香加皮杠柳苷對(duì)肺癌A549細(xì)胞凋亡及Survivin表達(dá)的影響*

張靜，張超，楊光，單保恩，劉江惠

(河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院1.康復(fù)科；2.科研中心；3.放射科，石家莊 050011)

·藥物研究·

香加皮杠柳苷對(duì)肺癌A549細(xì)胞凋亡及Survivin表達(dá)的影響*

張靜1，張超2，楊光3，單保恩2，劉江惠2

(河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院1.康復(fù)科；2.科研中心；3.放射科，石家莊 050011)

目的 研究香加皮杠柳苷(CPP)對(duì)人肺癌A549細(xì)胞凋亡及survivin表達(dá)的影響，探討其抗腫瘤作用及作用機(jī)制。方法 采用噻唑藍(lán)(MTT)法檢測1.25，2.50，5.00，10.00，20.00 ng·mL-1CPP處理24，48，72 h對(duì)人肺癌A549細(xì)胞的抑制作用；應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)分析不同濃度CPP(2.50，5.00，10.00 ng·mL-1)分別作用于A549細(xì)胞6，12，24，48，72 h對(duì)細(xì)胞凋亡和凋亡率的影響；應(yīng)用吖啶橙/溴乙啶(AO/EB)熒光染色法和透射電鏡觀察CPP處理前后A549細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)及超微結(jié)構(gòu)變化；采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法檢測CPP作用后A549細(xì)胞中凋亡抑制基因survivin的mRNA表達(dá)情況；應(yīng)用Western blot檢測CPP對(duì)A549細(xì)胞survivin蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果 CPP能顯著抑制人肺癌A549細(xì)胞的生長，最大抑制率(93.46±2.35)%。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，CPP處理組可見典型的凋亡峰，與對(duì)照組比較，A549細(xì)胞的凋亡率明顯升高(P<0.05)。熒光顯微鏡下可見CPP處理組A549細(xì)胞呈橘紅色的凋亡細(xì)胞形態(tài)。透射電鏡下可見經(jīng)CPP處理的A549細(xì)胞體積變小，出現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)凝縮，核內(nèi)染色質(zhì)凝聚邊集于核膜，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，細(xì)胞質(zhì)空泡化等凋亡細(xì)胞的特征性超微結(jié)構(gòu)改變。RT-PCR結(jié)果顯示，經(jīng)CPP處理的A549細(xì)胞中survivin mRNA表達(dá)降低(P<0.05)，10.0 ng·mL-1CPP組survivin mRNA表達(dá)由對(duì)照組的(0.928±0.016)降至(0.251±0.012)；Western blot結(jié)果顯示CPP組細(xì)胞中survivin蛋白表達(dá)明顯減弱。結(jié)論 CPP可誘導(dǎo)人肺癌A549細(xì)胞發(fā)生凋亡，可通過下調(diào)survivin基因的mRNA和蛋白表達(dá)而發(fā)揮誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用。

香加皮杠柳苷；癌，肺，人；細(xì)胞凋亡；survivin表達(dá)

香加皮(CortexPeriplocae)為蘿藦科植物杠柳(PeriplocasepiumBge.)的干燥根皮，是我國的傳統(tǒng)中藥，主要用于祛風(fēng)濕，強(qiáng)筋骨[1]。近年來，本課題組研究者對(duì)中藥香加皮抗腫瘤作用進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)從中分離純化得到的單體化合物香加皮杠柳苷(periplocin fromCortexPeriplocae，CPP)具有明顯的抗腫瘤活性[2-3]。本實(shí)驗(yàn)在前期工作的基礎(chǔ)上，通過研究CPP對(duì)人肺癌A549細(xì)胞凋亡及其相關(guān)基因survivin表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討CPP誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的抗腫瘤分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥物與細(xì)胞株 CPP由華北制藥集團(tuán)新藥研究開發(fā)中心分離純化(含量≥99.8%)[4]。人肺癌A549細(xì)胞由河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院科研中心凍存，用含10% 胎牛血清(fetal calf serum，F(xiàn)CS)的RPMI-1640完全培養(yǎng)液，于37 ℃，5%二氧化碳(CO2)條件下，常規(guī)0.25% 胰蛋白酶消化傳代培養(yǎng)。

