率

傳統(tǒng)細(xì)胞學(xué)檢查是指臨床送檢的胸腹水經(jīng)離心沉渣后直接涂片HE染色，這種方式簡(jiǎn)單方便，但是陽(yáng)性檢出率低，容易漏診。本院采用的是SHANDON公司Cytospin3細(xì)胞離心機(jī)，制成涂片，鏡下觀(guān)察優(yōu)于傳統(tǒng)直接涂片，但也會(huì)丟失部分腫瘤細(xì)胞，對(duì)于腫瘤細(xì)胞的分型和來(lái)源是無(wú)法判斷的。而胸腹水離心沉淀后，沉渣制作細(xì)胞塊，常規(guī)連續(xù)切片進(jìn)行常規(guī)HE染色，進(jìn)行鏡下觀(guān)察，細(xì)胞形態(tài)真實(shí)，大多可見(jiàn)組織結(jié)構(gòu)；常規(guī)沉渣石蠟切片后免疫細(xì)胞化學(xué)染色，能有效地解決常規(guī)涂片兩個(gè)問(wèn)題：腫瘤細(xì)胞的收集和來(lái)源分型判斷[1]。本文比較常規(guī)涂片、細(xì)胞塊連續(xù)切片以及細(xì)胞塊免疫細(xì)胞化學(xué)染色三種方法的腫瘤細(xì)胞檢出率，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集本院2013年1月～2014年1月期間胸腹水67例，其中胸水45例，腹水22例，男30例，女37例，年齡41～83歲，平均 （62.4± 10.53）歲。分別用Cytospin3細(xì)胞離心機(jī)常規(guī)涂片、細(xì)胞塊石蠟包埋切片以及常規(guī)切片后邁新公司EliVision二步法免疫組化染色。

1.2方法

1.2.1傳統(tǒng)涂片HE染色 全部67例胸腹水用國(guó)產(chǎn)臺(tái)式離心機(jī)3000轉(zhuǎn)/min離心5分鐘后，取接近沉淀上清液0.5mL，Cytospin3細(xì)胞離心機(jī)常規(guī)涂片后進(jìn)行HE染色，光鏡下細(xì)胞學(xué)診斷（見(jiàn)圖1）。判斷標(biāo)準(zhǔn)：光鏡下腫瘤細(xì)胞細(xì)胞核增大、染色質(zhì)增粗、核漿比增高、核仁明顯。

1.2.2胸腹水細(xì)胞塊制備及HE染色 沉淀部分在棄去上清液后，沿試管側(cè)壁緩慢滴入95%酒精，與沉渣的比例約為1:4～5，然后靜置固定24小時(shí)，倒去酒精，用尖頭竹棒輕輕挑出沉淀物后用包埋紙包裹，常規(guī)脫水、透明、浸蠟，石蠟包埋連續(xù)切片[2]（見(jiàn)圖2）。判斷標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞塊連續(xù)切片下腫瘤細(xì)胞呈巢狀分布，部分形成腺樣結(jié)構(gòu)，細(xì)胞異型明顯，核漿比高、可見(jiàn)核分裂[3]。

1.2.3細(xì)胞塊免疫細(xì)胞化學(xué)染色標(biāo)記 用邁新公司EliVision二步法免疫組化染色，細(xì)胞塊常規(guī)連續(xù)切片，二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，用PBS（pH7.4）沖洗3次，每次3分鐘；根據(jù)每種抗體的要求，對(duì)組織抗原進(jìn)行相應(yīng)的修復(fù)；如果有必要，每張切片加1滴或50μL的3%H202，室溫孵育10分鐘，以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性。PBS沖洗，除去PBS液，每張印片加1滴或50μL第一抗體，室溫孵育60分鐘；PBS沖洗后，每張印片加1滴或50μL聚合物增強(qiáng)型（試劑A），室溫孵育20分鐘。PBS沖洗后，每張切片加1滴或50μL酶標(biāo)抗鼠／兔聚合物（試劑B），室溫孵育30分鐘。PBS沖洗后，每張切片加1滴或50μL新鮮配制的DAB，顯微鏡觀(guān)察3～5分鐘；自來(lái)水沖洗，蘇木素復(fù)染，用0.1%HCl酒精分化自來(lái)水沖洗，PBS返藍(lán)，經(jīng)梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。檢測(cè)的抗體為：CK19、CK（L）、TTF1、CK8、CEA、Moc-31；判讀標(biāo)準(zhǔn)：CK19、CK（L）、CK8、CEA、Moc-31均為細(xì)胞質(zhì)著色，TTF1為細(xì)胞核著色。免疫組化染色結(jié)果（見(jiàn)圖3～8）。細(xì)胞塊免疫組化染色后，CK19、CK（L）、CK8、CEA、Moc-31均為細(xì)胞質(zhì)著色，TTF1細(xì)胞核著色，定位準(zhǔn)確、陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，三種方法腫瘤細(xì)胞檢出率兩兩比較，采用列聯(lián)表χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1三種方法的腫瘤細(xì)胞檢出率比較 直接涂片法與細(xì)胞塊切片法比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （χ2= 2.555，P=0.182）；直接涂片法與細(xì)胞塊免疫細(xì)胞化學(xué)染色法比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （χ2=32.074，P= 0.000）；細(xì)胞塊切片法與細(xì)胞塊免疫細(xì)胞化學(xué)染色法比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=19.067，P=0.000），見(jiàn)表1。

