藤黃酸誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞H1975凋亡的機(jī)制研究

何蕾 王寶輝 呂望 泮輝 胡堅(jiān)

藤黃酸誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞H1975凋亡的機(jī)制研究

何蕾 王寶輝 呂望 泮輝 胡堅(jiān)

目的研究藤黃酸（GA）誘導(dǎo)人肺癌細(xì)胞H1975凋亡的分子機(jī)制，探討氧自由基（ROS）和JNK信號(hào)通路在GA殺傷肺癌細(xì)胞中的作用。方法以人肺癌細(xì)胞H1975為研究對(duì)象，MTT法測(cè)定GA抑制細(xì)胞增殖的作用，Annexin V/PI雙染法測(cè)定細(xì)胞凋亡率，DCFH-DA法測(cè)定ROS含量，JC-1探針染色分析線粒體膜電位（MMP），Western b lot檢測(cè)JNK信號(hào)通路的激活和線粒體凋亡途徑相關(guān)蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果GA呈劑量依賴性抑制H1975細(xì)胞的增殖，各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞存活率與空白對(duì)照組比較，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0．05或0．01）。1、2．5和5μmol/LGA作用24h后，細(xì)胞凋亡率分別為25．2%、51．8%和75．1%，剪切型凋亡相關(guān)蛋白c leaved caspase-9、c leaved caspase-3和c leaved PARP的表達(dá)隨GA濃度增高而顯著增加，與空白對(duì)照組比較，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0．05或0．01）。GA作用2h后H1975細(xì)胞ROS含量顯著升高，磷酸化JNK（p-JNK）表達(dá)上調(diào)（P＜0．05或0．01）。GA作用16h后各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞MMP均明顯降低（均P＜0．05）。GA作用24h后實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞線粒體凋亡途徑相關(guān)蛋白Bax、Bak、Bik表達(dá)增加，而抗凋亡蛋白Bc l-2表達(dá)與空白對(duì)照組相比明顯下降（P＜0．05或0．01）。結(jié)論GA具有誘導(dǎo)H1975細(xì)胞凋亡的作用，其可能機(jī)制是上調(diào)細(xì)胞內(nèi)ROS含量，激活JNK信號(hào)通路，進(jìn)而引起MMP降低和線粒體凋亡途徑激活。

藤黃酸 肺癌H1975細(xì)胞 活性氧自由基 JNK信號(hào)通路 凋亡

目前，我國(guó)肺癌的發(fā)病率和病死率居惡性腫瘤第1位[1]。近30年來(lái)肺癌的手術(shù)治療、放化療、新輔助治療等取得了重大進(jìn)展，但總體治療效果仍不理想，ⅢA、ⅢB、Ⅳ期肺癌患者的5年生存率仍只有19.0%、7.0%和2.0%[2]。因此，尋找高效低毒的新型抗肺癌藥物對(duì)于提高中晚期患者的生存率具有重要意義。中藥藤黃取自藤黃科植物藤黃樹(shù)（Garcinia hanburyi Hook.F.）分泌的干燥樹(shù)脂，性寒，味酸、辛、澀，主治癰疽腫毒，頑癬惡瘡[3]。藤黃酸（GA）是中藥藤黃的主要活性成份，具有廣譜抗腫瘤活性，能夠有效抑制肺癌、肝癌、前列腺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌等腫瘤細(xì)胞的增殖，且未對(duì)機(jī)體造血細(xì)胞的功能造成影響[4-6]，但GA抑制肺癌細(xì)胞增殖的分子機(jī)制尚未完全闡明。本研究以人肺癌細(xì)胞H1975為對(duì)象，觀察GA對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用，并探討GA誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 藥物和細(xì)胞株 藤黃酸（C38H44O8，分子量628.76Da）購(gòu)自成都曼思特生物科技有限公司，以二甲基亞砜（DMSO）配成50mmol/L的母液，-20℃保存，應(yīng)用時(shí)以完全培養(yǎng)基稀釋至目標(biāo)濃度。人肺癌細(xì)胞株H1975購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。

