維藥肉豆蔻提取物對人結(jié)腸癌HCT-116細胞的抑制作用

范 磊，鄧皖利，，張洪平，呂書勤，

(1． 新疆醫(yī)科大學(xué)，新疆 烏魯木齊 830000；2． 新疆醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830000)

維藥肉豆蔻提取物對人結(jié)腸癌HCT-116細胞的抑制作用

范 磊1，鄧皖利1，2，張洪平2，呂書勤1，2

(1． 新疆醫(yī)科大學(xué)，新疆 烏魯木齊 830000；2． 新疆醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830000)

目的 探討維吾爾藥材肉豆蔻乙酸乙酯提取物對人結(jié)腸癌HCT-116細胞的生長及侵襲轉(zhuǎn)移的影響。方法 取對數(shù)生長期人結(jié)腸癌HCT-116細胞，實驗分為6組,除對照組外,A、B、C、D、E組分別給予31．25，62．5，125，250，500g/L肉豆蔻乙酸乙酯提取物干預(yù)。MTT法檢測HCT-116細胞增殖情況,流式細胞儀分析HCT-116細胞凋亡情況和細胞周期變化,酶聯(lián)免疫吸附法檢測HCT-116細胞分泌上皮性鈣黏附蛋白(E-cadherin)、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)、MMP-9情況。結(jié)果 與對照組比較，肉豆蔻乙酸乙酯提取物對人結(jié)腸癌HCT116細胞的生長具有顯著抑制作用，且隨肉豆蔻乙酸乙酯提取物濃度的增加,細胞凋亡率逐漸升高；與對照組比較，肉豆蔻乙酸乙酯提取物各組G0/G1期的細胞比例明顯增加，G2/M期的細胞比例明顯減少,E-cadherin表達水平明顯上調(diào)，MMP-2及MMP-2表達水平明顯降低。結(jié)論肉豆蔻乙酸乙酯提取物能顯著抑制人結(jié)腸癌HCT-116細胞的增殖，促進細胞凋亡，且呈劑量依賴性。該藥通過上調(diào)E-cadherin、下調(diào)MMP-2及MMP-9的表達起到抗侵襲轉(zhuǎn)移作用。

肉豆蔻；HCT-116細胞；細胞凋亡；E-cadherin；MMP-2；MMP-9

結(jié)腸癌是常見的嚴重威脅人類健康的腫瘤之一,其發(fā)病率和病死率呈逐年上升趨勢，在我國位于惡性腫瘤和致死因素的第4位[1]，且發(fā)達地區(qū)的腸癌發(fā)病率呈上升態(tài)勢[2]。盡管近年來以手術(shù)治療為主的綜合治療使腸癌患者的預(yù)后有所改善，但術(shù)后5 年生存率仍在50%～60%。惡性腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移是患者術(shù)后死亡的主要原因。因此，闡明腸癌浸潤和轉(zhuǎn)移相關(guān)的機制，從而指導(dǎo)臨床治療方案的選擇，可減少術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移,提高術(shù)后生存率。長期的臨床實踐發(fā)現(xiàn)，中藥對于結(jié)腸癌的治療，尤其是抗復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移方面具有顯著療效[3]。本研究探討了維藥肉豆蔻乙酸乙酯提取物對人結(jié)腸癌HCT-116細胞的抑制作用以及對上皮性鈣黏附蛋白(E-cadherin)、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)、MMP-9的調(diào)控作用，旨在明確維藥肉豆蔻抗腫瘤的作用靶點，為其在臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 實驗資料

1.1細胞及藥材 人結(jié)腸癌HCT-116細胞(上海中科院細胞研究所)，肉豆蔻(新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)院,經(jīng)李永和主任藥師鑒定為肉豆蔻科植物肉豆蔻的干燥成熟種仁)。

1.2 實驗儀器 超凈工作臺(中國上海智誠zHJH-C1112B)，5804R高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司)，酶標儀(美國Thermo公司)，流式細胞儀(美國MILLPORE公司GUAVAEASYCYTE 8HT)，二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)，5 mL移液管、10mL移液管、100mm細胞培養(yǎng)皿、6孔板、96孔細胞培養(yǎng)板(美國cosTAR公司)，移液器(德國eppendorf公司)。

1.3 實驗試劑 RPMIl640培養(yǎng)基(美國Gibco公司)，PBS(美國Hyclone公司)，胎牛血清(美國Hyclone公司)，青鏈霉素混合液(美國Hyclone公司)，0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液(北京solarbio公司)，75%乙醇(分析級，天津市富宇精細化工有限公司)，四甲基偶氮唑鹽MTT(Sigma公司)，PE Annexin V/7-ADD(美國BD Biosciences公司)，PI/RNase(美國BD Biosciences公司)，ELISA試劑盒(日本IBL公司)。

