可樂(lè)麗菲露S3B O N D和可樂(lè)麗菲露S EB O N D應(yīng)用于B e a g l e s犬直接蓋髓術(shù)的組織學(xué)評(píng)價(jià)

張帥

（浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬杭州口腔醫(yī)院，浙江 杭州310006）

·實(shí)驗(yàn)研究·

可樂(lè)麗菲露S3B O N D和可樂(lè)麗菲露S EB O N D應(yīng)用于B e a g l e s犬直接蓋髓術(shù)的組織學(xué)評(píng)價(jià)

張帥

（浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬杭州口腔醫(yī)院，浙江 杭州310006）

目的比較可樂(lè)麗菲露S3BOND和可樂(lè)麗菲露SE BOND及氫氧化鈣Ca（OH）2（VLC DYCAL）對(duì)體內(nèi)牙髓細(xì)胞的毒性。方法選擇6只Beagles犬共144顆健康牙齒，108顆在頰面制備Ⅴ類洞并在洞底做人工穿髓孔，然后分為3組，實(shí)驗(yàn)組分別用第五代自酸蝕牙本質(zhì)黏結(jié)劑SE BOND，第7代牙本質(zhì)黏結(jié)劑S3BOND，對(duì)照組用Ca（OH）2（VLC DYCAL）蓋髓。剩余36顆牙齒作為空白對(duì)照組。所有實(shí)驗(yàn)牙齒分別在蓋髓后的第7、30、90天拔出，并進(jìn)行組織學(xué)評(píng)價(jià)。結(jié)果病理學(xué)評(píng)價(jià)顯示：7天時(shí)，3組材料有不同程度的炎癥反應(yīng)和組織紊亂，比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；30天時(shí)，3組材料炎癥反應(yīng)有差異，其中SE BOND組與S3BOND組、Ca（OH）2組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），S3BOND與Ca（OH）2間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），3組材料組織紊亂比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；90天時(shí)，炎癥反應(yīng)經(jīng)組內(nèi)兩兩比較，SE BOND與S3BOND、Ca（OH）2差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），S3BOND與Ca（OH）2間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），3組材料組織紊亂比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論S3BOND較SE BOND對(duì)牙髓的刺激性較小。

Beagles犬；直接蓋髓術(shù)；牙本質(zhì)黏結(jié)劑；細(xì)胞毒性

牙本質(zhì)黏結(jié)劑是指用于牙本質(zhì)表面的黏接劑，由牙本質(zhì)處理劑、底涂劑、黏接劑3部分組成。從多瓶裝到一瓶裝，使用步驟從三步法到一步法，至今已發(fā)展到了第7代牙本質(zhì)黏結(jié)劑，即單瓶裝，一步法。其操作方便，黏結(jié)強(qiáng)度強(qiáng)，但對(duì)其細(xì)胞毒性少有研究?？蓸?lè)麗菲露S3BOND是第7代牙本質(zhì)黏結(jié)劑的代表產(chǎn)品，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)比較S3BOND與臨床常用的第五代牙本質(zhì)黏結(jié)劑SE BOND及Ca（OH）2對(duì)牙髓細(xì)胞的毒性，以期對(duì)臨床操作中牙本質(zhì)黏結(jié)劑的選擇起到指導(dǎo)作用。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組 2012年9月30日由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供1周歲健康，體質(zhì)量6kg純系雄性 Beagles犬6只，動(dòng)物合格證號(hào)：SYXK（浙）2010-4596，每條犬選用健康的切牙、前磨牙、磨牙24顆，6條犬共選擇144顆，其中108顆作為實(shí)驗(yàn)組，剩余牙齒36顆為對(duì)照組。按照觀察時(shí)間的不同，6條犬隨機(jī)分為7天，30天，90天組。每條犬1個(gè)象限6顆牙齒使用1種黏結(jié)劑，形成1個(gè)實(shí)驗(yàn)組。每條犬 24顆牙形成 S3BOND，SE BOND，Ca（OH）23個(gè)實(shí)驗(yàn)組和空白對(duì)照組。

