低氧血癥對(duì)輕型顱腦損傷大鼠海馬結(jié)構(gòu)二次腦損傷的實(shí)驗(yàn)研究

王洪財(cái) 王波定 陳海 陳茂送 孫成豐 沈罡 馬延斌

低氧血癥對(duì)輕型顱腦損傷大鼠海馬結(jié)構(gòu)二次腦損傷的實(shí)驗(yàn)研究

王洪財(cái) 王波定 陳海 陳茂送 孫成豐 沈罡 馬延斌

目的應(yīng)用低氧血癥二次腦損傷大鼠模型，探討低氧血癥對(duì)輕型顱腦損傷（m TBI）后海馬神經(jīng)元及軸索組織結(jié)構(gòu)的二次損傷作用。方法采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為正常對(duì)照組（8只）、單純m TBI組（10只）、單純低氧血癥組（10只）及低氧血癥二次腦損傷組（10只）。在自制旋轉(zhuǎn)裝置致大鼠m TBI基礎(chǔ)上，利用動(dòng)物呼吸機(jī)獲得控制性低氧血癥，從而構(gòu)建低氧血癥二次腦損傷模型。腦損傷后1周，應(yīng)用HE染色、免疫組化β-APP染色及電鏡觀察大鼠海馬組織結(jié)構(gòu)病理學(xué)變化。結(jié)果HE染色發(fā)現(xiàn)單純低氧血癥組大鼠海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)完整、排列有序、神經(jīng)組織結(jié)構(gòu)致密、未見明顯神經(jīng)元丟失及神經(jīng)組織結(jié)構(gòu)疏松等病理變化，單純m TBI組及低氧血癥二次腦損傷組大鼠均出現(xiàn)海馬神經(jīng)元腫脹、胞質(zhì)淡染、密度降低、排列不規(guī)則及神經(jīng)組織結(jié)構(gòu)疏松等損傷表現(xiàn)，但低氧血癥二次腦損傷組較單純m TBI組明顯。免疫組化β-APP染色及電鏡觀察到低氧血癥二次腦損傷組大鼠海馬存在軸索腫脹扭曲變形、髓鞘板層分離及軸索球形成等軸索損傷表現(xiàn)。 結(jié)論 低氧血癥二次腦損傷可明顯加重m TBI后海馬神經(jīng)元及軸索組織結(jié)構(gòu)的損傷，及早預(yù)防、發(fā)現(xiàn)和治療低氧血癥對(duì)改善m TBI患者預(yù)后具有積極意義。

低氧血癥 輕型顱腦損傷 二次腦損傷

隨著交通物流業(yè)及建筑業(yè)的發(fā)展，顱腦損傷（TBI）發(fā)病率呈不斷上升趨勢(shì)，其增長(zhǎng)速度已超過(guò)全球人口的增長(zhǎng)速度，被學(xué)者稱之為“靜息性流行病”，現(xiàn)已成為全球關(guān)注的社會(huì)公共衛(wèi)生問(wèn)題[1]。輕型TBI（mTBI）是TBI中最為常見的損傷類型，由于臨床表現(xiàn)各異且癥狀輕微，一直未受臨床醫(yī)生所重視，其相應(yīng)的基礎(chǔ)研究更為薄弱[2]。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外研究表明，部分mTBI患者即使頭顱CT及常規(guī)MR檢查表現(xiàn)正常，事實(shí)上也存在神經(jīng)組織病理學(xué)改變，尤其是海馬區(qū)域神經(jīng)組織結(jié)構(gòu)的損傷[3]。此外，部分mTBI患者在疾病過(guò)程中尤其是創(chuàng)傷急性期，可因胸腹部多發(fā)傷伴發(fā)低氧血癥等二次腦損傷因素而導(dǎo)致病情惡化及后遺癥發(fā)生[4]。為此，本研究建立了低氧血癥二次腦損傷大鼠模型，以進(jìn)一步探討低氧血癥對(duì)mTBI后海馬組織結(jié)構(gòu)的二次損傷作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑 健康成年雄性SD大鼠38只，體重300～350g，購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，飼養(yǎng)于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第三人民醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。免疫組化β-APP抗體購(gòu)于英國(guó)Abcam公司，Olympus IX51型倒置熒光顯微鏡為日本Olympus公司產(chǎn)品，Philips CM-120透射電鏡為荷蘭Philips公司產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及模型建立 將大鼠單籠依次標(biāo)簽，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對(duì)照組（8只）和損傷組（30只），其中損傷組分為單純mTBI組（10只）、單純低氧血癥組（10只）及低氧血癥二次腦損傷組（10只）。低氧血癥二次腦損傷組大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉，待角膜反射消失后，行氣管插管、小型動(dòng)物呼吸機(jī)（Harvard Apparatus 683，美國(guó)）輔助呼吸，右側(cè)股動(dòng)脈插管監(jiān)測(cè)平均動(dòng)脈壓、輸液及取樣；應(yīng)用自制顱腦致傷裝置（專利號(hào)：ZL200810201615.5）使大鼠發(fā)生90°整體瞬間加速旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)而產(chǎn)生mTBI[5]，傷后即刻予11%氧氣通氣30 min造成低氧血癥，血?dú)夥治鎏崾綪aO2為（38±3）mmHg，動(dòng)脈血血氧飽和度（SpO2）為（56±3）%[6]。二次腦損傷后置于正常室內(nèi)空氣中。單純mTBI組大鼠接受旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)無(wú)后續(xù)低氧血癥建立過(guò)程，而單純低氧血癥組大鼠無(wú)旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)而直接行11%氧氣通氣30min，血?dú)夥治鯬aO2為（39±3）mmHg，SpO2為（57±2）%。正常對(duì)照組大鼠除無(wú)旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)和低氧血癥建立過(guò)程外，其他操作同損傷組。大鼠傷后不進(jìn)行搶救及其他特殊治療，觀察大鼠呼吸變化、肢體抽搐、蘇醒后肢體活動(dòng)及反應(yīng)能力等情況。等大鼠恢復(fù)自主活動(dòng)后，回籠繼續(xù)原有飼料飼養(yǎng)。模型建立后1周，記錄大鼠死亡數(shù)目，計(jì)算死亡率并行組織病理學(xué)檢測(cè)。

