自噬途徑常用分子生物學(xué)指標(biāo)在反映自噬活性上的意義

潘明嬌，王小丹(綜述)，喻　陸(審校)

(1.南方醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，廣州 510515; 2.解放軍總醫(yī)院南樓保健科，北京 100853; 3.解放軍第三○五醫(yī)院腎科，北京 100017)

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自噬途徑常用分子生物學(xué)指標(biāo)在反映自噬活性上的意義

潘明嬌1△，王小丹2(綜述)，喻陸3※(審校)

(1.南方醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，廣州 510515; 2.解放軍總醫(yī)院南樓保健科，北京 100853; 3.解放軍第三○五醫(yī)院腎科，北京 100017)

自噬——溶酶體體系是真核細(xì)胞中兩大降解體系之一，主要負(fù)責(zé)長壽蛋白、損傷細(xì)胞器的清除，與人類多種疾病的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)；根據(jù)底物運送至溶酶體的途徑不同，自噬——溶酶體體系分為3種形式：①分子伴侶介導(dǎo)自噬；②微自噬；③巨自噬，即通常所說的“自噬”[1]。目前大部分自噬相關(guān)研究需通過檢測自噬活性的變化來得出結(jié)論。在眾多的自噬活性檢測手段中，分子生物學(xué)檢測技術(shù)因其簡便易操控，應(yīng)用十分廣泛。通過了解自噬的分子機制及其與泛素蛋白酶體系(ubiquitin proteasome system,UPS)的相互關(guān)系，可以更好地利用自噬途徑常用分子生物學(xué)指標(biāo)對自噬活性的變化做出更為準(zhǔn)確的判斷?，F(xiàn)對自噬途徑常用分子生物學(xué)指標(biāo)在反映自噬活性上的意義綜述如下。

1自噬的分子機制

1.1分隔膜形成階段分隔膜形成階段由unc-51樣激酶1復(fù)合體、Ⅲ型磷脂酰肌醇3-激酶復(fù)合體共同參與[2]。基礎(chǔ)情況下，雷帕霉素靶點(target of rapamycin,TOR)復(fù)合體1通過級聯(lián)調(diào)控Atg基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯，或直接催化Atg13過磷酸化在分隔膜形成階段負(fù)性調(diào)控自噬途徑，將自噬活性保持在較低的水平[3]。然而，在營養(yǎng)限制等誘導(dǎo)條件下，TOR復(fù)合體1活性降低，使Atg13去磷酸化；去磷酸化Atg13與unc-51樣激酶1的親和性增加，兩者結(jié)合后再與Atg17、Atg101共同形成unc-51樣激酶1復(fù)合體[4]。同時，液泡分類蛋白34可聯(lián)合Beclin1、Atg14、Atg15，將磷脂酰肌醇轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇三磷酸，共同組成Ⅲ型磷脂酰肌醇3-激酶復(fù)合體[5]。unc-51樣激酶1復(fù)合體、Ⅲ型磷脂酰肌醇3-激酶復(fù)合體可介導(dǎo)跨膜蛋白Atg9的磷酸化及聚集，進(jìn)一步促進(jìn)胞質(zhì)中脂質(zhì)、Atg蛋白的匯聚，啟動分隔膜的形成[4]。

