PPARα轉(zhuǎn)基因小鼠在藥物毒性評(píng)價(jià)中的應(yīng)用

賀銀麗，郭珣，趙顯莉，裴彥宇，孫井江，高虹

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心，北京 100021)

過(guò)氧化物酶體增殖激活受體α(peroxisome proliferator-activated receptor-α，PPARα)是脂肪酸氧化酶基因的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)控子，PPARα 激動(dòng)劑臨床上主要用于高甘油三酯血癥的治療。氯貝丁酯(clofibrate)屬于貝特類(lèi)藥物，是PPARα 激動(dòng)劑，通過(guò)調(diào)節(jié)脂肪β-氧化降低血脂［1］，在臨床上主要用于以甘油三酯增高為主的高脂血癥，但因其毒副作用較大，現(xiàn)臨床已淘汰此藥物。本實(shí)驗(yàn)所使用的PPARα 轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)高表達(dá)人PPARα 基因，我們將其應(yīng)用在PPARα 激動(dòng)劑氯貝丁酯的毒理學(xué)評(píng)價(jià)中，期望能更加敏感的發(fā)現(xiàn)其毒性，為PPARα 激動(dòng)劑類(lèi)藥物的臨床前毒理學(xué)評(píng)價(jià)尋找更加快速、靈敏、準(zhǔn)確的動(dòng)物模型。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)8 周齡C57BL/6J 小鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司【SCXK(京)2012-0001】。清潔級(jí)PPARα 轉(zhuǎn)基因小鼠，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所遺傳中心構(gòu)建【SCXK(京)2009-007】，遺傳背景為C57BL/6J 小鼠，在本實(shí)驗(yàn)室繁育【SYXK(京)20130014】。

1.2 主要試劑及儀器

實(shí)驗(yàn)藥品:氯貝丁酯(百靈威科技有限公司)，羧甲基纖維素鈉(廣東汕頭市西隴化工廠有限公司);主要儀器:日立7100 生化自動(dòng)分析儀。

1.3 動(dòng)物分組及給藥方法

8 周齡PPARα 轉(zhuǎn)基因小鼠(Tg)和C57BL/6J 野生小鼠(WT)各28 只，每組雌雄各半，體重18 ～22 g，分組及給藥劑量見(jiàn)表1。溶媒對(duì)照為1%甲基纖維素鈉，灌胃給藥28d，每只動(dòng)物灌胃體積為0.2 mL/10 g 體重。各組小鼠在同等的屏障環(huán)境中飼養(yǎng)，自由攝食、飲水，并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R 原則給予人道的關(guān)懷。

表1 實(shí)驗(yàn)小鼠分組及給藥方法Tab.1 The medication method and grouping of laboratory mice

1.4 觀察指標(biāo)與方法

1.4.1 大體觀察與體重測(cè)定

每天觀察一次，觀察指標(biāo)包括小鼠外觀和行為(包括小鼠的皮膚毛發(fā)，眼和黏膜的變化，呼吸，中樞神經(jīng)系統(tǒng)，四肢活動(dòng)及其他表現(xiàn))、排泄物等。每周測(cè)定小鼠體重，計(jì)算每周的體重增長(zhǎng)率。

1.4.2 血生化指標(biāo)測(cè)定

末次給藥禁食不禁水12 ～18 h 后，取全血0.3～0.4 mL，收集血清，在日立7100 生化自動(dòng)分析儀上測(cè)定。主要測(cè)定肝功能和腎功能指標(biāo)，包括丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、尿素(UN)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、肌酐(CREA)、甘油三酯(TG)。

1.4.3 臟器系數(shù)測(cè)定與組織病理學(xué)檢查

采血結(jié)束后脫頸椎處死動(dòng)物，取動(dòng)物心臟、肝臟、腎臟，臟器稱(chēng)重后以10%中性福爾馬林固定，組織經(jīng)修塊，梯度酒精脫水，石蠟包埋，切片厚度5 μm，HE 染色，光鏡下檢查。臟器系數(shù)=臟器重量/動(dòng)物體重 × 100%。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 一般體征觀察

整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中動(dòng)物眼睛與黏膜無(wú)異常分泌物，呼吸平穩(wěn)，活動(dòng)正常，無(wú)抽搐震顫等異?，F(xiàn)象發(fā)生。給藥組大便較稀，但仍成形。