1.2 主要試劑及儀器 MTT、DCFH-DA購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit和MitoScreen（JC-1）Kit購(gòu)自美國(guó)BD公司。兔抗人p-JNK、JNK、Bax、Bak、Bik、Bcl-2、cleaved caspase-9、cleaved caspase-3、cleaved PARP、β-actin多克隆抗體及HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體均購(gòu)于美國(guó)Cell Signaling Technology公司。ECL化學(xué)發(fā)光試劑購(gòu)自美國(guó)Thermo公司。iMark酶標(biāo)儀、蛋白電泳及轉(zhuǎn)印裝置、凝膠成像系統(tǒng)均為美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品，流式細(xì)胞儀為美國(guó)BD公司產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將H1975細(xì)胞置于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，放入37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.2 MTT法檢測(cè)GA對(duì)H1975細(xì)胞增殖的影響H1975細(xì)胞按5.0×103個(gè)/孔接種于96孔板，細(xì)胞貼壁后棄去上清液，各實(shí)驗(yàn)組分別加入100μl含0.5、1、2.5和5μmol/L GA的完全培養(yǎng)基，每組設(shè)3個(gè)平行孔，空白對(duì)照組加入等體積的完全培養(yǎng)基。藥物作用24h后，以MTT法分析GA對(duì)H1975細(xì)胞增殖的影響，酶標(biāo)儀測(cè)定各孔490nm處A值，細(xì)胞存活率（%）=實(shí)驗(yàn)組平均A值/空白對(duì)照組平均A值×100%，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)GA對(duì)細(xì)胞凋亡率的影響 H1975細(xì)胞按3×105個(gè)/孔接種于6孔板。細(xì)胞貼壁后，實(shí)驗(yàn)組分別加入GA濃度為1、2.5和5μmol/L的含藥培養(yǎng)基，空白對(duì)照組加入等體積的完全培養(yǎng)基，藥物作用24h后收集各組細(xì)胞。洗滌、重懸細(xì)胞后取100μl細(xì)胞懸液加入10μl Annexin V-FITC標(biāo)記液和10μl PI，混勻，室溫避光孵育15min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.3.4 DCFH-DA法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)ROS含量 細(xì)胞培養(yǎng)同上述，待細(xì)胞貼壁后，PBS洗滌2次，每孔加入1ml RPMI1640培養(yǎng)基稀釋的DCFH-DA（終濃度為10μmol/L），避光孵育30min。PBS洗滌2次，分別加入GA濃度為1、2.5和5μmol/L的含藥培養(yǎng)基和等體積的完全培養(yǎng)基。藥物作用2h后收集各組細(xì)胞，流式細(xì)胞儀在激發(fā)波長(zhǎng)488nm，發(fā)射波長(zhǎng)525nm下檢測(cè)細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度，分析細(xì)胞內(nèi)ROS含量。

1.3.5 JC-1探針?lè)治鯣A對(duì)細(xì)胞線粒體膜電位（MMP）的影響 細(xì)胞培養(yǎng)同上述，待細(xì)胞貼壁后，PBS洗滌2次，分別加入GA濃度為1、2.5和5μmol/L的含藥培養(yǎng)基和等體積的完全培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)16h，收集各組細(xì)胞，加入JC-1探針室溫避光孵育15min，洗滌2次，以488nm為激發(fā)波長(zhǎng)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)MMP的改變。