1.2手術(shù)方法 手術(shù)2周前對(duì)Beagles犬口內(nèi)的實(shí)驗(yàn)用牙齦上潔治，手術(shù)當(dāng)天，再次對(duì)實(shí)驗(yàn)所用牙齒進(jìn)行潔治，并用3%H2O2及0.9%NaCl沖洗。于Beagles犬后肢靜脈注射3%戊巴比妥麻醉后，口腔內(nèi)用棉卷隔濕，碘伏消毒，用高速裂鉆在實(shí)驗(yàn)用牙頰中1/3處備洞，透紅后制備直徑0.5mm的穿髓孔，腎上腺素棉球止血，生理鹽水沖洗，干燥窩洞。分別用可樂(lè)麗菲露S3BOND，可樂(lè)麗菲露SE BOND及Ca（OH）2蓋髓，最后所有窩洞均以可樂(lè)麗菲露AP復(fù)合樹脂充填，打磨拋光。所有操作均由同一實(shí)驗(yàn)者完成。

1.3取材與切片制備 6條Beagles犬分別于術(shù)后第7、30、90天處死，用4%多聚甲醛通過(guò)雙側(cè)頸動(dòng)靜脈進(jìn)行頭頸部灌注3小時(shí)，后結(jié)扎頸動(dòng)靜脈。固定4天后拔出所有實(shí)驗(yàn)用牙齒，微波爐中浸入10% EDTA液中脫鈣8小時(shí)，石蠟包埋，5滋m厚度切片，HE法染色。

1.4評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn) 對(duì)切片均按照以下的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[1]進(jìn)行病理學(xué)分級(jí)評(píng)價(jià)。細(xì)胞炎性反應(yīng)的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)為0～3級(jí)，0級(jí):穿髓孔對(duì)應(yīng)處牙髓組織中沒有或僅有個(gè)別炎性細(xì)胞；1級(jí):多形性及單個(gè)核細(xì)胞輕度浸潤(rùn)；2級(jí):冠髓有中度炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；3級(jí):冠髓有重度炎性細(xì)胞浸潤(rùn)或膿腫形成。組織紊亂的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)為0～3級(jí)，0級(jí):正常組織；1級(jí):成牙本質(zhì)細(xì)胞層紊亂，中心牙髓組織正常；2級(jí):全部牙髓組織失去正常形態(tài)；3級(jí):牙髓壞死。硬組織形成的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)為0～3級(jí)，0級(jí):無(wú)硬組織形成；1級(jí):穿髓孔下有少量硬組織沉積；2級(jí):穿髓孔下有中等量硬組織沉積；3級(jí):穿髓孔下有大量硬組織沉積，牙本質(zhì)橋形成。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。多個(gè)樣本比較的秩和檢驗(yàn)使用kruskalwallis法進(jìn)行H檢驗(yàn)。組內(nèi)兩兩比較，使用配對(duì)資料秩和檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1術(shù)后不同時(shí)間各組病理學(xué)評(píng)價(jià)，見表1。7天時(shí)，3組材料有不同程度的炎癥反應(yīng)和組織紊亂，炎癥反應(yīng)方面H=3.64＜H0.05=5.99，組織紊亂方面 H=2.87＜H0.05=5.99，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

表1 術(shù)后不同時(shí)間各組病理學(xué)評(píng)價(jià)

30天時(shí)，三個(gè)實(shí)驗(yàn)組炎癥程度比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中SE BOND組與S3BOND組、Ca（OH）2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05），S3BOND與Ca（OH）2間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；組織紊亂方面H=3.76＜H0.05=5.99，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

