大小興安嶺森林土壤中兩種芽孢桿菌對辣椒疫霉菌的拮抗作用

劉思佳，梁國爽，王寧，白龍，崔岱宗，趙敏

（東北林業(yè)大學生命科學學院，黑龍江哈爾濱 150040）

辣椒疫霉菌是引起辣椒疫病的病原體，最早報道于美國新墨西哥州[1]。它具有廣泛的宿主譜，包括茄科、葫蘆科和豆科等，可以引起多種重要的植物病害[2-6]。我國最早于20 世紀60 年代在江蘇省報道，在接下來的20～30 年間傳播至種植辣椒的各個省份，對我國的辣椒種植產(chǎn)業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失[7-11]。

目前，防治辣椒疫病的主要方法是使用化學合成的殺菌劑，但長期使用單一藥劑很可能產(chǎn)生耐藥菌株，使耐藥問題更加嚴重[12]，且產(chǎn)生環(huán)境污染等問題[13]。而生物防治方法防治效果好，不易產(chǎn)生病蟲害防治抗體。使用生物防治技術的微生物可促進健康的植物組織生長、提高植物抗性、控制植物病害發(fā)展、修復土壤生態(tài)系統(tǒng)[14-16]。辣椒疫病的生物防治主要是利用微生物來抑制或直接殺死辣椒疫霉菌的生長，達到防控辣椒疫病的目的[17]。關于生物防治辣椒疫病的方法及其防效測定已有報道[18-20]，其中，芽孢桿菌由于具有培養(yǎng)條件簡單、抗逆性強、抗菌活性物質(zhì)產(chǎn)量相對較高等優(yōu)勢已成為生物防治辣椒疫病的重要材料[21]。蠟樣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌在自然界分布廣泛，枯草芽孢桿菌已在防治植物病害菌劑中普遍應用[22]，蠟樣芽孢桿菌對松材線蟲與番茄根結線蟲具有明顯的預防效果[23-24]，但在防治辣椒疫病方面報道較少。

本試驗以東北大小興安嶺菌物資源調(diào)查項目為依托，選用枯草芽孢桿菌T-BH-4、蠟樣芽孢桿菌5-HH-6進行辣椒疫霉菌拮抗作用的初步探究，為二者在防治辣椒疫病方面奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.2 培養(yǎng)基。燕麥固體培養(yǎng)基（OMA）：25g 市售生燕麥加入蒸餾水煮沸30min，紗布過濾后補加蒸餾水定容至1L，加入15g 瓊脂粉搖勻，高壓滅菌備用。

營養(yǎng)肉湯（NB）：18g 營養(yǎng)肉湯NB 粉溶解到1L 蒸餾水中，高壓滅菌備用。V8 培養(yǎng)基（V8）：100 mL 美國進口V8 蔬菜汁，加入2g 碳酸鈣混勻后煮沸，補加蒸餾水定容至1L，高壓滅菌備用[25]。

1.1.3 試劑。丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量試劑盒，蘇州格銳思生物科技有限公司生產(chǎn)。

1.2 無菌發(fā)酵液和孢子懸浮液的制備

1.2.1 拮抗菌無菌發(fā)酵液的制備。取活化的拮抗菌單菌落接種至200mL 營養(yǎng)肉湯中，37℃振蕩培養(yǎng)24h 得到拮抗菌原液，離心除去菌體。上清液經(jīng)0.22μm 細菌過濾器過濾得到無菌發(fā)酵液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 辣椒疫霉菌孢子懸浮液的制備?；罨?d 后的辣椒疫霉菌，用打孔器打取直徑7 mm 的菌餅放置在培養(yǎng)皿上，每皿20 個菌餅，倒入20mL V8 培養(yǎng)基，28℃下培養(yǎng)3d。將培養(yǎng)皿中培養(yǎng)基抽出，加入20mL 無菌水，12h 后置于4℃冰箱中30～40min，室溫靜置1h，血球計數(shù)板計數(shù)并調(diào)整游動孢子懸浮液濃度至1×106cfu/mL，備用。

1.3 拮抗菌粗提物對辣椒疫霉菌生長和代謝的影響

1.3.1 對菌絲生長的作用。融化的15mL 燕麥固體培養(yǎng)基加入5 mL 無菌發(fā)酵液混合均勻倒平板，在平板中央接種辣椒疫霉菌菌餅，28℃培養(yǎng)，十字交叉法測量第4～11d 的菌落直徑，重復3 次，計算抑菌率。將無菌發(fā)酵液替換為營養(yǎng)肉湯作為對照。