1.3.6 Western blot檢測(cè)JNK通路活性和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá) 細(xì)胞培養(yǎng)及藥物處理同上述。抽提GA作用2h和24h的各組細(xì)胞總蛋白，其中GA作用2h收集的蛋白檢測(cè)p-JNK、JNK，作用24h收集的蛋白檢測(cè)Bax、Bak、Bik、Bcl-2、cleaved caspase-9、cleaved caspase-3和cleaved PARP，以β-actin作為內(nèi)參照。上樣檢測(cè)，化學(xué)發(fā)光試劑顯色，膠片貼近曝光，顯影、定影后用凝膠成像系統(tǒng)掃描分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，多組樣本均數(shù)比較用單因素方差分析，兩組間比較用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 GA抑制H1975細(xì)胞增殖 MTT法檢測(cè)結(jié)果表明GA具有抑制H1975細(xì)胞增殖的作用，并呈劑量依賴性。0.5、1、2.5和5μmol/L的GA作用后各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞存活率分別為（91.8±5.1）%、（63.7±3.8）%、（31.5±4.8）%和（10.6±2.7）%，除0.5μmol/L組外，其余3組與空白對(duì)照組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05或0.01）。GA作用24h，對(duì)H1975細(xì)胞增殖抑制的IC50為1.6μmol/L。

2.2 GA誘導(dǎo)H1975細(xì)胞凋亡 Annexin V-FITC/PI雙染法結(jié)果提示，1、2.5和5μmol/L GA作用24h，H1975細(xì)胞早期凋亡率分別為25.2%、51.8%和75.1%，均高于空白對(duì)照組的早期凋亡率4.9%（均P＜0.05），見(jiàn)圖1。

圖1 GA對(duì)H1975細(xì)胞凋亡的影響（A：空白對(duì)照組；B：GA 1μmol/L；C：GA 2.5μmol/L；D：GA 5μmol/L）

進(jìn)一步采用Western blot法檢測(cè)GA作用24h后H1975細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)剪切型凋亡相關(guān)蛋白cleaved caspase-9、cleaved caspase-3和cleaved PARP表達(dá)水平與空白對(duì)照組相比均顯著上調(diào)（P＜0.05或0.01），見(jiàn)圖2。

圖2 GA對(duì)H1975細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.3 GA對(duì)H1975細(xì)胞內(nèi)ROS含量的影響 與空白對(duì)照組相比，1、2.5和5μmol/L的GA作用2h后，細(xì)胞內(nèi)ROS含量均明顯增加（均P＜0.05），且ROS含量隨GA濃度的增高而上升，表明GA以劑量依賴方式增加H1975細(xì)胞內(nèi)ROS的含量，見(jiàn)圖3。

圖3 GA對(duì)H1975細(xì)胞內(nèi)ROS含量的影響（A：空白對(duì)照組；B：GA 1μmol/L；C：GA 2.5μmol/L；D：GA 5μmol/L）

2.4 GA對(duì)H1975細(xì)胞內(nèi)JNK信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 Western blot結(jié)果提示，GA作用2h后H1975細(xì)胞內(nèi)p-JNK的表達(dá)水平隨藥物濃度增高而顯著上升，與空白對(duì)照組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05或0.01），但不同濃度GA作用后各實(shí)驗(yàn)組間的p-JNK表達(dá)水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），見(jiàn)圖4。

圖4 GA對(duì)H1975細(xì)胞內(nèi)JNK信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.5 GA對(duì)H1975細(xì)胞MMP的影響 GA作用16h后，H1975細(xì)胞MMP較空白對(duì)照組明顯降低，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＜0.05），且不同濃度GA作用后各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞MMP降低趨勢(shì)呈劑量依賴關(guān)系，見(jiàn)圖5。

2.6 GA對(duì)H1975細(xì)胞線粒體凋亡途徑相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 進(jìn)一步檢測(cè)GA作用24h后線粒體凋亡途徑相關(guān)蛋白Bax、Bak、Bik和Bcl-2表達(dá)的變化，發(fā)現(xiàn)JNK下游促凋亡靶基因Bax、Bak、Bik的蛋白表達(dá)隨GA濃度增加而增高，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)卻呈下降趨勢(shì)（P＜0.05或0.01），見(jiàn)圖6。