1.3 組織病理學(xué)檢測(cè)

1.3.1 光鏡標(biāo)本制備 各組大鼠麻醉滿意后，快速開胸行升主動(dòng)脈插管，剪開右心房，先后以0.9%氯化鈉注射液100ml快速?zèng)_洗、4%多聚甲醛350ml先快后慢行腦灌注固定?？焖匍_顱大體標(biāo)本觀察后，行腦冠狀面3～4 mm連續(xù)切片，4%多聚甲醛4℃固定24h，常規(guī)脫水、石蠟包埋，HE常規(guī)染色及免疫組化β-APP染色（抗體1∶300稀釋，LSAB法染色）。光鏡標(biāo)本在Olympus IX51型倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.2 透射電鏡標(biāo)本制備 各組中隨機(jī)抽取2只大鼠標(biāo)本行電鏡檢查，以2%戊二醛350ml灌注固定后，快速開顱取海馬CA3處大小1mm×1mm×3mm腦組織，再以2%戊二醛4℃固定24h，鋨酸染色后固定，環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片后Philips CM-120透射電鏡觀察。

1.3.3 組織病理學(xué)檢測(cè) 在HE染色結(jié)果基礎(chǔ)上對(duì)海馬CA3區(qū)域進(jìn)行神經(jīng)元計(jì)數(shù)，然后取平均數(shù)。神經(jīng)元計(jì)數(shù)方法如下：每只動(dòng)物取2張切片，切片定位于前囟后3.8mm，在400倍鏡下計(jì)數(shù)連續(xù)4個(gè)視野，計(jì)數(shù)有完整胞體和細(xì)胞核的神經(jīng)元。應(yīng)用免疫組化β-APP染色來(lái)評(píng)估各損傷組大鼠海馬區(qū)域軸索損傷情況。所有神經(jīng)元計(jì)數(shù)及陽(yáng)性軸索染色判讀均由同1位經(jīng)驗(yàn)豐富的神經(jīng)病理學(xué)醫(yī)師執(zhí)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料均采用表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析和SNK檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠死亡情況及行為學(xué)觀察 正常對(duì)照組、單純mTBI組及單純低氧血癥組大鼠傷后1周無(wú)死亡現(xiàn)象。低氧血癥二次腦損傷組大鼠死亡2只，死亡率為20.0%。死亡大鼠在低氧血癥建立后即出現(xiàn)呼吸持續(xù)淺促，間歇性肢體抽搐呈去腦強(qiáng)直狀，90min內(nèi)出現(xiàn)死亡。其余大鼠傷后多數(shù)出現(xiàn)10余秒張口急促呼吸，后呼吸淺促夾雜數(shù)次深幅呼吸、肢體抽搐及大小便失禁，置室內(nèi)空氣30min后呼吸漸平穩(wěn)、SpO2和PaO2基本恢復(fù)受傷前水平。蘇醒后大鼠精神差，蜷伏不動(dòng)，反應(yīng)下降，覓食活動(dòng)減少，上述行為學(xué)抑制持續(xù)時(shí)間約4h。單純mTBI組大鼠亦出現(xiàn)短暫呼吸暫停及行為學(xué)抑制等表現(xiàn)，但上述變化在2h內(nèi)恢復(fù)。單純低氧血癥組和正常對(duì)照組大鼠無(wú)上述現(xiàn)象，呼吸保持平穩(wěn)、麻醉蘇醒后活動(dòng)基本同麻醉前。