表1 胸腹水中三種方法的腫瘤細(xì)胞檢出率的比較（n，%）

2.2組織病理學(xué)檢查 67例細(xì)胞塊免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢出惡性腫瘤細(xì)胞35例，均經(jīng)過(guò)組織病理學(xué)診斷證實(shí)。

3 討論

胸腹水細(xì)胞學(xué)檢查為病理科日常工作，但部分胸腹水受其他因素的影響，對(duì)作出正確的診斷帶來(lái)一定的困難。如間皮細(xì)胞分布胸腔、腹腔，間皮細(xì)胞的增生可見(jiàn)多核細(xì)胞，由小到大形態(tài)多樣；細(xì)胞從未分化到分化成熟，核漿比從大到小，核仁從不明顯到大，不典型增生的間皮細(xì)胞常成團(tuán)存在，也有散在，核深染增大表現(xiàn)為桑葚樣、球樣、腺樣或?yàn)V泡樣、小梁和乳頭狀等結(jié)構(gòu)，也可見(jiàn)核分裂象，炎性胸腹水增生或退變的間皮細(xì)胞與某些惡性腫瘤細(xì)胞尤其是腺癌細(xì)胞在形態(tài)上易于混淆，因此，在胸腹水中，間皮細(xì)胞的存在很容易造成假陽(yáng)性診斷[4]。本文胸、腹水67例，分別進(jìn)行常規(guī)涂片、細(xì)胞塊連續(xù)切片、細(xì)胞塊免疫細(xì)胞化學(xué)染色三種方法進(jìn)行染色，根據(jù)三種方法各自的判斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判讀，直接涂片找到惡性腫瘤細(xì)胞5例、可疑腫瘤細(xì)胞12例、未檢出腫瘤細(xì)胞50例，細(xì)胞塊連續(xù)切片找到惡性腫瘤細(xì)胞11例、可疑腫瘤細(xì)胞18例、未檢出腫瘤細(xì)胞38例，細(xì)胞塊免疫細(xì)胞化學(xué)染色找到惡性腫瘤細(xì)胞35例、可疑腫瘤細(xì)胞14例、未檢出腫瘤細(xì)胞18例，三組惡性腫瘤細(xì)胞檢出率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與尚士宣等[5]報(bào)道相仿。

胸腹水常規(guī)直接涂片比較單一、局限，細(xì)胞涂片只能提供一次性的診斷需要，沒(méi)有后續(xù)的儲(chǔ)備利用；而細(xì)胞蠟塊制作簡(jiǎn)單，對(duì)設(shè)備要求低，在病理科現(xiàn)有常規(guī)設(shè)備下，完全能夠制作完成。收集的細(xì)胞較常規(guī)涂片多而且相對(duì)集中，易于觀(guān)察腫瘤的組織形態(tài)，可以增加腫瘤脫落細(xì)胞的診斷價(jià)值。另外細(xì)胞蠟塊可制成多張切片，長(zhǎng)期保存，進(jìn)行一系列組織化學(xué)和免疫組化染色，作電鏡、PCR檢查，進(jìn)行分子病理學(xué)診斷和研究，有助于診斷和分型診斷：如Calretinin、Vimentin、MC陽(yáng)性多提示增生的間皮細(xì)胞；CK7、TTF-1、Napsin-A陽(yáng)性多提示腫瘤細(xì)胞來(lái)源于肺；CK7、CA125陽(yáng)性多提示腫瘤細(xì)胞來(lái)源于卵巢；CDX2、CK20陽(yáng)性提示腫瘤細(xì)胞來(lái)源于胃腸道[6]；對(duì)于一些抗體的組織特異性并非絕對(duì)的，可以進(jìn)行多種抗體聯(lián)合進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色并設(shè)立對(duì)照，有助于解決特異性不高的問(wèn)題。