1.2分隔膜延長階段兩種泛素樣結(jié)合作用促進(jìn)了分隔膜的延長。①Atg12與Atg5的泛素樣結(jié)合：首先，泛素活化酶樣Atg7通過腺苷三磷酸依賴途徑活化Atg12，Atg12活化后與泛素連接酶樣Atg10結(jié)合，并被Atg10運送至Atg5，與Atg5發(fā)生共價性結(jié)合，兩者結(jié)合后再與Atg16L聯(lián)接，最終形成Atg12-Atg5-Atg16L復(fù)合體，而Atg12-Atg5-Atg16L復(fù)合體定位在分隔膜的外膜上，待自噬體成熟后從膜上脫離[6]。②微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-Ⅰ(microtubule-associated protein 1 light chain 3,MAP1LC3-Ⅰ, LC3-Ⅰ)與磷脂酰乙醇胺的泛素樣結(jié)合：LC3是廣泛存在的完整胞質(zhì)蛋白，自噬誘導(dǎo)發(fā)生后，半胱氨酸蛋白酶Atg4將LC3水解成C端甘氨酸殘基暴露的水溶性LC3-Ⅰ，Atg7識別并活化LC3-Ⅰ，活化的LC3-Ⅰ轉(zhuǎn)移至泛素連接酶樣Atg3，在Atg3的催化下，磷脂酰乙醇胺結(jié)合至LC3-Ⅰ C端甘氨酸殘基，生成脂溶性LC3-Ⅱ[7]。LC3-Ⅱ是一類泛素樣蛋白，在自噬體膜的延長、自噬體膜與其他膜結(jié)構(gòu)的融合、自噬體運載“貨物”等過程中起至關(guān)重要的作用[7-8]。其定位在分隔膜、自噬體膜的內(nèi)外膜上，內(nèi)膜被溶酶體降解后，外膜上LC3-Ⅱ被Atg4水解下來重新進(jìn)入胞質(zhì)[9]。以上兩種泛素樣結(jié)合體相互作用，共同促成分隔膜的形成及延長[8,10]。

1.3打包貨物分隔膜在延長過程中，會將胞質(zhì)中聚集的異常蛋白、脂滴、失功能細(xì)胞器、入侵微生物等“貨物”包裹，最終閉合成完整的自噬體，這就是所謂的自噬“打包”過程[2]。以前認(rèn)為自噬的“打包”是隨機的，但越來越多的證據(jù)顯示，有些待降解“貨物”會被加以修飾或是暴露出某些特征，被相關(guān)信號蛋白或分子識別，從而被降解，這部分自噬是具有一定選擇性的[9,11-12]。p62作為一類銜接蛋白，可一端通過泛素連接被標(biāo)志的“貨物”，另一端特異性連接分隔膜或自噬體膜上的LC3蛋白，LC3蛋白起到了類似膜受體的作用，介導(dǎo)了分隔膜的選擇性“打包”過程，最后銜接蛋白與“貨物”一起被降解；類似的銜接蛋白還有乳腺癌1號基因相鄰基因1蛋白(NBR1)、核點蛋白52、optineurin等[12]。研究發(fā)現(xiàn)，因LC3B缺陷引起的自噬途徑阻滯，p62及其連接的泛素化蛋白會出現(xiàn)明顯的堆積[13]。因此，p62蛋白水平與自噬活性在一定范圍內(nèi)呈負(fù)相關(guān)[14]。

1.4自噬溶酶體形成在哺乳動物中，包裹著“貨物”的完整自噬體與溶酶體融合形成自噬溶酶體，才能達(dá)到將“貨物”降解的最終目的[2]。在自噬溶酶體形成之前，自噬體在tectonin結(jié)構(gòu)域蛋白1、Atg12-Atg5結(jié)合體、可溶性N-乙基馬來酰亞胺敏感性因子附著型蛋白受體、內(nèi)體表面蛋白、內(nèi)體蛋白分選轉(zhuǎn)運裝置Ⅲ、同型融合分選蛋白復(fù)合體、溶酶體相關(guān)膜蛋白、Rab蛋白、Ⅲ型磷脂酰肌醇3-激酶復(fù)合體、熱激蛋白70家族等調(diào)控下會先有一個成熟過程，這一成熟過程是自噬體與溶酶體融合的前期準(zhǔn)備工作[15]。此外，TOR活性降低、自噬體膜與溶酶體膜融合均可提升溶酶體的活性，這都有助于自噬溶酶體維持一種酸性的降解環(huán)境，使得酸性水解酶充分發(fā)揮其生物學(xué)功能[16]。同時，溶酶體降解效率也影響著自噬的活性[17]。