1.2 試劑 RPMI-1640培養(yǎng)液、反轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)酶混合物(批號(hào)：QPG-061)、Trizol Reagent(批號(hào)：15596018)為美國GIBCO公司產(chǎn)品；FCS為杭州四季青生物工程公司產(chǎn)品；胰蛋白酶(批號(hào)：T1426)、噻唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT，批號(hào)：M2128)、吖啶橙(acridine orange，AO，批號(hào)：A8120)、溴乙啶(ethidium bromide，EB，批號(hào)：E1385)、碘化丙啶(propidium iodide，PI，批號(hào)：P4170)為美國Sigma公司產(chǎn)品；DNA Ladder為華美生物工程公司產(chǎn)品；survivin及β-actin引物由上海生物工程公司合成；兔抗人survivin、β-actin多克隆抗體(批號(hào)：RAB0536，F(xiàn)K0097A)為美國Santa Cruz公司產(chǎn)品；RIPA裂解液、辣根過氧化物酶(horse radish peroxidase，HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗(批號(hào)：ZB-2301)、電致化學(xué)發(fā)光(electrochemiluminescence，ECL)試劑盒為北京中杉金橋生物有限公司產(chǎn)品。

1.3 主要儀器 TC2323 CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國SHELDON公司)，HT2酶標(biāo)儀(奧地利Anthos公司)，IX70倒置熒光顯微鏡(日本OLYMPUS公司)，H-7500透射電鏡(transmisson electron microscope，TEM，日本日立公司)，Epics-XLⅡ流式細(xì)胞儀(flow cytometry，F(xiàn)CM，美國Beckman Coulter公司)，定量PCR儀(美國ABI公司)，凝膠成像分析系統(tǒng)(美國Perkin-Elmer公司)。

1.4 MTT法檢測A549細(xì)胞的增殖情況 取對(duì)數(shù)生長期的A549細(xì)胞，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔細(xì)胞數(shù)約為1×104個(gè)。設(shè)對(duì)照組和1.25，2.50，5.00，10.00，20.00 ng·mL-1CPP實(shí)驗(yàn)組，每組設(shè)3個(gè)平行孔，置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱均分別培養(yǎng)24，48，72 h。實(shí)驗(yàn)終止前每孔加入5 mg·mL-1MTT 10 μL繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)液，每孔加入二甲亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)150 μL，待結(jié)晶溶解后用酶標(biāo)儀于波長570 nm測定吸光度(A)值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率(inhibitory rate，IR)。IR(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組平均A值/對(duì)照組平均A值)×100%。

1.5 FCM檢測細(xì)胞凋亡和凋亡率 分別取培養(yǎng)6，12，24，48，72 h的對(duì)照組和2.50，5.00，10.00 ng·mL-1CPP組A549細(xì)胞約1×106個(gè)，以70%預(yù)冷乙醇固定，PI染色，應(yīng)用流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡率，進(jìn)行細(xì)胞凋亡分析。

1.6 熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡形態(tài) 采用AO/EB熒光雙染法，分別取對(duì)照組和經(jīng)5.00 ng·mL-1CPP作用48 h的A549細(xì)胞約1×105個(gè)，用0.25%胰蛋白酶消化收集，將細(xì)胞懸液100 μL，加入100 μg·mL-1AO/EB混合熒光染色液4 μL混勻，取1滴立即置熒光顯微鏡下觀察CPP處理前后A549細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化。

1.7 TEM 觀察細(xì)胞凋亡的超微結(jié)構(gòu) 收集對(duì)照組和經(jīng)5.00 ng·mL-1CPP作用48 h的A549細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution，PBS)洗滌、離心，2.5%戊二醛固定，1%鋨酸后固定，經(jīng)脫水、包埋、切片，鈾鉛雙重染色后，采用透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化。

1.8 RT-PCR檢測survivin基因mRNA表達(dá) 取對(duì)照組和2.50，5.00，10.00 ng·mL-1CPP組作用48 h 的A549細(xì)胞，用Trizol提取液提取各組細(xì)胞總RNA。按RT-PCR酶混合物試劑盒說明進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以β-actin為內(nèi)參照，每批PCR均設(shè)空白對(duì)照，反應(yīng)35個(gè)循環(huán)。survivin及β-actin基因的引物序列為[5-6]：survivin上游5′-AGCCCTTTCTCAAGGACCAC-3′，下游5′-GCACTTTCTTCGCAGTTTCC-3′，擴(kuò)增片段大小為363 bp；β-actin上游5′-CGCTGCGCTGGTCGTCGACA-3′，β-actin下游5′-GTCACGCACGATTTCCCGCT-3′，擴(kuò)增片段大小為619 bp。將RT-PCR產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳，應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)Gel-pro軟件分析條帶的灰度值，對(duì)survivin mRNA表達(dá)水平進(jìn)行半定量分析。