1.4 方法 實驗分為6組：HCT-116細胞+等量空白培養(yǎng)基組為對照組,HCT-116細胞+31.25 g/L肉豆蔻乙酸乙酯提取物組為A組,HCT-116細胞+62.5 g/L肉豆蔻乙酸乙酯提取物組組為B組,HCT-116細胞+125 g/L肉豆蔻乙酸乙酯提取物組為C組,HCT-116細胞+250g/L肉豆蔻乙酸乙酯提取物組為D組,HCT-116細胞+500g/L肉豆蔻乙酸乙酯提取物組為E組。

1.4.1 細胞培養(yǎng) 采用RPMI 1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、青霉素、鏈霉素各100IU/mL)于5% CO2、37 ℃飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)人結(jié)腸癌HCT-116細胞。

1.4.2 肉豆蔻乙酸乙酯提取物的制備 取肉豆蔻飲片，粉碎后加8倍體積的乙酸乙酯，回流提取2 h，重復(fù)2次，過濾后真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥即得肉豆蔻乙酸乙酯提取物。實驗前稱取適量乙酸乙酯提物干粉，經(jīng)超聲使其充分溶解于RPMI1640培養(yǎng)基后，使用0.22 μm濾器過濾并配制成所需濃度的溶液，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 MTT法檢測HCT-116細胞增殖情況 取對數(shù)生長期人結(jié)腸癌HCT-116細胞，調(diào)整細胞濃度至1×108L-1，每孔100μL接種至96孔細胞培養(yǎng)板中，在5% CO2、37 ℃飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)液，將配制好的不同濃度的沙棘肉豆蔻乙酸乙酯提取物培養(yǎng)液分別加入96孔板,每種濃度設(shè)5個復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后，每孔加入MTT 20μL(5 g/L)，培養(yǎng)4 h后棄上清液，加入150μL DMSO，震蕩混勻充分溶解后，于490nm波長酶標儀檢測吸光度OD值。計算細胞的存活率、抑制率。計算公式：細胞生長增殖率=實驗組OD平均值/對照組OD平均值×100%；抑制率=(1-實驗組OD平均值/對照組OD平均值)×100%。根據(jù)各濃度抑制率，采用Graphpad Prism 5軟件提供IC50計算模型計算IC50。以上實驗重復(fù)3次，求出3次實驗的各濃度的抑制率與IC50，取平均值作為最終結(jié)果。

1.4.4 流式細胞術(shù)檢測HCT-116細胞凋亡情況 取對數(shù)生長期的HCT-116細胞，調(diào)整細胞濃度為1×108L-1，加藥后置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，收集細胞，預(yù)冷的PBS洗2次，每管用1×binding buffer將細胞調(diào)整成1×109L-1濃度，每管取100μL，加入5 μL的PE Annexin V溶液進行染色，混勻后，再加入5 μL的7-AAD溶液染色，雙染后在室溫避光靜止15 min后，每管再加入1×binding buffer 400μL，流式細胞儀進行檢測。

1.4.5 流式細胞術(shù)檢測HCT-116細胞周期變化 取對數(shù)生長期的HCT-116細胞，加藥后置于5% CO2、37 ℃飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，收集細胞，預(yù)冷后70%乙醇固定細胞，4 ℃過夜后PBS清洗2次，加入PI/RNase 0.5 mL置室溫暗處孵育15 min。流式細胞儀進行細胞周期檢測。

1.4.6 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測HCT-116細胞分泌E-cadherin、MMP-2及MMP-9情況 根據(jù)ELISA試劑盒說明書檢測HCT-116細胞培養(yǎng)液中E-cadherin、MMP-2及MMP-9水平。顯色后用酶標儀讀OD值，建立標準曲線，根據(jù)標準曲線換算出檢測指標的真實含量。

2 結(jié) 果

2.1HCT-116細胞增殖情況 經(jīng)肉豆蔻乙酸乙酯提取物處理24 h后，HCT-116細胞的生長明顯受到抑制：A組抑制率為(38.7±0.2)%,B組抑制率為(49.7±4.3)%,C組抑制率為(78.6±9.6)%,D組抑制率為(92.4±9.3)%,E組抑制率為(95.5±2.4)%,隨著藥物濃度的增加,抑制率逐漸升高。由公式計算可得肉豆蔻乙酸乙酯提取物對HCT-116細胞作用24 h的IC50為37.36 g/L。

2.2 HCT-116細胞凋亡情況 處理HCT-116細胞24 h后，A組、B組、C組、D組、E組HCT-116細胞凋亡數(shù)目的百分比逐漸增高，且呈劑量依賴性。經(jīng)方差分析，各濃度組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1及圖1～6。

