腸益煎對(duì)裸鼠結(jié)腸癌移植瘤抑瘤作用的實(shí)驗(yàn)研究

吳婷婷,王燕瑩,鐘 薏,張士強(qiáng),曹晟丞,張海盛

(1. 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬上海市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院,上海 200080；2. 山東省淄博市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，山東 淄博 255000；3. 上海市松江區(qū)方塔中醫(yī)醫(yī)院，上海 201600)

腸益煎對(duì)裸鼠結(jié)腸癌移植瘤抑瘤作用的實(shí)驗(yàn)研究

吳婷婷1,王燕瑩2,鐘 薏1,張士強(qiáng)1,曹晟丞3,張海盛3

(1. 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬上海市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院,上海 200080；2. 山東省淄博市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，山東 淄博 255000；3. 上海市松江區(qū)方塔中醫(yī)醫(yī)院，上海 201600)

目的 探究腸益煎對(duì)移植性結(jié)腸癌裸鼠腫瘤的抑制作用。方法 將接種人結(jié)腸癌LOVO細(xì)胞懸液于裸鼠皮下成功制備的裸鼠移植性結(jié)腸癌模型60只隨機(jī)分為模型組(A組)、腸益煎組(B組)、5-氟尿嘧啶組(C組)、5-氟尿嘧啶+奧沙利鉑組(D組)、腸益煎+5-氟尿嘧啶組(E組)、腸益煎+5-氟尿嘧啶+奧沙利鉑組(F組)，每組10只，模擬臨床給藥。A組給予生理鹽水20 mL/(kg·d)灌胃；其他組中腸益煎采用水煎劑12.5 g/(kg·d)灌胃，均每天1次，共14 d；5-氟尿嘧啶及奧沙利鉑采用腹腔注射，隔天1次，共5次。療程中觀察并記錄裸鼠體質(zhì)量。療程結(jié)束后 處死裸鼠，采集標(biāo)本，記錄瘤質(zhì)量，計(jì)算腫瘤指數(shù)和抑瘤率。結(jié)果 裸鼠去瘤后質(zhì)量B、C、D、E、F組均顯著高于A組(P均<0.05)，D、E、F組均顯著高于B、C組(P均<0.05)，D、E、F組間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；C、D、E、F組裸鼠瘤質(zhì)量、腫瘤指數(shù)明顯低于A、B組(P均<0.05)，D、F組明顯低于C組(P均<0.05)。C、D、E、F組抑瘤率均明顯高于B組(P均<0.05),D、F組明顯高于C組(P均<0.05)。結(jié)論 中藥復(fù)方腸益煎可以穩(wěn)定患瘤裸鼠體質(zhì)量，有一定的抑制腫瘤瘤體生長(zhǎng)作用，聯(lián)合化療藥物5-氟尿嘧啶、奧沙利鉑抑瘤效果更佳。

腸益煎;腸癌;腫瘤指數(shù);抑瘤率;裸鼠

大腸癌是世界第4位的惡性腫瘤[1]，目前主要治療方式為手術(shù)切除，而手術(shù)后的高復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率一直是近年來大腸癌治療的瓶頸，故降低術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移非常重要。5-氟尿嘧啶和奧沙利鉑是大腸癌根治術(shù)后廣泛應(yīng)用的化療藥物，而中藥復(fù)方具有降低化療的毒副反應(yīng)、影響細(xì)胞周期、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤血管生成、改善免疫功能、多靶點(diǎn)綜合治療等作用。本實(shí)驗(yàn)建立人結(jié)腸癌LOVO細(xì)胞的皮下移植瘤模型，旨在觀察中藥腸益煎及腸益煎聯(lián)用化療藥物對(duì)腫瘤的抑制作用，為其臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)資料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 4～5周齡BALB/c雌性裸鼠60只，體質(zhì)量20～24 g，由中科院上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，于無特定病原體(SPF)環(huán)境飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(滬)2009-0069。