1.9 Western blot檢測survivin蛋白的表達(dá) 分別收集對(duì)照組及經(jīng)2.50，5.00，10.00 ng·mL-1CPP處理的A549細(xì)胞，用RIPA裂解液提取各組細(xì)胞總蛋白，BCA法蛋白定量，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrop-horesis，SDS-PAGE)1.5 h，將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，封閉過夜，加入兔抗人survivin和β-actin抗體封閉2 h，洗膜30 min，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗封閉1 h，洗滌后加入ECL顯影，通過凝膠成像系統(tǒng)攝像分析。

2 結(jié)果

2.1 CPP對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響 MTT結(jié)果顯示，1.25，2.50，5.00，10.00，20.00 ng·mL-1CPP組的A549細(xì)胞，在作用24，48，72 h后，細(xì)胞增殖均受到不同程度抑制，與對(duì)照組比較，細(xì)胞增殖抑制率顯著增高(P<0.05)。CPP對(duì)A549細(xì)胞的增殖抑制作用隨藥物濃度增加和作用時(shí)間延長而增強(qiáng)，抑制率最高達(dá)(93.46±2.35)%，見圖1。

2.2 細(xì)胞凋亡的FCM檢測結(jié)果 經(jīng)過2.50，5.00，10.00 ng·mL-1CPP作用48 h后A549細(xì)胞可見典型的凋亡峰，隨藥物濃度增加峰值增高(圖2)。3個(gè)濃度的CPP處理組A549細(xì)胞的凋亡率明顯增高，并隨藥物濃度增加和作用時(shí)間延長呈升高趨勢(shì)，與對(duì)照組比較，作用48 h和72 h的CPP各濃度組細(xì)胞凋亡率均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

Fig.1 Effects of CPP at different concentration on the proliferations of A549 cells(n=3)

2.3 細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化 熒光顯微鏡下觀察AO/EB染色細(xì)胞，對(duì)照組A549細(xì)胞呈正常活細(xì)胞形態(tài)，大小正常，形態(tài)規(guī)則，細(xì)胞質(zhì)呈綠色，細(xì)胞核為亮綠色。CPP處理組A549細(xì)胞呈橘紅色，體積縮小，圓形固縮，為典型的凋亡細(xì)胞形態(tài)(圖3)。

表1 CPP對(duì)A549細(xì)胞凋亡率的影響

與對(duì)照組比較，t12 h=-17.208,t24 h=-9.642,-8.707；t48 h=-7.999,-10.346,-17.353；t72 h=-13.675,-16.179,-25.615,*1P<0.05

Compared with control group，t12 h=-17.208,t24 h=-9.642,-8.707；t48 h=-7.999,-10.346,-17.353；t72 h=-13.675,-16.179,-25.615,*1P<0.05

圖3 CPP誘導(dǎo)A549 細(xì)胞凋亡的AO/EB染色結(jié)果(×400)

A.Control group；B.CPP group

Fig.3 AO/EB staining on A549 cell apoptosis induced by CPP(×400)

2.4 細(xì)胞凋亡的超微結(jié)構(gòu)改變 TEM下觀察可見，對(duì)照組A549細(xì)胞形態(tài)大小規(guī)則，染色質(zhì)均勻分布，細(xì)胞器形態(tài)結(jié)構(gòu)正常。經(jīng)CPP處理后的A549細(xì)胞，呈典型的凋亡細(xì)胞形態(tài)，表現(xiàn)為體積變小，胞膜表面微絨毛減少，細(xì)胞質(zhì)凝縮，核內(nèi)染色質(zhì)凝聚邊集于核膜，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，細(xì)胞質(zhì)空泡化等特征性超微結(jié)構(gòu)改變(圖4)。結(jié)果提示，CPP可誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡。

圖4 透射電鏡下A549細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)變化(×4 000)

A.Control group；B.CPP group

Fig.4 Ultrastructure changes of A549 cells observed by transmission electron microscope(×4 000)