2自噬與UPS的關(guān)系

UPS是真核細(xì)胞中另一個重要的降解體系，因與自噬有顯著的差異，在很長一段時間里，人們認(rèn)為兩者是獨立行使細(xì)胞質(zhì)控功能的；自噬的降解過程發(fā)生在自噬溶酶體這樣的囊泡樣結(jié)構(gòu)中，而UPS的酶促反應(yīng)則直接在胞質(zhì)中進(jìn)行；自噬的底物廣泛，UPS的底物則是嚴(yán)格的可溶性蛋白；自噬可以有選擇地進(jìn)行，也可以無選擇地進(jìn)行，而UPS則是具有嚴(yán)格選擇性的[18]。

2.1自噬與UPS活性相互影響當(dāng)UPS缺陷時，自噬活性會補償性地提高[19]，其原因可能是UPS缺陷時，某些Atg基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，或者是TOR等自噬負(fù)性調(diào)節(jié)因子受抑制[20-21]。自噬缺陷時，細(xì)胞泛素化蛋白則會增多，這一現(xiàn)象的一種解釋是自噬的泛素化蛋白底物堆積；但大多數(shù)學(xué)者傾向的另一種解釋是自噬活性下降后，自噬底物堆積，UPS接替自噬的質(zhì)控工作，泛素逐漸標(biāo)志堆積的自噬底物，但是由于自噬活性降低也會使細(xì)胞內(nèi)包括p62在內(nèi)的自噬相關(guān)泛素連接蛋白降解減少，逐漸增多的自噬相關(guān)泛素連接蛋白與其他UPS相關(guān)泛素連接蛋白(如p97)，競爭性結(jié)合泛素化蛋白，使得UPS途徑中斷，最終導(dǎo)致大量泛素化蛋白堆積[18,22-23]；類似的自噬相關(guān)泛素連接蛋白還有NBR1、組蛋白脫乙?；?和Alfy[12,24]。

2.2自噬與UPS的底物或成員相互影響①某一降解體系的底物是另一降解體系的“激動劑”或“抑制制”，如p53是UPS的降解底物，但同時又能通過TOR信號途徑上調(diào)或下調(diào)自噬活性[25-26]；②兩者的成員可互為彼此的降解底物，如泛素可被自噬和分子伴侶介導(dǎo)自噬降解[27]，蛋白酶體可被自噬降解[28]，這些互為底物的成員可能是兩種蛋白降解體系相互影響的關(guān)鍵所在。

3自噬常用分子生物學(xué)指標(biāo)

目前，研究自噬途徑常用的分子生物學(xué)指標(biāo)有LC3、Atg12-Atg5、TOR、p62、p53以及UPS相關(guān)標(biāo)志物(如多聚泛素、小泛素相關(guān)修飾蛋白等)，主要是從這些指標(biāo)的轉(zhuǎn)錄、翻譯水平間接反映自噬活性[29-30]。LC3-Ⅱ結(jié)合在自噬體膜上，是目前唯一的自噬體標(biāo)志蛋白，其蛋白水平與自噬體數(shù)量呈正比[31]。常用LC3-Ⅱ/LC3-I比值來提示自噬活性，類似的還有Atg12-Atg5蛋白或信使核糖核酸水平，但容易出現(xiàn)假陽性結(jié)果，究其原因如下：①自噬是一個動態(tài)的途徑，因此，該途徑通暢無阻且降解效率升高才能說明自噬活性提高，但LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值、Atg12-Atg5水平提高只能說明自噬體增多，而自噬體增多除了是因為自噬活性提高，也可能是由于自噬體與溶酶體結(jié)合障礙，或自噬溶酶體降解障礙引起；②脂溶性LC3-Ⅱ較水溶性LC3-Ⅰ的抗體結(jié)合力強，通過抗體結(jié)合的方法來反映兩者蛋白水平會出現(xiàn)誤差；③LC3-Ⅱ和Atg12-Atg5在自噬溶酶體形成后會被釋放回胞質(zhì)，細(xì)胞內(nèi)LC3-Ⅱ和Atg12-Atg5水平并不能準(zhǔn)確反映自噬體的數(shù)量或活性[32]。LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)化率、Atg12-Atg5水平與細(xì)胞種類、刺激類型有關(guān)，并不單單取決于自噬活性[30]。了解自噬的分子機制及自噬與UPS的關(guān)系后可知，TOR是自噬途徑的負(fù)性調(diào)控因子，其活性與自噬活性呈此消彼長的關(guān)系；p62作為自噬的底物，其蛋白水平下降可提示自噬活性的提高；p53可上調(diào)或下調(diào)自噬活性，通過其蛋白或信使核糖核酸水平對自噬活性進(jìn)行解讀應(yīng)密切結(jié)合其他指標(biāo)及檢測手段；UPS活性與自噬活性存在一定的互補性[19-21]，因此多聚泛素、小泛素相關(guān)蛋白的水平下降也可在一定程度上提示自噬活性的提高。值得一提的是，靜態(tài)觀察上述分子生物學(xué)指標(biāo)并不能準(zhǔn)確反映自噬活性的變化，除了電鏡下觀察自噬體數(shù)量及形態(tài)，還需結(jié)合LC3蛋白Turnover實驗、長壽蛋白降解率、LC3和其他選擇性自噬底物降解率等自噬潮分析，所得的結(jié)論更具有說服力[29]。