1.2 腫瘤細(xì)胞株 人結(jié)腸癌細(xì)胞LOVO細(xì)胞，由上海中科院提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)藥物 中藥復(fù)方腸益煎由黨參、茯苓、白術(shù)、土茯苓、菝葜、八月札、雞內(nèi)金、陳皮等組成，由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院中藥房提供。1640培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素、鏈霉素、胰蛋白酶、HEPES(GIBCO)；DAB 、EDTA(Sigma)；MTT試劑盒(碧云天生物科技有限公司)。5-氟尿嘧啶注射液(5-Fu,上海旭東海普藥業(yè)有限公司,批號(hào)：FA120912，規(guī)格：250 mg/支)。奧沙利鉑注射液(L-OHP，江蘇恒瑞藥業(yè)有限公司，批號(hào)：11112711，規(guī)格：250 mg/支)。

1.4 儀器 超凈工作臺(tái)(Bio-Hazard型，造鑫企業(yè)有限公司)；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(B5060EK/CO2，德國(guó)Heraeus)；倒置顯微鏡(上海光學(xué)儀器廠)；4 ℃冰箱(得貝FF40，青島電冰箱廠)；低溫冰箱(MDF-292，SANYO CO。)；高壓蒸氣消毒器(上海醫(yī)用核子儀器廠)；電子分析天平(上海天平儀器廠)。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 裸鼠移植瘤模型的建立 人結(jié)腸癌LOVO細(xì)胞，使用含10%胎牛血清、100 IU/mL青霉素和100 IU/mL鏈霉素的1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)于37 ℃含5%CO2培養(yǎng)箱中，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，至70%～80%融合時(shí)采用0.25%胰蛋白酶、0.02%EDTA液消化傳代，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1.25×1010L-1，每只裸鼠皮膚消毒后以1 mL注射器于左下肢皮下注射0.2 mL細(xì)胞懸液，接種細(xì)胞2×106個(gè)/只，共60只。

1.5.2 分組與干預(yù)方法 待移植瘤平均直徑約5 mm后(細(xì)胞種植后第16天)，將全部裸鼠以隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組(A組)、腸益煎組(B組)、5-氟尿嘧啶組(C組)、5-氟尿嘧啶+奧沙利鉑組(D組)、腸益煎+5-氟尿嘧啶組(E組)、腸益煎+5-氟尿嘧啶+奧沙利鉑組(F組)，每組10只。腸益煎采用水煎劑12.5 g/(kg·d)灌注，共14 d；5-氟尿嘧啶及奧沙利鉑劑量參照成人體表面積換算，藥物劑量換算公式：dB=dA×(RB/RA) ×(WA/WB)1/3，采用腹腔注射，隔天1次，共5次。A組給予等量的生理鹽水灌胃14 d，0.2 mL/10 g。第16天處死裸鼠。

1.6 檢測(cè)指標(biāo) 給藥前及給藥后第5天、第9天、第13天觀察并記錄裸鼠體質(zhì)量。第16天處死裸鼠，采集標(biāo)本，記錄瘤質(zhì)量，計(jì)算腫瘤指數(shù)(腫瘤指數(shù)=瘤質(zhì)量/去瘤后鼠質(zhì)量)、抑瘤率。抑瘤率(%)=(1-治療組平均瘤質(zhì)量/模型組平均瘤質(zhì)量)×100%。

2 結(jié) 果

2.1 各組體質(zhì)量比較 裸鼠去瘤后，B、C、D、E、F組體質(zhì)量均顯著高于A組(P均<0.05)，D、E、F組顯著高于B、C組(P均<0.05)。給藥第5天，D、E、F組體質(zhì)量顯著高于A組(P均<0.05)，B、C組顯著高于D組(P均<0.05)；第9天，D、E、F組明顯高于A、B組(P均<0.05)，D組高于C組(P<0.05)；第13天，D、E、F組明顯高于A、C組(P均<0.05)，D組高于B組(P<0.05)。見表1。

表1 各組裸鼠體質(zhì)量、去瘤后體質(zhì)量比較

注：①與A組比較，P<0.05；②與B相比較，P<0.05；③與C組比較，P<0.05。

2.2 各組瘤質(zhì)量、腫瘤指數(shù)及抑瘤率比較 C、D、E、F組裸鼠瘤質(zhì)量、腫瘤指數(shù)均明顯低于與A、B組(P均<0.01)；D、F組明顯低于C組(P均<0.05)。C、D、E、F組抑瘤率均明顯高于B組(P均>0.05),D、F組明顯高于C組(P均<0.05)。見表2。