2.2 體重變化

PPARα 轉(zhuǎn)基因小鼠和C57BL/6J 小鼠在給藥28d 后，Tg 組與WT 組比較，體重變化率差異無(wú)顯著性(P ＞0.05)。但是Tg 雄性高劑量組在給藥第3周、第4 周體重持續(xù)下降，而WT 雄性高劑量組體重在第3 周出現(xiàn)短暫下降后第4 周又增加(圖1)。該結(jié)果提示Tg 雄性小鼠對(duì)氯貝丁酯毒性更加敏感。

2.3 血生化指標(biāo)變化

參考本中心C57BL/6J 小鼠和PPARα 轉(zhuǎn)基因小鼠背景數(shù)據(jù)［2］，并與本實(shí)驗(yàn)溶媒對(duì)照組比較，有顯著性差異的生化指標(biāo)見(jiàn)表2。

從表2 可以看出，①各給藥組肌酐(CREA)均顯著高于對(duì)照組(P ＜0.01)，②Tg 雄性高、低劑量組肌酐值高于WT 雄性高、劑量組(P ＜0.05)。對(duì)于天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)，①Tg 雄性高、低劑量組AST 顯著高于對(duì)照組(P ＜0.01，P ＜0.05);②Tg 雄性高、低劑量組AST 值顯著高于WT 雄性高、劑量組(P ＜0.01，P ＜0.05)。Tg 雄性的腎臟損傷指標(biāo)CREA、肝臟損傷指標(biāo)AST 較WT 雄性升高更多，提示Tg 雄性小鼠腎臟損傷、肝臟損傷更嚴(yán)重。

2.4 臟器系數(shù)

①心臟系數(shù):各給藥組與對(duì)照組比，差異無(wú)顯著性。②肝臟系數(shù):Tg 和WT 各高、低劑量組均顯著高于對(duì)照組(P ＜0.01，P ＜0.05)(圖2A)。③腎臟系數(shù):Tg 高、低劑量組均顯著高于對(duì)照組(P ＜0.01，P ＜0.05);WT 高劑量組顯著高于對(duì)照組(P ＜0.05)(圖2B)。WT 低劑量組腎臟系數(shù)并沒(méi)有顯著性增加，提示W(wǎng)T 小鼠的腎臟損傷沒(méi)有Tg 小鼠嚴(yán)重。

圖1 給予氯貝丁酯后雄性小鼠體重變化率Fig.1 The change rate of mouse body weight after the clofibrate administration

表2 給予氯貝丁酯后血生化指標(biāo)變化Tab.2 Changes of serum biochemistry in the mice after clofibrate administration

2.5 病理組織學(xué)變化

Tg 高劑量組:50%發(fā)生肝細(xì)胞溶解壞死，伴有再生，100%發(fā)生腎小球上皮細(xì)胞空泡變性。Tg 低劑量組:50%發(fā)生肝細(xì)胞再生，50%發(fā)生腎小管上皮細(xì)胞脂肪變性、腎小管上皮細(xì)胞核固縮。WT 高劑量組:50%發(fā)生腎小球上皮細(xì)胞空泡變性，肝臟未見(jiàn)病變。WT 低劑量組:50%發(fā)生小灶性肝細(xì)胞壞死炎細(xì)胞浸潤(rùn)，50%發(fā)生腎小球上皮細(xì)胞空泡變性腎小管上皮細(xì)胞脂肪變性。Tg、WT 對(duì)照組各受檢臟器未見(jiàn)明顯病理改變。

從病理組織學(xué)結(jié)果可以看出氯貝丁酯對(duì)Tg 小鼠肝臟、腎臟的病理?yè)p傷程度比WT 小鼠更嚴(yán)重。

圖3 給予氯貝丁酯后肝臟病理變化(HE 染色，標(biāo)尺=100 μm)Fig.3 Histological changes of the liver after clofibrate administration.HE staining.Bar=100 μm

圖4 給予氯貝丁酯后腎臟病理變化(HE 染色，標(biāo)尺=100 μm)Fig.4 Histological changes of the kidney after clofibrate administration.HE staining.Bar=100 μm