鑒于直接涂片、細(xì)胞塊連續(xù)切片和細(xì)胞塊免疫細(xì)胞化學(xué)染色各自的優(yōu)缺點(diǎn)，作者采用的方法是：先直接涂片進(jìn)行篩選，對(duì)于細(xì)胞有異型或

圖1 200倍鏡下直接涂片腫瘤細(xì)胞：細(xì)胞核增大、染色質(zhì)增粗、核漿比增高、核仁明顯。

圖2 200倍鏡下細(xì)胞塊連續(xù)切片腫瘤細(xì)胞：呈巢狀分布，部分形成腺樣結(jié)構(gòu)，細(xì)胞異型明顯，核漿比高、可見(jiàn)核分裂。

圖3 細(xì)胞塊酶標(biāo)CK19陽(yáng)性

圖4 細(xì)胞塊酶標(biāo)CK（L）陽(yáng)性

圖5 細(xì)胞塊酶標(biāo)TTF1陽(yáng)性

圖6 細(xì)胞塊酶標(biāo)CK8陽(yáng)性

圖7 細(xì)胞塊酶標(biāo)CEA陽(yáng)性

圖8 細(xì)胞塊酶標(biāo)Moc-31陽(yáng)性

高度懷疑的胸腹水，進(jìn)行細(xì)胞塊的HE切片觀(guān)察，結(jié)合免疫組化染色結(jié)果，判讀胸腹水中是否找到腫瘤細(xì)胞，以及根據(jù)免疫組化的結(jié)果提示腫瘤細(xì)胞的分類(lèi)及來(lái)源。這樣可以避免異型的間皮細(xì)胞對(duì)于診斷結(jié)果的影響，取得比較滿(mǎn)意的結(jié)果。

綜上所述，在診斷細(xì)胞學(xué)不斷發(fā)展的前景下，細(xì)胞塊免疫細(xì)胞化學(xué)染色法具有腫瘤細(xì)胞檢出率高、腫瘤細(xì)胞分型診斷以及后續(xù)的利用范圍廣等優(yōu)勢(shì)，越來(lái)越受到臨床醫(yī)生的重視，技術(shù)也會(huì)不斷的完善。

[1] 毛瑛玉，楊敏，劉冬戈，等.細(xì)胞塊切片免疫細(xì)胞化學(xué)染色在漿膜腔積液細(xì)胞學(xué)診斷中的應(yīng)用.中華病理學(xué)雜志，2009，38（8）:547

[2] 張婉儀，羅麗花，劉惠娟，等.胸腹水細(xì)胞塊制作技術(shù)及應(yīng)用.臨床醫(yī)學(xué)工程，2014，1（21）:44

[3] 朱利，劉雙元，馮君，等.胸腹水沉渣切片對(duì)腫瘤細(xì)胞診斷的意義.臨床和實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2011，10（13）:1037

[4] 宋新蘭，付娟娟.全自動(dòng)免疫組化染色儀在胸腹水脫落細(xì)胞診斷中的應(yīng)用價(jià)值.診斷病理學(xué)雜志，2013，5（20）：313

[5] 尚士宣，趙曉丹，肖月英.細(xì)胞塊切片免疫組化染色在腫瘤細(xì)胞學(xué)診斷中的應(yīng)用.腫瘤基礎(chǔ)與臨床，2012，23（6）:514

[6] 石龍姣.免疫細(xì)胞化學(xué)在胸腹水腫瘤細(xì)胞學(xué)診斷中的應(yīng)用.醫(yī)學(xué)理論與實(shí)踐，2013，26（6）:721