注：①與A組比較，P<0.05;②與B組比較，P<0.05;③與C組比較，P<0.05。

3 討 論

隨著人民生活水平的提高，結(jié)直腸癌的發(fā)病率正在大幅提高。目前，手術(shù)切除為大腸癌的根治性治療措施，但50%大腸癌患者于手術(shù)根治后2年內(nèi)可出現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移[2]，術(shù)后3年復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率高達(dá)95%[3]，這成為影響腸癌患者術(shù)后生存率的至關(guān)重要的因素。

歷代醫(yī)家就腸癌病機(jī)和治療多有闡發(fā)，《靈樞·五變》云：“人之善病腸中積聚者……皮膚薄而不澤，肉不堅(jiān)而淖澤，如此則腸胃惡，惡則邪氣留止，積聚乃傷?！蹦c癌術(shù)后，患者正氣已虛，脾失健運(yùn)，水谷不化，氣血乏源，濕濁壅滯，久而化熱，濕熱內(nèi)蘊(yùn)。中醫(yī)中藥治療以扶正為本，兼施以清熱化濕。中藥復(fù)方是以中醫(yī)藥理論為基礎(chǔ)，采用君臣佐使的復(fù)方配伍法則及靈活多樣的炮制方法，具有毒副作用小、綜合調(diào)節(jié)人體陰陽平衡等特點(diǎn)，能通過多靶點(diǎn)發(fā)揮抗腫瘤作用，逐漸為學(xué)界和大眾所認(rèn)可。楊靜[4]使用健脾導(dǎo)滯法(黨參、蒼術(shù)、白術(shù)、豬苓、茯苓、薏苡仁、枳實(shí)、厚樸、黃柏、紅藤、敗醬草、虎杖、白花蛇舌草、炒谷芽、炒麥芽)聯(lián)合化療治療晚期腸癌，發(fā)現(xiàn)中藥聯(lián)合化療能改善患者癥狀、體力情況，提高患者的生活質(zhì)量及免疫功能，減少患者感染的機(jī)會(huì)。張青等[5]將120例晚期大腸癌患者隨機(jī)分成治療組60例和對(duì)照組60例，治療組采用固本消瘤膠囊聯(lián)合FOLFOX4方案治療，對(duì)照組僅采用FOLFOX4方案化療，治療4個(gè)周期后治療組的臨床受益率和1年生存率均明顯高于對(duì)照組。蔣益蘭等[6]研究發(fā)現(xiàn)健脾消癌飲(黨參、白術(shù)、茯苓、黃芪、靈芝、薏苡仁、仙靈脾、丹參、白花蛇舌草、七葉一枝花、半枝蓮、石見穿、莪術(shù)、法夏、廣木香、炒枳殼)配合化療能降低大腸癌術(shù)后的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，延長(zhǎng)生存期?？梢?，中醫(yī)中藥配合化療已成為大腸癌術(shù)后重要的治療方式。

腸益煎以益氣健脾、清熱化濕為治療原則，組方嚴(yán)謹(jǐn)、科學(xué)、合理，符合中醫(yī)理論。方中取四君子湯益氣健脾；土茯苓、菝葜清熱化濕；八月扎、陳皮、雞內(nèi)金理氣健脾。各藥物在作用上相輔相成，具有協(xié)同作用，共奏健脾益氣、扶正解毒之功。多聯(lián)合化療，可降低結(jié)直腸癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)率，改善患者術(shù)后生存質(zhì)量[7]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)中藥復(fù)方腸益煎可以穩(wěn)定患瘤裸鼠體質(zhì)量，聯(lián)合化療藥物5-氟尿嘧啶、奧沙利鉑能夠增加抑制腫瘤瘤體生長(zhǎng)之效，發(fā)揮抑瘤作用，具體分子機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

[1] 全國(guó)腫瘤防治研究辦公室,全國(guó)腫瘤登記中心,衛(wèi)生部疾病預(yù)防控制局. 中國(guó)部分市、縣惡性腫瘤的發(fā)病與死亡(第3 卷)[M]. 北京: 人民衛(wèi)生出版社,2007