3 討論

過(guò)氧化物酶體增殖激活受體(peroxisome proliferator-activated receptors，PPARs)是核受體家族中的配體激活受體，PPARs 與配體結(jié)合激活后，與視黃醇類(lèi)X 受體(RXR)形成異二聚體，形成的異二聚體與靶基因啟動(dòng)子上游結(jié)合，最終調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄［3］。PPARs 有三個(gè)不同 亞型，包括α、β、γ。PPARα 通過(guò)基因轉(zhuǎn)錄控制氧化物酶、線(xiàn)粒體的β-氧化途徑、脂肪酸攝取和甘油三脂的分解，從而影響脂質(zhì)代謝［4－7］，主要分布在代謝活性較高的組織中，如肝、腎、心臟，是脂類(lèi)代謝分子基礎(chǔ)的研究熱點(diǎn)［8］。

在新藥研發(fā)過(guò)程尤其是臨床試驗(yàn)階段中，大量候選藥物因?yàn)榘踩詥?wèn)題被迫終止開(kāi)發(fā)［9］。阿斯利康公司研發(fā)的PPAR-α/γ 雙重激動(dòng)劑Tesaslitazar在1 個(gè)II 期和4 個(gè)III 期臨床試驗(yàn)后，終止了對(duì)Tesaslitazar 的研究，因?yàn)樵贗II 期臨床研究中發(fā)現(xiàn)該藥使血中肌酐升高，存在腎毒性。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型是基因組中含有外來(lái)遺傳物質(zhì)的動(dòng)物，可建立敏感動(dòng)物品系及人類(lèi)相同疾病的動(dòng)物模型［10］，在藥物安全評(píng)價(jià)中，與傳統(tǒng)動(dòng)物模型比較，具有敏感性高、結(jié)果真實(shí)可靠、外推行強(qiáng)、時(shí)間短、花費(fèi)小等優(yōu)勢(shì)［11］。目前，PPARα 轉(zhuǎn)基因小鼠在國(guó)內(nèi)外有用于心肌病的研究［12］，肝癌的發(fā)生機(jī)制的研究［13］等。本實(shí)驗(yàn)使用PPARα 轉(zhuǎn)基因小鼠評(píng)價(jià)PPARα 激動(dòng)劑氯貝丁酯的毒性，期望能更加敏感的發(fā)現(xiàn)其毒性。

CREA 是評(píng)價(jià)腎功能的重要生化指標(biāo)，增高多見(jiàn)于腎功能不全、急慢性腎小球炎等，腎臟代謝廢物的能力下降。給藥結(jié)束后，Tg 雄性小鼠CREA 值顯著高于WT 雄性小鼠，提示PPARα 轉(zhuǎn)基因雄性小鼠對(duì)該藥物產(chǎn)生的腎臟損傷更加敏感，與阿斯利康公司研發(fā)的PPAR-α/γ 雙重激動(dòng)劑Tesaslitazar 在臨床試驗(yàn)中所產(chǎn)生的副作用一致。AST 是評(píng)價(jià)肝功能的重要生化指標(biāo)，主要存在于肝細(xì)胞線(xiàn)粒體內(nèi)，當(dāng)肝臟發(fā)生嚴(yán)重壞死或破壞時(shí)，血清中濃度會(huì)偏高，增高常見(jiàn)于肝炎、脂肪肝、肝癌等疾病［14］。Tg 雄性小鼠AST 顯著高于WT 雄性小鼠，提示PPARα 轉(zhuǎn)基因雄性小鼠對(duì)該藥物產(chǎn)生的肝臟損傷更加敏感。從表2中可以看出，Tg 雄性小鼠給藥組AST 與對(duì)照組比較有升高，但未見(jiàn)顯著性差異，可能是因?yàn)榇菩孕∈蟮纳碇芷趯?dǎo)致酶水平的變化，也可能是性激素影響藥物代謝轉(zhuǎn)化的結(jié)果［15］。此外，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中還發(fā)現(xiàn)Tg 給藥組甘油三脂(TG)與Tg 對(duì)照組比有顯著下降(P ＜0.01，P ＜0.05)，而WT 組并沒(méi)有顯著下降，說(shuō)明PPARα 轉(zhuǎn)基因小鼠在評(píng)價(jià)PPARα 激動(dòng)劑類(lèi)藥物的藥效時(shí)，也是一個(gè)更加敏感的動(dòng)物模型，與本課題組前期所做的藥效學(xué)研究結(jié)果一致［16］。