2.5 CPP對(duì)survivin基因mRNA表達(dá)的影響 RT-PCR檢測結(jié)果顯示，不加RNA的空白對(duì)照無任何條帶，而對(duì)照組和CPP各處理組(2.50，5.00，10.00 ng·mL-1)可見特異性擴(kuò)增條帶，與標(biāo)準(zhǔn)DNA ladder比較，分別為內(nèi)參照β-actin和survivin，經(jīng)CPP作用48 h后，A549細(xì)胞survivin mRNA的表達(dá)量明顯減低，隨藥物濃度增加變化更明顯(圖5)。半定量結(jié)果顯示，對(duì)照組survivin mRNA的表達(dá)量(0.928±0.016)，10.0 ng·mL-1CPP組降至(0.251±0.012)，各濃度組與對(duì)照組相比其mRNA表達(dá)均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)(圖6)。提示CPP可使凋亡抑制基因survivin的mRNA表達(dá)水平下降。

2.6 CPP對(duì)survivin基因蛋白表達(dá)的影響 Western blot結(jié)果顯示，通過灰度分值比較，與對(duì)照組比較，CPP組A549細(xì)胞中 survivin蛋白表達(dá)均明顯減弱(圖7)。提示CPP可下調(diào)survivin基因的蛋白表達(dá)水平。

M.100 bp DNA ladder；A.對(duì)照組；B.2.50 ng·mL-1CPP組；C.5.00 ng·mL-1CPP組；D.10.00 ng·mL-1CPP組；E.空白對(duì)照組

圖5 CPP對(duì)survivin基因 mRNA表達(dá)的影響

M.100 bp DNA ladder；A.Control group；B.2.50 ng·mL-1CPP group；C.5.00 ng·mL-1CPP group；D.10.00 ng·mL-1CPP group；E.Blank control group

Fig.5 Effects of CPP on mRNA expression of survivin

A.對(duì)照組；B.2.50 ng·mL-1CPP組；C.5.00 ng·mL-1CPP組；D.10.00 ng·mL-1CPP組；與對(duì)照組比較，*1P<0.05

圖6 CPP作用A549細(xì)胞前后survivin mRNA相對(duì)表達(dá)量分析

A.Control group；B.2.50 ng·mL-1CPP group；C.5.00 ng·mL-1CPP group；D.10.00 ng·mL-1CPP group；Compared with control group，*1P<0.05

Fig.6 Relative mRNA expression of survivin in A549 cells before and after CPP treatment

A.對(duì)照組；B.2.50 ng·mL-1CPP組；C.5.00 ng·mL-1CPP組；D.10.00 ng·mL-1CPP組

圖7 不同濃度CPP對(duì)survivin蛋白表達(dá)的影響

A.Control group；B.2.50 ng·mL-1CPP group；C.5.00 ng·mL-1CPP group；D.10.00 ng·mL-1CPP group

Fig.7 Effects of CPP at different concentration on protein expression of survivin

3 討論

我國是世界上肺癌患者最多的國家，過去30年間，我國肺癌病死率上升46.8%，成為上升速度最快的癌癥，預(yù)計(jì)到2025年，我國每年死于肺癌的人數(shù)將近100萬人[7-8]。 然而，目前尚缺乏療效強(qiáng)、不良反應(yīng)小的抗腫瘤藥物，有關(guān)研究仍是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域關(guān)注的熱點(diǎn)。

我國是世界上最大的藥材生產(chǎn)國，以其傳統(tǒng)中草藥的理論和數(shù)千年臨床實(shí)踐的積累，有著巨大開發(fā)潛力和明顯的優(yōu)勢(shì)[9]。作者通過對(duì)大量中草藥的抗腫瘤活性篩選，發(fā)現(xiàn)中藥香加皮(CortexPeriplocae)具有明顯的抗腫瘤作用，并從中分離純化出單體化合物CPP。本實(shí)驗(yàn)通過研究CPP對(duì)人肺癌A549細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用和凋亡相關(guān)基因survivin的表達(dá)情況，探討CPP的抗腫瘤機(jī)制。

細(xì)胞凋亡在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演著關(guān)鍵的角色，也是藥物發(fā)揮抗腫瘤作用的重要機(jī)制之一[10-11]。作者在增殖抑制實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，香加皮杠柳苷(CPP)能顯著抑制人肺癌A549細(xì)胞的生長。FCM結(jié)果顯示，2.50，5.00，10.00 ng·mL-1CPP組A549細(xì)胞可見凋亡峰，細(xì)胞凋亡率也明顯增高。提示CPP可誘導(dǎo)人肺癌A549細(xì)胞凋亡。