1.3.2 對孢子囊形成的作用。取10 片菌餅置于無菌培養(yǎng)皿，每個培養(yǎng)皿分別加10mL 濃度為25%、50%、75%、100%的無菌發(fā)酵液，28℃光照48 h，吸取15 μL 液體于載玻片，顯微鏡觀察并記錄孢子囊的產(chǎn)生情況，取4個視野，重復3 次，計算孢子囊形成的抑制率。將無菌發(fā)酵液替換為無菌水作為對照。孢子囊形成抑制率（%）=（對照組孢子囊形成數(shù)-處理組孢子囊形成數(shù)/對照組孢子囊形成數(shù)）×100。

1.3.3 對游動孢子萌發(fā)的作用。取5mL 游動孢子懸浮液與1mL 無菌發(fā)酵液均勻混合，28℃下培養(yǎng)8h、16h、24h后顯微鏡觀察游動孢子萌發(fā)個數(shù)，以芽管長度超過孢子直徑一半作為萌發(fā)標準，取5 個視野，每個視野觀察30～40 個游動孢子萌發(fā)情況，重復3 次，計算游動孢子的萌發(fā)率和抑制率。游動孢子萌發(fā)率（%）＝（游動孢子萌發(fā)數(shù)／觀察游動孢子總數(shù)）×100；游動孢子萌發(fā)抑制率（%）=（對照組游動孢子萌發(fā)數(shù)-處理組游動孢子萌發(fā)數(shù)）/對照組游動孢子萌發(fā)數(shù)×100。

1.3.4 對MDA 含量的測定。取1.3.2 中25%濃度無菌發(fā)酵液處理組以及對照組中的菌餅，使用MDA 含量試劑盒測定辣椒疫霉菌的MDA 含量，重復3 次。

2 結果與分析

2.1 拮抗菌粗提物對辣椒疫霉菌菌絲生長的影響

圖1 是枯草芽孢桿菌對辣椒疫霉菌的抑制情況，圖中線段表示十字交叉法測得的菌絲直徑。圖2 是2 種菌對辣椒疫霉菌菌絲生長的抑制率，枯草芽孢桿菌在接種4～14d 階段中對辣椒疫霉菌的抑制率在10%～20%，在接種4d 時抑制率最高，達19.11%；第11d 時抑制率最低，為11.06%。蠟樣芽孢桿菌在接種4～14d 階段中對辣椒疫霉菌的抑制率趨勢逐漸降低，在接種4d 時抑制率最高，達49.79%；第12d 時抑制率最低，為23.01%?？傮w來看，蠟樣芽孢桿菌對辣椒疫霉菌菌絲抑制效果好于枯草芽孢桿菌。

圖1 接種4 d 后拮抗菌粗提物對辣椒疫霉菌菌絲生長的抑制（a，培養(yǎng)基含有B.subtilis 無菌發(fā)酵液；b，培養(yǎng)基含有B.cereus 無菌發(fā)酵液；c，培養(yǎng)基含有營養(yǎng)肉湯。）

圖2 拮抗菌粗提物對辣椒疫霉菌菌絲生長的抑制率

2.2 拮抗菌粗提物對辣椒疫霉菌游動孢子囊形成的影響

由圖3 可知，光照培養(yǎng)48 h 后，由各組孢子成囊數(shù)計算可得：枯草芽孢桿菌與蠟樣芽孢桿菌的無菌發(fā)酵液在100%濃度下抑制率分別為98.48%與95.45%，在75%濃度下分別為78.79%與93.94%，在50%濃度下分別為78.79%與87.88%，在25%濃度下分別為66.67%與78.79%。本試驗結果中，75%、50%、25%濃度的蠟樣芽孢桿菌無菌發(fā)酵液對辣椒疫霉菌游動孢子囊形成的抑制程度均高于等濃度的枯草芽孢桿菌無菌發(fā)酵液。