臟器重量變化是藥物毒性反應(yīng)的敏感指標(biāo)之一，從病理學(xué)角度，當(dāng)臟器出現(xiàn)細(xì)胞腫脹、出血、積水、增生等病理變化時(shí)，該臟器的重量可能增加［17］。本實(shí)驗(yàn)中，各給藥組肝臟系數(shù)、腎臟系數(shù)均有顯著性增加，而心臟系數(shù)并沒(méi)有顯著性增加，與病理結(jié)果一致。根據(jù)本試驗(yàn)血生化、臟器系數(shù)和病理檢測(cè)結(jié)果提示，PPARα 轉(zhuǎn)基因小鼠與C57BL/6J 野生小鼠相比，在評(píng)價(jià)PPARα 激動(dòng)劑毒性方面是一個(gè)新的、敏感的動(dòng)物模型。

［1］Van Raalte DH，Li M，Pritchard PH，et al.Peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR)-alpha:a pharmacological target with a promising future［J］.Pharm Res，2004，21 (9):1531－1538.

［2］尉明曉，陳威，高潔，等.PPARα 轉(zhuǎn)基因?qū)π∈蟮纳怼⑸扔绊懷芯浚跩］.中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志，2013，23 (05):5 －11，0，2.

［3］Bensinger SJ，Tontonoz P.Integration of metabolism and inflammation by lipid-activated nuclear receptors［J］.Nature，2008，454(7203):470 －477.

［4］Kersten S，Desvergne B，Wahli W.Roles of PPARs in health and disease［J］.Nature，2000，405 (6785):421 －424.

［5］Goto T，Takahashi N，Kato S，et al.Phytol directly activates peroxisome proliferator-activated receptor alpha (PPARalpha)and regulates gene expression involved in lipid metabolism in PPARalpha-expressing HepG2 hepatocytes ［J］.Biochem Biophys Res Commun，2005，337 (2):440 －445.

［6］Qiu L，Ye H，Chen L，et al.Red clover extract ameliorates dyslipidemia in streptozotocin-induced diabetic C57BL/6 mice by activating hepatic PPARalpha ［J］.Phytother Res，2012，26(6):860 －864.

［7］Zeng T，Zhang CL，Song FY，et al.Garlic oil alleviated ethanolinduced fat accumulation via modulation of SREBP-1，PPAR-alpha，and CYP2E1［J］.Food Chem Toxicol，2012，50 (3 －4):485 －491.

［8］Everett L，Galli A and Crabb D.The role of hepatic peroxisome proliferator-activated receptors (PPARs)in health and disease［J］.Liver，2000，20 (3):191 －199.

［9］Boverhof DR，Zacharewski TR.Toxicogenomics in risk assessment:applications and needs［J］.Toxicol Sci，2006，89 (2):352 －360.

［10］Vijg J，van Steeg H.Transgenic assays for mutations and cancer:current status and future perspectives［J］.Mutat Res，1998，400 (1 －2):337 －354.

［11］張峻，戴宇飛.轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型在毒理學(xué)中的應(yīng)用［J］.衛(wèi)生研究，2012，41 (05):868 －873.

［12］Hopkins TA，Sugden MC，Holness MJ，et al.Control of cardiac pyruvate dehydrogenase activity in peroxisome proliferator-activated receptor-alpha transgenic mice［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2003，285 (1):H270 －276.

［13］Yang Q，Nagano T，Shah Y，et al.The PPAR alpha-humanized mouse:a model to investigate species differences in liver toxicity mediated by PPAR alpha［J］.Toxicol Sci，2008，101 (1):132 －139.

［14］Damsgaard T，Clausen N，West-Nielsen E，et al.Early diagnosis of acute myocardial infarction by means of aspartate aminotransferase，creatine kinase and creatine kinase isoenzyme MB［J］.Dan Med Bull，1979，26 (6):298 －302.

［15］李蘭芳，李國(guó)風(fēng)，解麗君.大、小鼠口服腰痛寧膠囊的急性毒性研究［J］.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)與管理，2004，(04):12 －15.

［16］魏明曉，秦超，陳威，等.PPARα 轉(zhuǎn)基因小鼠在藥物評(píng)價(jià)中的應(yīng)用研究［J］.中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志，2013，23 (01):18 －22.

［17］袁本利.藥物安全評(píng)價(jià)中臟器系數(shù)的意義及不足［J］.中國(guó)新藥雜志，2003，12 (11):960 －963.