4小結(jié)

自1963年諾貝爾獎獲得者de Duve首次對“自噬”進(jìn)行定義以來，已經(jīng)過半個多世紀(jì)[33]。隨著科研技術(shù)的進(jìn)步，人們對自噬的了解也越來越深入，大部分學(xué)者認(rèn)為自噬具有雙面性。通過對自噬分子生物學(xué)指標(biāo)的正確解讀，有助于發(fā)現(xiàn)自噬在腫瘤、神經(jīng)退行性疾病等疾病不同時期的活性變化，進(jìn)而有針對性地通過增強或抑制自噬活性對疾病進(jìn)行干預(yù)，有望達(dá)到緩解或治愈疾病的目的。

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摘要：自噬是一種真核細(xì)胞自我降解、維持自穩(wěn)態(tài)的細(xì)胞途徑，在進(jìn)化過程中高度保守，主要負(fù)責(zé)降解長壽蛋白和損傷細(xì)胞器。近年來，關(guān)于自噬的研究較多，其中許多研究需要通過觀察自噬活性的變化來得出結(jié)論，因此準(zhǔn)確解釋自噬活性檢測結(jié)果十分重要。在眾多自噬活性檢測方法中，分子生物學(xué)檢測技術(shù)應(yīng)用較為廣泛，通過了解自噬的分子機制及其與泛素蛋白酶體系的關(guān)系，可以更好地利用自噬途徑常用分子生物學(xué)指標(biāo)來反映自噬活性變化。

關(guān)鍵詞：自噬；分子生物學(xué)指標(biāo)；分子機制；泛素蛋白酶體系

The Significance of Common Molecular Biomarkers of Autophay Pathway in Reflecting Autophagic ActivityPANMing-jiao1,WANGXiao-dan2,YULu3.(1.PostgraduateSchool,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515，China; 2.HealthCareDepartment,SouthWing,ChinesePLAGeneralHospital,Beijing100853,China; 3.DepartmentofNephrology，ChinesePLA305Hospital,Beijing100017,China)

Abtract:As a self-degradative cell pathway in eukaryotic cells,autophagy is evolutionarily conserved and mainly responsible for the degradation of long-lived proteins and damaged organelles.Autophagy is also conducive to maintaining the normal cellular homeostasis.The past decades have witnessed a remarkable progress of research on autophagy.A great number of studies obtain their conclusions through observing the change of autophagic activity,therefore it is important to correctly explain the results from the autophagy activity test.Among the test methods,the molecular biological methods are widely used,and through clarifying the molecular mechanisms of autophagy and the relationship between autophagy and ubiquitin proteasome system,we could make better use of the common molecular biomarkers to reflect the change of autophagic activity.

Key words:Autophagy; Molecular biomarkers; Molecular mechanisms; Ubiquitin proteasome system

收稿日期：2014-07-28修回日期：2014-09-10編輯：鄭雪

基金項目：國家自然科學(xué)基金(81370452)

中圖分類號：Q71
doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.05.006

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1006-2084(2015)05-0784-03