3 討論

GA是中藥藤黃的主要活性成份，作為一種多靶點(diǎn)抗腫瘤藥物，能通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和分化、抗腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移等多種途徑發(fā)揮抗腫瘤作用[7-8]。張洪明等[9]報(bào)道GA對(duì)人肺癌細(xì)胞SPC-A-1的增殖具有顯著的抑制作用，其分子機(jī)制與上調(diào)促凋亡蛋白p53的表達(dá)，激活caspase-9、caspase-10，啟動(dòng)凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)有關(guān)。但對(duì)與細(xì)胞增殖、凋亡密切相關(guān)的ROS-JNK信號(hào)通路在GA誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡中的作用尚無(wú)研究報(bào)道，本研究以人肺癌細(xì)胞H1975為研究對(duì)象，通過(guò)體外抗腫瘤活性評(píng)價(jià)及相關(guān)機(jī)制研究，證實(shí)GA可通過(guò)上調(diào)細(xì)胞內(nèi)ROS含量，激活JNK信號(hào)通路，進(jìn)而引起MMP降低和線粒體凋亡途徑激活，最終誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡。

圖5 GA對(duì)H1975細(xì)胞MMP的影響（A：空白對(duì)照組；B：GA 1μmol/L；C：GA 2.5μmol/L；D：GA 5μmol/L）

圖6 GA對(duì)H1975細(xì)胞線粒體凋亡途徑相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

細(xì)胞內(nèi)源性ROS含量增加被認(rèn)為是激活JNK的重要誘因[10]。Wang等[11]報(bào)道GA具有上調(diào)卵巢癌細(xì)胞株SKOV3內(nèi)源性ROS含量的作用，本研究也證實(shí)GA能夠上調(diào)肺癌細(xì)胞ROS含量。進(jìn)一步檢測(cè)下游應(yīng)激活化蛋白激酶JNK的磷酸化水平，證實(shí)GA具有激活JNK的作用。ROS可通過(guò)促進(jìn)絲裂原活化蛋白激酶激酶（MAPKK）家族中的凋亡調(diào)節(jié)信號(hào)激酶1（ASK1）的磷酸化，進(jìn)而激活JNK[12]；還可通過(guò)促進(jìn)谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（GST）寡聚化，導(dǎo)致GST/JNK復(fù)合體解離從而活化JNK[13]。GA上調(diào)內(nèi)源性ROS含量通過(guò)何種途徑激活JNK信號(hào)通路，以及GA激活JNK是否僅依賴于ROS的上調(diào)有待進(jìn)一步研究。

JNK信號(hào)通路的活化可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[14]，本研究亦發(fā)現(xiàn)H1975細(xì)胞凋亡率在GA干預(yù)后顯著上升?；罨腏NK可通過(guò)轉(zhuǎn)錄依賴的方式調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[15]，本研究證實(shí)GA干預(yù)后JNK下游促凋亡靶基因Bax、含有BH3結(jié)構(gòu)域家族的Bak、Bik蛋白表達(dá)上調(diào)，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)下降。正常細(xì)胞中，Bcl-2與Bax和線粒體膜本體蛋白Bak以異源二聚體形式存在，阻止Bax和Bak的寡聚化，從而維持MMP，抑制細(xì)胞色素C（Cyt C）的釋放。當(dāng)Bax、Bak與Bcl-2比例失衡，將導(dǎo)致電壓依賴的陰離子通道（VDAC）開(kāi)放和線粒體通透性轉(zhuǎn)化孔（PTP）形成，進(jìn)而引起MMP的降低和促凋亡內(nèi)容物，如Cyt C、細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因子（AIF）、細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因子核酸內(nèi)切酶G（Endo G）等的外漏[16-17]，Bik亦參與PTP的形成和促凋亡內(nèi)容物的釋放[17]。釋放的Cyt C與胞質(zhì)的凋亡肽酶激活因子-1（Apaf-1）形成復(fù)合物，暴露caspases募集結(jié)構(gòu)域（CARD），導(dǎo)致caspase-9發(fā)生二聚化，產(chǎn)生37kD的活性片段[18]。因此，本研究進(jìn)一步檢測(cè)了GA對(duì)MMP和cleaved caspase-9表達(dá)的影響，結(jié)果提示GA作用后MMP明顯降低、cleaved caspase-9表達(dá)顯著增加，證實(shí)線粒體凋亡途徑參與了GA誘導(dǎo)的肺癌細(xì)胞凋亡。