[2] 孫燕. 內(nèi)科腫瘤學(xué)[M]. 北京：人民衛(wèi)生出版社,2001：623-624

[3] Park YJ，Park KJ，Park JG,et al. Prognosis factor in 2230 Korean colorectal cancer patients:analysis of consecutively operated cases[J]. World J Surg,1999,23(7):721-726

[4] 楊靜. 健脾導(dǎo)滯法聯(lián)合化療治療晚期腸癌臨床觀察[J]. 實(shí)用中醫(yī)內(nèi)科雜志，2008,22(8):30-31

[5] 張青,王笑民,楊國(guó)旺,等. 固本消瘤膠囊聯(lián)合 FOLFOX4化療方案治療晚期大腸癌的臨床研究[J]. 北京中醫(yī)藥,2010,29(4):255-257

[6] 蔣益蘭,潘敏求,蔡美. 健脾消癌飲配合化療拮抗大腸癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移62例總結(jié)[J]. 湖南中醫(yī)雜志，2007,23(1):1-3

[7] 王文海，周榮耀. 腸益煎治療大腸癌術(shù)后50例臨床觀察[J]. 浙江中西醫(yī)結(jié)合雜志，2000，10(6)：325-326

Experimental study on anti tumor effect of Changyi Decoction on nude mice with transplanted colorectal cancer

WU Tingting1, WANG Yanying2, ZHONG Yi1, ZHANG Shiqiang1, CAO Shengcheng3, ZHANG Haisheng3

(1.Shanghai TCM-Integrated Hospital, Shanghai University of TCM, Shanghai 200082; 2.Zibo Hospital of Integrated Chinese and Western Medicine, Zibo 255000, Shandong, China; 3.Fangta TCM Hospital of Songjiang District, Shanghai 201600, China)

Objective It is to investigate the anti rumor effect of Changyi Decoction on nude mice with transplanted colorectal cancer (CRC). Methods 60 nude mice with inoculation by transplant Colorectal Carcinoma LOVO cell suspension under their skin were randomly divided into 6 groups as model control group (Group A), Changyi Decoction group (Group B), 5-Fluorouracil group (Group C), 5-Fluorouracil+Oxaliplatin group (Group D), Changyi Decoction+5-Fluorouracil group (Group E) and Changyi Decoction+5-Fluorouracil+Oxaliplatin group (Group F), 10 mice in each group. Simulating the clinic, the mice were treated with normal saline (NS) in Group A, Changyi Decoction in Group B, 5-Fluorouracil (5-Fu) in Group C, 5-Fluorouracil and Oxaliplatin (L-OHP) in Group D, Changyi Decoction and 5-Fu in Group E, Changyi Decoction, 5-Fu and L-OHP in Group F. NS and Changyi Decoction were given by gavage once a day for 14 days with NS 20 mL/(kg·d) and Changyi Decoction 12.5 g/(kg·d). 5-Fu and L-OHP were given every other day by intraperitoneal injection for 5 times. In the course, mice weights were recorded. After treatment, the tumor weight was measured and tumor growth and inhibition rate were calculated. Results Mice weight after tumor removing of Group B, C, D, E and F were all markedly higher than that of Group A (allP<0.05), and which in Group D, E, F were higher markedly than those in Group B and C (allP<0.05), there was no significant difference among Group D, E and F (P>0.05). The tumor weight and tumor growth rate of Group C, D, E and F were lower markedly than those of Group A and B (allP<0.05), and which of Group D and F were higher markedly than that of Group C (P<0.05). The tumor inhibition?rate of Group B, C, D, E and F were higher markedly than that of Group B (allP<0.05), and which of Group D and F were higher markedly than that of Group C (allP<0.05). Conclusion Changyi Decoction can keep the weight of mice with CRC. It has some effect on tumor growth inhibition, and more effect to combine with chemotherapeutics such as 5-Fu and L-OHP.

Changyi Decoction; colorectal cancer; tumor growth rate; tumor inhibition rate; nude mice

吳婷婷，女，醫(yī)學(xué)碩士在讀，從事中醫(yī)治療惡性腫瘤相關(guān)研究。

鐘薏，E-mail:zhongzixian2000@163.com

上海市教委創(chuàng)新項(xiàng)目(12ZZ123)

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.12.005

R-332

A

1008-8849(2015)12-1267-03

2014-11-05