2.3 HCT-116細胞周期變化 與對照組相比，A組、B組、C組、D組、E組G0/G1期的細胞比例明顯增加(P均<0.01)，S、G2/M期的細胞比例明顯減少(P均<0.01)，且呈劑量依賴性。經(jīng)方差分析，各濃度組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

2.4 HCT-116細胞分泌E-cadherin、MMP-2及MMP-9情況 與對照組相比，A組、B組、C組、D組、E組E-cadherin水平明顯升高，MMP-2及MMP-9水平均明顯降低，且呈劑量依賴性。經(jīng)方差分析，各濃度組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表1 各組HCT-116細胞凋亡情況

注：①與對照組比較，P<0.01。

圖1 對照組HCT-116細胞凋亡情況

圖2 A組HCT-116細胞凋亡情況

圖3 B組HCT-116細胞凋亡情況

圖4 C組HCT-116細胞凋亡情況

圖5 D組HCT-116細胞凋亡情況

圖6 E組HCT-116細胞凋亡情況

表2 各組HCT-116細胞周期比較

注：①與對照組比較，P<0.01。

3 討 論

E-cadherin是與大腸癌侵襲轉(zhuǎn)移較為密切的黏附分子，有抑制腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移的功能，其通過加強細胞間黏附抑制細胞增殖而發(fā)揮抑癌功能，被認為是腫瘤浸潤、轉(zhuǎn)移的抑制基因[4]，在維持組織器官正常形態(tài)結(jié)構(gòu)方面起重要作用[5]，其缺失使細胞間黏附受到破壞，腫瘤細胞因此易于脫離瘤體，導(dǎo)致腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移[6-7]。E-cadherin在多種癌組織中呈現(xiàn)出表達不穩(wěn)定或低表達性，并與腫瘤細胞的低分化相關(guān)[8-9]。

表3 各組HCT-116細胞分泌E-cadherin、MMP-2及MMP-9情況

注：①與對照組比較，P<0.01。

腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移是一個復(fù)雜的過程：腫瘤細胞脫離原發(fā)灶后，腫瘤細胞分泌并釋放各種蛋白水解酶，降解細胞外基質(zhì)，使得基底膜被降解，腫瘤細胞向鄰近的纖維結(jié)締組織浸潤進而向遠處轉(zhuǎn)移?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是一類鋅離子依賴的細胞外蛋白水解酶，可降解基底膜，促進惡性腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[10]。MMP-2是所有MMPs中分布最廣的，當細胞惡變時，常有MMP-2的升高[11]。MMP-9是MMPs中分子量最大的酶，它以酶原形式分泌，激活后形成Ⅳ型膠原酶，一方面降解、破壞靠近腫瘤表面的細胞外基質(zhì)和基底膜，使瘤細胞可沿著缺失的基底膜向周圍組織浸潤，促進腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移；另一方面可通過毛細血管內(nèi)生、腫瘤新生血管生成等促進腫瘤生長和擴散[12]。

本實驗結(jié)果表明，肉豆蔻乙酸乙酯提取物可明顯抑制人結(jié)腸癌HCT-116細胞增殖，且呈劑量依賴性。流式細胞檢測顯示藥物干預(yù)各組凋亡細胞數(shù)顯著增多，提示肉豆蔻乙酸乙酯提取物可能是通過凋亡途徑抑制腸癌細胞的增殖。流式細胞檢測也顯示不同濃度的肉豆蔻乙酸乙酯提取物作用HCT-116細胞24 h后，細胞周期發(fā)生明顯變化，隨著肉豆蔻乙酸乙酯提取物濃度的提高，G0/G1期腫瘤細胞增加，G2/M期、S期腫瘤細胞減少，且呈劑量依賴性。提示肉豆蔻乙酸乙酯提取物能使細胞周期阻滯于G0/G1期。本實驗進一步研究發(fā)現(xiàn)，肉豆蔻乙酸乙酯提取物可以上調(diào)人結(jié)腸癌HCT-116細胞E-cadherin的分泌，且同時能下調(diào)MMP-2、MMP-9的表達，且呈劑量依賴性，提示肉豆蔻乙酸乙酯提取物可能是通過上調(diào)E-cadherin的表達，下調(diào)MMP-2、MMP-9的表達而抑制HCT-116細胞侵襲轉(zhuǎn)移。

綜上所述，維藥肉豆蔻乙酸乙酯提取物可以抑制人腸癌HCT-116細胞的生長，誘導(dǎo)凋亡，其可能是通過上調(diào)E-cadherin表達，下調(diào)MMP-2、MMP-9的表達抑制腫瘤轉(zhuǎn)移，明確了維藥肉豆蔻在人腸癌中的作用及具體機制，這有助于更深入認識維藥肉豆蔻的功效，也為臨床尋找有效的治療靶點提供了依據(jù)。