線粒體凋亡途徑的活化啟動(dòng)了caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)而完成caspase-3對(duì)底物PARP的剪切滅活[19]。本研究證實(shí)GA作用后，H1975細(xì)胞表達(dá)17、19kD的caspase-3活化片段增加，且隨著GA濃度增高而進(jìn)一步增加；同時(shí)其底物PARP被剪切成89kD的、不具有結(jié)合損傷DNA能力的片段，導(dǎo)致受PARP負(fù)調(diào)控的核酸內(nèi)切酶活性增高，降解核小體DNA引起細(xì)胞凋亡[20]。

綜上所述，GA通過(guò)增加H1975細(xì)胞內(nèi)源性ROS含量，激活JNK信號(hào)通路，導(dǎo)致促凋亡蛋白Bax、Bak、Bik與抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)失衡，進(jìn)而引起MMP降低和線粒體凋亡途徑激活，最終誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡。

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ObjectiveTo investigate the effec t of gambogic acid(GA)on apop tosis of human lung cancer H1975 cells and its mechanism s．a(chǎn)nd JNK signaling pathway in killing lung cancer cells by GA．MethodsHuman lung cancer H1975 cells were treated w ith GA(1,2．5 and 5μmol/L)．Cellp roliferation was analyzed by MTT assay;cellapop tosis was detected by Annexin V-FITC/PI doub le staining．The Reactive oxygen species(ROS)was measured by DCFH-DA method;the changes ofm itochond rialmemb rane potential(MMP)were detec ted by JC-1 p robe method;the activation of JNK signaling pathway and the exp ression ofm itochond rial apop tosis-related p roteins were detected by Western b lot．ResultsCompared w ith control g roup,the p roliferation of H1975 cells was inhibited by GA in a dose-dependentmanner(P＜0．05 or 0．01):the apop totic rates were increased by 25．2%,51．8%and 75．1%,after cells were treated w ith 1,2．5 and 5μmol/L of GA for 24h．The exp ression of c leaved caspase-9,c leaved caspase-3 and c leaved PARP in GA group were significantly higher than those in controlgroup in a dose-dependentmanner(P＜0．05 or 0．01)．Com pared w ith controlg roup,the ROS levels were significantly increased and the exp ression of phospho-JNK(p-JNK)was up-regulated after treated w ith GA for 2h．After treated by GA for 16 h,the MMP in GA g roup was dec reased significantly com pared w ith the controlg roup(P＜0．05)．GA increased the exp ression of p ro-apop totic p rotein Bax,Bak,Bik and dec reased the exp ression of p ro-survival p rotein Bc l-2(P＜0．05 or 0．01)．ConclusionGambogic acid can induce the apop tosis of human lung cancer H1975 cells through up-regulating the intracellular levelof ROS to activate JNK signaling pathway,the latter triggers loss of MMP and activation ofm itochond ria apop tosis pathways．

Gambogic acid Lung cancer H1975 cell Reactive oxygen species JNK signaling pathway Apop tosis

2013-10-24）

（本文編輯：胥昀）

浙江中醫(yī)藥大學(xué)校級(jí)課題（2014ZY13）

310003 杭州，浙江大學(xué)附屬第一醫(yī)院心胸外科（何蕾、呂望、泮輝、胡堅(jiān)，何蕾系浙江大學(xué)碩士研究生，現(xiàn)在浙江國(guó)際旅行衛(wèi)生保健中心工作）；浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室（王寶輝）

胡堅(jiān)，E-mail：hujian_1@yahoo.com.cn