2.2 各組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元組織病理學(xué)觀察

2.2.1 光鏡觀察 光鏡下HE染色發(fā)現(xiàn)低氧血癥二次腦損傷組海馬區(qū)域神經(jīng)元密度降低，排列不規(guī)則，神經(jīng)元腫脹，胞質(zhì)淡染，神經(jīng)元周邊呈空泡狀，神經(jīng)組織結(jié)構(gòu)疏松，并可見神經(jīng)元變性壞死（見圖1A）。單純mTBI組亦見神經(jīng)元減少及神經(jīng)組織結(jié)構(gòu)絮亂疏松等組織學(xué)改變，但較低氧血癥二次腦損傷組輕（見圖1B）。單純低氧血癥組和正常對(duì)照組鏡下可見神經(jīng)元及軸索排列有序，神經(jīng)組織結(jié)構(gòu)致密，未見神經(jīng)元丟失及神經(jīng)組織結(jié)構(gòu)疏松等病理變化（見圖1C-D）。

2.2.2 電鏡觀察 電鏡下可見低氧血癥二次腦損傷組大鼠神經(jīng)元內(nèi)線粒體腫脹、尼氏小體消失及胞質(zhì)空泡化等超微病理學(xué)變化，并見神經(jīng)軸索腫脹迂曲，軸索內(nèi)微管消失、微絲聚集，線粒體腫脹，髓鞘板層分離與軸索膜形成低電子密度區(qū)，軸索膜破裂、軸漿外溢形成斷端軸索球等軸索損傷征象（見圖2A）。單純mTBI組除可見類似的神經(jīng)元損傷病理改變外，未見明顯軸索損傷征象（見圖2B）。單純低氧血癥組和正常對(duì)照組則無(wú)明顯神 經(jīng)元及軸索損傷的征象（見圖2C-D）。

圖1 各組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元組織病理學(xué)觀察（A：低氧血癥二次腦損傷組；B：?jiǎn)渭僲TBI組；C：?jiǎn)渭兊脱跹Y組；D：正常對(duì)照組；HE染色，×200）

圖2 各組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元電鏡觀察（A：低氧血癥二次腦損傷組；B：?jiǎn)渭僲TBI組；C：?jiǎn)渭兊脱跹Y組；D：正常對(duì)照組；鋨酸染色，×13 500）

2.2.3 免疫組化檢測(cè) 免疫組化β-APP染色觀察到低氧血癥二次腦損傷組大鼠海馬區(qū)域神經(jīng)元呈強(qiáng)陽(yáng)性染色，并見神經(jīng)軸索迂曲腫脹、串珠樣改變及軸索斷裂形成軸索球等軸索損傷表現(xiàn)（見圖3A）。單純mTBI組神經(jīng)元呈弱陽(yáng)性染色，且未現(xiàn)軸索陽(yáng)性染色（見圖3B）；單純低氧血癥組和正常對(duì)照組神經(jīng)元及軸索均未出現(xiàn)陽(yáng)性染色（見圖3C-D）。

圖3 各組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元免疫組化β-APP染色（A：低氧血癥二次腦損傷組；B：?jiǎn)渭僲TBI組；C：?jiǎn)渭兊脱跹Y組；D：正常對(duì)照組；免疫組化LSAB法染色，×100）

2.3 各組大鼠海馬區(qū)域神經(jīng)元計(jì)數(shù) 模型建立后1周，低氧血癥二次腦損傷組大鼠海馬CA3區(qū)域內(nèi)神經(jīng)元計(jì)數(shù)分別為（127±11）個(gè)，單純mTBI組為（159±15）個(gè)、單純低氧血癥組（181±19）個(gè)，正常對(duì)照組（191±23）個(gè)。低氧血癥二次腦損傷組及單純mTBI組神經(jīng)元計(jì)數(shù)與其他兩組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=9.47、3.75，均P＜0.05），且低氧血癥二次腦損傷組比單純mTBI組神經(jīng)元數(shù)目減少更為明顯（t=5.035，P＜0.05）。單純低氧血癥組神經(jīng)元數(shù)目減少，但與正常對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（t=1.060，P＞0.05）。