90天時(shí)，炎癥反應(yīng)方面H=6.32＞H0.05=5.99，P＜0.05。經(jīng)組內(nèi)兩兩比較，其中 SE BOND組與S3BOND組查 T界值表 P＜0.05；SE BOND組與Ca（OH）2組查T界值表P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。S3BOND與Ca（OH）2差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；組織紊亂方面H=2.59＜H0.05=5.99，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2空白對(duì)照組 空白對(duì)照組的牙髓組織各層細(xì)胞清晰可見，排列整齊，表明本實(shí)驗(yàn)中標(biāo)本制備，固定及染色技術(shù)有效可行。

2.3術(shù)后不同時(shí)間各組病理學(xué)評(píng)價(jià) 如圖1～3所示，7天時(shí)，S3BOND組和SE BOND組均有中度炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，牙髓形態(tài)基本正常。Ca（OH）2組有輕度炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，牙髓形態(tài)基本正常。如圖4～6所示，30天時(shí)，S3BOND組和Ca（OH）2組均有輕度炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，牙髓形態(tài)基本正常。SE BOND組有中度炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，牙髓形態(tài)基本正常。如圖7～9所示，90天時(shí)，S3BOND組 和Ca（OH）2組均有輕度炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，牙髓形態(tài)基本正常。SE BOND組有中度炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，牙髓組織部分紊亂。

圖1 S3BOND組7天牙髓的組織學(xué)反應(yīng)（HE×100），有中度炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，牙髓形態(tài)基本正常。

圖2 SE BOND組7天牙髓的組織學(xué)反應(yīng)（HE×100），有中度炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，血管充血，牙髓形態(tài)基本正常。

圖3 Ca(OH)2組7天牙髓的組織學(xué)反應(yīng)（HE×100），有輕度炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，牙髓形態(tài)基本正常。

圖4 S3BOND組30天牙髓的組織學(xué)反應(yīng)（HE×100），輕度炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，牙髓形態(tài)基本正常。

圖5 SE BOND組30天牙髓的組織學(xué)反應(yīng) （HE×100），中度炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，牙髓組織部分紊亂。

圖6 Ca(OH)2組30天牙髓的組織學(xué)反應(yīng)（HE×100），輕度炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，牙髓形態(tài)基本正常。

圖7 S3BOND組90天牙髓的組織學(xué)反應(yīng)（HE×100），輕度炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，牙髓形態(tài)基本正常。

圖8 SE BOND組90天牙髓的組織學(xué)反應(yīng) （HE×100），中度炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，牙髓組織部分紊亂。

圖9 Ca(OH)2組90天牙髓的組織學(xué)反應(yīng)（HE×100），輕度炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，牙髓形態(tài)基本正常。

3 討論

牙本質(zhì)黏結(jié)劑提高了樹脂與牙體間的黏結(jié)力，但是，不足之處是治療后往往有牙髓激惹癥狀。引起牙髓刺激癥狀的原因一般有以下幾點(diǎn)：（1）有聚合產(chǎn)熱后刺激牙髓[2]；（2）殘留未聚合單體刺激牙髓；（3）聚合收縮造成邊緣細(xì)菌性微滲漏引起炎性反應(yīng)，激惹牙髓[3]。其中殘留未聚合單體對(duì)牙髓細(xì)胞的刺激作用是引起牙髓激惹癥狀的主要原因[4]。第7代牙本質(zhì)黏結(jié)劑，底膠與黏結(jié)劑混為一瓶，具有高效、快速、簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)[5]，可形成高強(qiáng)度的均質(zhì)界面，提高了黏結(jié)強(qiáng)度，達(dá)到了樹脂和牙面的有機(jī)結(jié)合[6]。