[1] Tang XL,Yang XY,Kim YC,et al.Protective effects of the ethanolic extract of Melia toosendan fruit against colon cancer[J].Indian J Biochem Biophys,2012，49(3)：173-181

[2] 陳竺.全國第三次死因回顧抽樣調(diào)查報告[M].北京:中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社,2008:10

[3] 隋華,李琦.中藥復(fù)方治療大腸癌的臨床研究進展[J].遼寧中醫(yī)雜志,2009，36(7)：1241-1242

[4] Aoki R，Yasuda M，Torisu R，et al.Relationship between lymph n-ode metastasis and E-cadherin expression in submucosal invasive gastric carcinomas with gastric-phenotype[J].Cancer Res，2009，69(5)：159-167

[5] Wendt MK，Taylor MA，Schiemann BJ，et al.Down-regulation of epithelial cadherin is required to initiate metastatic outgrowth of breast cancer[J].Mol Biol Ce11，2011，22(14)：2423-2435

[6] Tang B，Peng ZH，Yu PW，et al.Expression and significance of Cx43 and E-cadherin in gastric cancer and metastatic lymph node[J].Med Oncol，2011，28(2)：502-508

[7] Corso G，Carvalho J，Marrelli D，et al.Somatic mutations and deletions of the E-cadherin gene predict poor survival of patients with gastric cancer[J].J Clinical Oncology，2013，31(7)：868-875

[8] Uchikado Y，Okumura H，Ishigami S，et al.Increased Slug and decreased E-cadherin expression is related to poor prognosis in patients with gastric cance[J].Gastric Cancer，2011，14(1)：41-49

[9] Pinheiro H，Carvalho J，Oliveira P，et al.Transcription initiation arising from E-cadherin/ CDHI intron2：a novel protein isoform that increases gastric cancer cell invasion and angiogenesis[J].Human Molecular Genetics，2012，21(19)：4253-4269

[10] Nair SA,Jagadeeshan S,Indu R,et al.How intact is the basement membrane? Role of MMPs[J].Adv Exp Med Biol,2012，749：215-232

[11] Howard EW,Crider BJ,Updike DL,et al.MMP-2 expression by fibroblasts is suppressed by the myofibroblast phenotype[J].Exp Cell Res,2012，318(13)：1542-1553

[12] Yeh CB,Hsieh MJ,Hsieh YH,et al.Antimetastatic effects of norcantharidin on hepatocellular carcinoma by transcriptional inhibition of MMP-9 through modulation of NF-kB activity[J].PLoS One,2012，7(2)：e31055

Inhibition of Uighur medicine Nutmeg's extraction on human colon cancer cell HCT-116

FAN Lei1, DENG Wanli1,2, ZHANG Hongping2, LYU Shuqin1,2

(1.Xinjiang Medical University, Urumchi 830000, Xinjiang, China; 2.The Fourth Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumchi 830000, Xinjiang, China)

Objective It is to investigate the effects of Uighur medicine Nutmeg’s acetic ether extraction (NAEE) on the cell proliferation and metastasis of human colon cancer HCT-116 cells.Methods The human colon HCT-116 cells in logarithmic phase were selected and divided into 6 groups, the cells in group A, group B, group C, group D and group E were intervened with NAEE at the dose of 31.25, 62.5, 125, 250, 500g/L respectively.Cell proliferation of HCT-116 cells was evaluated by MMT assay, apoptosis and cell stage were evaluated by flow cytometry (FCM), and the expression of E-Cadherin, MMP-2 and MMP-9 were evaluated by Gelatin Zymography.Results Compared with that in control group, NAEE inhabited cell proliferation and induced cell apoptosis significantly in HCT-116 cells, and the apoptosis rate of HCT-116 increased with the increase of concentration of NAEE; Compared with that in control group,the proportion of cells in G0/G1phase obviously increased while that of the cells in G2/M phase decreased significantly, the expression level of E-cadherin was higher and the levels of MMP-2 were lower in every groups intervened with NAEE.Conclusion NAEE could inhibit cell proliferation significantly in HCT-116 cells, accelerate the HCT-116 cell apoptosis in dose-dependent manner.Action of anti-metastasis are taken based on up-regulation of E-cadherin and down-regulation of MMP-2 and MMP-9.

Nutmeg; HCT-116; cell apoptosis; E-cadherin; MMP-2; MMP-9

范磊，女，碩士研究生在讀，研究方向為中醫(yī)藥防治腫瘤。

呂書勤，E-mail：lvshuqin@126.com

自治區(qū)科技支疆項目(2013911125)

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.10.002

R-332

A

1008-8849(2015)10-1031-04

2014-11-30