3 討論

TBI是造成當(dāng)今世界青壯年重度殘疾和死亡的首要病因，且治療難、預(yù)后差，長(zhǎng)期持續(xù)存在的神經(jīng)功能缺失給家庭和社會(huì)增加了巨大的醫(yī)療負(fù)擔(dān)，現(xiàn)已成為全球關(guān)注的嚴(yán)重社會(huì)公共衛(wèi)生問(wèn)題[1]。mTBI是臨床最常見的TBI類型，約占TBI發(fā)病率的70.0%～80.0%。由于其臨床表現(xiàn)各異且癥狀輕微，一直不被臨床醫(yī)生所重視，因此目前mTBI診斷及治療仍不完善，相應(yīng)的基礎(chǔ)研究更未廣泛開展。隨著功能MR技術(shù)的發(fā)展及相關(guān)研究的進(jìn)展，國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)mTBI可引起患者認(rèn)知功能障礙、神經(jīng)行為絮亂、記憶力減退及注意力不集中等神經(jīng)精神癥狀，甚至可導(dǎo)致軀體運(yùn)動(dòng)感覺功能障礙；部分患者即使頭顱CT及常規(guī)MR表現(xiàn)正常，也可能存在神經(jīng)組織病理改變[3,7]。此外，mTBI患者在其疾病過(guò)程中尤其是創(chuàng)傷急性期，可因誤吸、創(chuàng)傷性濕肺和胸腹部損傷而伴發(fā)低氧血癥、低血壓等二次腦損傷因素導(dǎo)致患者病情惡化及后遺癥發(fā)生[4，6]。

二次腦損傷是指在原發(fā)性腦損傷后，由于低氧血癥、低血壓及高熱等因素造成的顱內(nèi)壓、腦灌注壓及腦代謝率等的異常改變，進(jìn)而加重原發(fā)性腦損傷并延長(zhǎng)其病理生理?yè)p傷過(guò)程。國(guó)外臨床研究表明，在TBI中二次腦損傷的發(fā)生率為44.5%，TBI患者合并二次腦損傷時(shí)致殘率和病死率均顯著提高[8-9]。本研究結(jié)果同樣提示，在單純mTBI或低氧血癥情況下，大鼠行為學(xué)抑制能較快恢復(fù)且未出現(xiàn)死亡情況，而低氧血癥二次腦損傷組大鼠死亡率高達(dá)20.0%，且行為學(xué)抑制時(shí)間明顯延長(zhǎng)。眾多臨床研究表明在TBI中低氧血癥較其他二次腦損傷因素更常見。一項(xiàng)關(guān)于TBI患者直升機(jī)轉(zhuǎn)運(yùn)的研究發(fā)現(xiàn)，55.0%的TBI患者在氣管插管前曾發(fā)生過(guò)低氧血癥，而這些低氧血癥患者中，46.0%未合并低血壓[10]。腦組織耗氧量大、對(duì)缺氧極其敏感，故低氧血癥的發(fā)生可嚴(yán)重影響患者神經(jīng)功能康復(fù)及預(yù)后。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)于TBI患者合并低氧血癥進(jìn)行了大量的臨床統(tǒng)計(jì)工作，但相對(duì)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)的TBI合并低氧血癥的二次腦損傷模型至今在國(guó)內(nèi)尚未建立，相關(guān)基礎(chǔ)研究甚少[11]。國(guó)外部分學(xué)者構(gòu)建了低氧血癥二次腦損傷模型，但主要限于中重型TBI而鮮有mTBI，并且低氧血癥建立的條件和方式差異較大[12-13]。為此，在穩(wěn)定可靠的低氧血癥二次腦損傷模型基礎(chǔ)上，探討低氧血癥對(duì)mTBI后神經(jīng)組織結(jié)構(gòu)的損傷，有利于進(jìn)一步認(rèn)識(shí)低氧血癥二次腦損傷，也為其臨床診治提供更多的線索和依據(jù)。