凋亡細(xì)胞具有特征性的形態(tài)學(xué)改變，本研究應(yīng)用熒光染色和透射電鏡檢測細(xì)胞形態(tài)發(fā)現(xiàn)，CPP處理后的A549細(xì)胞出現(xiàn)典型的凋亡細(xì)胞形態(tài)。熒光染色可見正常活細(xì)胞呈均勻分布的綠色熒光，而凋亡細(xì)胞呈橘紅色熒光。透射電鏡可見凋亡細(xì)胞等超微結(jié)構(gòu)改變。進(jìn)一步表明CPP能誘導(dǎo)人肺癌A549細(xì)胞發(fā)生凋亡。

細(xì)胞凋亡相關(guān)基因survivin是凋亡蛋白抑制因子(inhibitor of apoptosis proteins，IAP)家族的成員[12-13]，具有抑制細(xì)胞凋亡和調(diào)節(jié)細(xì)胞有絲分裂的雙重功能，是至今發(fā)現(xiàn)最強(qiáng)的凋亡抑制因子[14]。由于survivin的抗凋亡特性及其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的重要作用，使其成為抗癌治療的理想靶點(diǎn)[15-16]。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用RT-PCR和Western blot方法，從mRNA和蛋白水平檢測CPP對(duì)A549細(xì)胞中survivin表達(dá)的影響，結(jié)果顯示，CPP組A549細(xì)胞中survivin的mRNA和蛋白表達(dá)均明顯減弱。提示CPP誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡可能與survivin基因的表達(dá)下調(diào)有關(guān)。

以上研究結(jié)果從細(xì)胞凋亡率、形態(tài)學(xué)觀察以及凋亡抑制基因survivin的檢測等角度，初步揭示CPP對(duì)人肺癌A549細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用，survivin可能是CPP抗腫瘤作用機(jī)制中的靶分子之一，有待進(jìn)一步深入研究。

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DOI 10.3870/yydb.2015.06.001

Effects of Periplocin from Cortex Periplocae on Apoptosis of Human Lung Cancer A549 Cells and Expression of Survivin

ZHANG Jing1, ZHANG Chao2, YANG Guang3, SHAN Baoen2, LIU Jianghui2

(1.DepartmentofRehabilitation； 2.ScientificResearchCenter； 3.DepartmentofRadiology,theFourthHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050011,China)

Objective To investigate the effects of periplocin fromCortexPeriplocae(CPP) on apoptosis of human lung cancer A549 cells and expression of survivin, and demonstrate its anti-tumor effect and the possible mechanism. Methods Inhibitory effect of CPP at different concentrations (1.25, 2.50, 5.00, 10.00, 20.00 ng·mL-1) and for different time length (24, 48, 72 h) on A549 cell proliferation was tested by MTT method.Apoptosis rate of A549 cells treated with CPP at different concentrations (2.50, 5.00, 10.00 ng·mL-1) were measured using flow cytometry (FCM) for 6, 12, 24, 48, 72 h, respectively.The morphological and ultrastructural changes of the apoptosis cells were observed by acridine orange/ethidium bromide (AO/EB) staining and transmission electron microscopy (TEM).The effects of CPP on mRNA and protein expression of apoptosis associated gene survivin were assessed by RT-PCR and Western blotting. Results CPP could significantly inhibit the growth of A549, and the inhibition rate reached (93.46±2.35)%.The results of FCM showed that the apoptosis rate of A549 cells treated with CPP was increased significantly as compared to the control group (P<0.05).Meanwhile, typical apoptotic peaks were detected.The characteristic morphological changes of apoptosis were observed in A549 exposed to CPP, including cell shrinkage, the nuclei became yellow-red by AO/EB staining, and typical ultrastructural changes, including nuclear chromatin condensation along the nuclear membrane, vacuolar degeneration of cytoplasm observed by TEM.The result of RT-PCR indicated that survivin mRNA expression decreased obviously in A549 cells exposed to CPP.The protein expression of survivin in A549 cells treated with 10.0 ng·mL-1CPP(0.251±0.012)was weaker than that in control group(0.928±0.016). Conclusion CPP can induce apoptosis in human lung cancer cell lines A549, and the probable mechanism is related to the down-regulation of survivin mRNA and protein.

Periplocin fromCortexPeriplocae； Cancer, lung, human； Cell apoptosis; Expression of survivin

2014-06-04

2014-07-24

*國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30772752)

張靜(1971-)，女，河北正定人，主任醫(yī)師，博士，主要研究方向：抗腫瘤研究。電話：0311-86095595，E-mail：zjingzher@163.com。

R730.5；R285.5；R734.2

A

1004-0781(2015)06-0705-06