牙釉質(zhì)為人體中最堅(jiān)固的組織，它含有大量無(wú)機(jī)鈣鹽，所以，一般常規(guī)脫鈣處理需要2～3個(gè)月才能達(dá)到完全脫鈣的目的。而酸類溶液對(duì)牙髓等軟組織損害程度隨脫鈣時(shí)間的延長(zhǎng)而加重，且對(duì)蘇木素著色不利[7]。在脫鈣標(biāo)本時(shí)，采用微波加EDTA脫鈣法。微波輻射能引起標(biāo)本內(nèi)部的分子振動(dòng)，使脫鈣液面積增加，接觸界面不斷更新，只需6～7小時(shí)就可達(dá)到切片要求[8]。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，牙髓對(duì)兩種牙本質(zhì)黏結(jié)劑均有炎癥反應(yīng)，這可能因?yàn)檠辣举|(zhì)黏結(jié)劑中含有的單體成分如HEMA、BPA、TEGDMA、GMA，樹脂基質(zhì)類成分BIS-GMA、UDMA等均可對(duì)成纖維細(xì)胞系產(chǎn)生毒性。

隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，各組的炎性反應(yīng)和組織紊亂均呈現(xiàn)出減輕的趨勢(shì)，這可能由于時(shí)間的延長(zhǎng)，牙髓組織的自我修復(fù)越來(lái)越完善。30天和90天組S3BOND炎癥反應(yīng)均較SE BOND輕，與Ca（OH）2無(wú)明顯差異，Ca（OH）2與牙本質(zhì)黏結(jié)劑相比存在很多缺陷，其與牙本質(zhì)表面的附著不牢固，因此邊緣封閉性不佳，凝固時(shí)間不易掌握。Ca（OH）2能促進(jìn)誘導(dǎo)成牙本質(zhì)細(xì)胞分化的TGF-β從牙本質(zhì)中釋放，因此能夠刺激修復(fù)性牙本質(zhì)的形成；黏結(jié)劑的處理劑也能促進(jìn)TGF-β從牙本質(zhì)中釋放，但除了EDTA外，其他處理劑的這種作用均弱于氫氧化鈣[9]。對(duì)于三組都沒有硬組織形成的結(jié)果，作者推測(cè)如果延長(zhǎng)觀察時(shí)間，隨著炎癥反應(yīng)和組織紊亂的減輕，可能會(huì)有牙本質(zhì)橋出現(xiàn)。

[1] 陸玉，劉天佳，皮根莉，等.可樂(lè)麗菲露 S E BO N D應(yīng)用于Beagles犬直接蓋髓術(shù)的組織學(xué)評(píng)價(jià)，華西口腔醫(yī)學(xué)雜志，2005，23（5）：438

[2] Yasuko N，Wataru S，Seiho H，et al.Effect of double application of all-in-one adhesives on dentin bonding.J Dent，2005，33（9）:765

[3] Elizabeth A，Maria H，George P，et al.Cytotoxicity evaluation of an antibacterial dentin adhesive system one stablished cell lines.J Biomed Mater ResB，2008，84（1）:271

[4] Yasuhiro I，Toru N，Shuzo K，et al.Evaluation of dentin bonding performance and acid-base resistance of the interface of two-step self-etching adhesive systems.Dent Mater J，2009，28（4）:493

[5] Subay，Rustem K，Demirci M，et al.Pulp Tissue Reactions to a Dentin Bonding Agent as a Direct Capping Agent.J Endo，2005，31（3）:201

[6] Horsted B，Preben，Vilkinis，et al.Direct capping of human pulps with a dentin bonding system or with calcium hydroxide cement.Oral Surgery，Oral Medicine，Oral Pathology，Oral Radiology，&Endodontics，2003，96（5）:591

[7] Ostby AW，Bishara SE，Denehy GE，et al.Effect of selfetchant pH on the shear bond strength of orthodontic brackets.American J Ort and Dento Ort，2008，134（2）:203

[8] Suge T，Kawasaki A，Ishikawa K，et al.Effects of plaque control on the patency of dentinal tubules:an in vivo study in beagle dogs.Journal of Periodontology，2006，77（3）:454

[9] Marina DF，Marcelo TO，Mirela SS，et al.Bond strength evaluation of self-etch and total-etch adhesive systems on intact and ground human enamel Marina.J Oral Sci，2007，23（6）:1462