國(guó)外多項(xiàng)研究報(bào)道低氧血癥可加重局灶性中重型TBI實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的皮層神經(jīng)元損傷、加劇神經(jīng)炎癥反應(yīng)、加重腦水腫、擾亂細(xì)胞代謝、延長(zhǎng)組織病理?yè)p傷過(guò)程并導(dǎo)致感覺、運(yùn)動(dòng)和認(rèn)知功能惡化[12-14]。海馬作為大腦邊緣系統(tǒng)的重要組成部分，該區(qū)域神經(jīng)元及軸索連接與學(xué)習(xí)記憶功能密切相關(guān)，TBI后海馬區(qū)域神經(jīng)組織結(jié)構(gòu)的損傷是傷后認(rèn)知、記憶功能障礙的主要原因。既往研究表明海馬CA3區(qū)域神經(jīng)元對(duì)損傷有著特殊敏感性，在傷后此區(qū)域神經(jīng)元容易發(fā)生變性、壞死及凋亡[6]。本研究在自制mTBI聯(lián)合低氧血癥動(dòng)物模型基礎(chǔ)上，利用HE染色、免疫組化和電鏡技術(shù)來(lái)觀察低氧血癥對(duì)mTBI后海馬組織結(jié)構(gòu)的損傷作用。組織病理學(xué)檢測(cè)表明單純mTBI后海馬CA3區(qū)域神經(jīng)元出現(xiàn)密度降低、排列不規(guī)則、神經(jīng)組織結(jié)構(gòu)疏松及神經(jīng)元變性壞死等損傷征象，但無(wú)明顯軸索結(jié)構(gòu)損傷。單純限時(shí)性低氧血癥后海馬區(qū)域神經(jīng)元數(shù)目減少，但與正常對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，且不存在神經(jīng)軸索損傷。這與Dolinak等[15]研究結(jié)果一致，即單純限時(shí)性低氧血癥并不易造成神經(jīng)軸索損傷。mTBI合并低氧血癥后，海馬CA3區(qū)域神經(jīng)元損傷征象更為明顯，神經(jīng)元數(shù)目減少，與單純mTBI組比較存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。此外，神經(jīng)軸索出現(xiàn)腫脹迂曲、髓鞘板層分離及軸索斷裂形成軸索球等損傷表現(xiàn)。mTBI合并低氧血癥后出現(xiàn)明顯的海馬組織結(jié)構(gòu)損傷，這可能與mTBI后腦血管自動(dòng)調(diào)節(jié)功能受損，導(dǎo)致腦組織對(duì)于后繼腦損傷因素易損性增加相關(guān)，而正常腦組織存在著良好的腦血管自動(dòng)調(diào)節(jié)功能、在單純低氧血癥情況下腦組織可通過(guò)擴(kuò)張腦血管來(lái)代償缺氧[16]。此外，也可能與mTBI后神經(jīng)元代謝增加、興奮性氨基酸增多及線粒體功能障礙等因素相關(guān)[17]。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)單純限時(shí)性低氧血癥對(duì)海馬神經(jīng)元及軸索結(jié)構(gòu)損傷作用不明顯，然而在mTBI后發(fā)生低氧血癥即可出現(xiàn)明顯的神經(jīng)組織結(jié)構(gòu)損傷。這提示mTBI后腦組織易損性增加，積極預(yù)防及糾正低氧血癥對(duì)改善mTBI患者預(yù)后具有積極意義。

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ObjectiveTo investigate the effec ts of post-traumatic hypoxem ia on m ild traumatic brain injury(m TBI)in rats．MethodsThe experimentalmodelwas estab lished by instantly rotating 90 degree followed by hypoxem ic insult in rats．Animals in g roup 1 were sub jected to p rimarym TBIand subsequenthypoxem ia(n=10);animals in g roup 2 were sub jec ts tom TBI only(n=10);animals in group 3 underwenthypoxem ia only(n=10)and animals in group 4 served as the controls(n=8)．Pathological and behavioralexam inations were conducted 1 week after injury．ResultsAll rats in group 2 and 3 survived afterm TBIor hypoxem ia,whereas 2 animals d ied in g roup 1 w ith amortality rate of20．0%．Histologicalexam ination ofHE-stained sections,electronm ic roscope,andβ-APP immunohistochem istry revealed the p resence ofneuronaland axonalinjury in CA3 ofhippocam pus in rats of group 1．Pathological changes of neuronal injury in g roup 2 were exhibited,but no add itional axonal damage was demonstrated．The above changes were not found in g roups 3 and 4．ConclusionThe combination of p rimary m TBIand secondary hypoxem ia can cause synergistic effects to p roduce significantly pathologicalchanges in CA3 ofhippocam pus in rats．

Hypoxem ia Mild traumatic b rain injury Secondary b rain injury

2015-01-04）

（本文編輯：胥昀）

寧波市自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2011A610041）；寧波市科學(xué)技術(shù)基金項(xiàng)目（2013A05）

315040 寧波市醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院神經(jīng)外科（王洪財(cái)、王波定、陳海、陳茂送、孫成豐、沈罡）；上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第三人民醫(yī)院神經(jīng)外科（馬延斌）

王波定，E-mail：Roger0412@126.com