圖3 拮抗菌粗提物對辣椒疫霉菌游動孢子囊形成的影響

2.3 拮抗菌粗提物對辣椒疫霉菌游動孢子萌發(fā)的影響

由圖4 可知，在培養(yǎng)8h 后，枯草芽孢桿菌與蠟樣芽孢桿菌無菌發(fā)酵液處理后的辣椒疫霉菌游動孢子萌發(fā)率分別為16.52%、15.32%，二者對于辣椒疫霉游動孢子萌發(fā)抑制率分別為27.88%、33.14%；培養(yǎng)16h 后，萌發(fā)率分別為12.59%、11.77%，抑制率分別為74.18%、72.29%；培養(yǎng)24h 后，萌發(fā)率分別為16.65%、21.07%，抑制率分別為61.17%、50.85%。試驗結果表明，培養(yǎng)16h、24h 時2 種芽孢桿菌均對辣椒疫霉菌游動孢子萌發(fā)有明顯抑制效果，培養(yǎng)16h 后在兩種芽孢桿菌的作用下，辣椒疫霉菌游動孢子均達到最低萌發(fā)率與最高抑制率。

圖4 拮抗菌粗提物在培養(yǎng)不同時間對辣椒疫霉菌游動孢子萌發(fā)率的影響

2.4 拮抗菌粗提物對辣椒疫霉菌MDA 含量的影響

由表1 可知，枯草芽孢桿菌無菌發(fā)酵液處理過的辣椒疫霉菌MDA 含量高于對照組66.70%，蠟樣芽孢桿菌無菌發(fā)酵液處理過的辣椒疫霉菌MDA 含量高于對照組151.66%，即蠟樣芽孢桿菌對辣椒疫霉菌細胞膜破壞更嚴重。

表1 拮抗菌粗提物對辣椒疫霉菌MDA 含量的影響

3 討論

3.1 菌粗提液對辣椒疫霉菌菌絲生長的抑制效果

菌絲在病原菌生長過程中，起到固定菌落、吸收養(yǎng)分等作用，并在成熟到一定程度時可產(chǎn)生孢子。抑制病原菌菌絲生長速度是防治病原菌過程中的重要一步。試驗結果表明，雖然在后期蠟樣芽孢桿菌對辣椒疫霉菌菌絲生長的抑制趨勢逐漸降低，但抑制效果仍高于枯草芽孢桿菌。枯草芽孢桿菌對辣椒疫霉菌的抑制率發(fā)展趨勢與以往研究結果[26]一致，在與枯草芽孢桿菌相同培養(yǎng)條件下，蠟樣芽孢桿菌顯示出了更加優(yōu)異的抑制作用。

3.2 菌粗提液對辣椒疫霉菌孢子囊形成與游動孢子萌發(fā)的抑制效果

抑制病原菌的孢子囊形成，對后續(xù)游動孢子釋放、萌發(fā)及侵染具有重要的影響作用。本試驗結果中，75%、50%、25%濃度的蠟樣芽孢桿菌無菌發(fā)酵液對辣椒疫霉菌游動孢子囊形成的抑制程度均高于同等濃度的枯草芽孢桿菌無菌發(fā)酵液。在應用蠟樣芽孢桿菌防治辣椒疫霉菌的過程中，可以從抑制游動孢子成囊方面作為實際生產(chǎn)應用的切入點進行防治。

抑制病原菌游動孢子萌發(fā)對減少病原菌的擴散范圍等方面具有重要意義。本試驗結果中，2 種芽孢桿菌均對辣椒疫霉菌游動孢子萌發(fā)有明顯抑制效果，但二者之間的抑制效果差異不顯著，說明在抑制辣椒疫霉菌游動孢子萌發(fā)方面，2 種芽孢桿菌對其作用力相對一致。

3.3 菌粗提液對辣椒疫霉菌MDA 含量的影響

MDA 是微生物在逆境條件下發(fā)生膜脂過氧化的重要產(chǎn)物之一，能反映細胞膜的過氧化程度和微生物抗逆能力[27]。本試驗結果中，由于蠟樣芽孢桿菌促使辣椒疫霉菌釋放MDA 更多，而MDA 具有細胞毒性更易加劇細胞膜損傷，說明辣椒疫霉菌對蠟樣芽孢桿菌的抗性更弱。

4 結論

本研究數(shù)據(jù)表明，枯草芽孢桿菌T-BH-4 與蠟樣芽孢桿菌5-HH-6 分均在抑制辣椒疫霉菌菌絲生長、游動孢子成囊和萌發(fā)方面有較強的抑制作用，二者也對辣椒疫霉菌細胞膜有著不同程度的傷害。而在抑制辣椒疫霉菌菌絲生長和游動孢子成囊方面，蠟樣芽孢桿菌5-HH-6 更為適合。本試驗結果為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上抑制辣椒疫霉菌提供了新的思路，應得到更加深入的研究、發(fā)揮與利用。