去甲斑蝥素對(duì)人胰腺癌PANC-1細(xì)胞凋亡作用的研究

張日沅 林勝璋 陳翀 王盈盈 徐賢綢

去甲斑蝥素對(duì)人胰腺癌PANC-1細(xì)胞凋亡作用的研究

張日沅 林勝璋 陳翀 王盈盈 徐賢綢

目的探討去甲斑蝥素對(duì)人胰腺癌PANC-1細(xì)胞凋亡的作用及其機(jī)制。方法將PANC-1細(xì)胞株隨機(jī)分為處理組和對(duì)照組，處理組加入不同濃度的去甲斑蝥素培養(yǎng)24h后，CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況；流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞的凋亡情況；免疫印跡法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)；熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和凋亡相關(guān)蛋白m RNA表達(dá)。結(jié)果不同濃度去甲斑蝥素處理PANC-1細(xì)胞24h后，與對(duì)照組相比，能降低細(xì)胞的存活率并誘導(dǎo)其凋亡。與對(duì)照組相比，處理組中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平均上調(diào)（均P＜0．05），同時(shí)其m RNA的表達(dá)水平亦均上調(diào)（均P＜0．05）。結(jié)論去甲斑蝥素能明顯抑制人胰腺癌PANC-1細(xì)胞的生長(zhǎng)并誘導(dǎo)其凋亡，并且具有濃度依賴性，這一作用可能是通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的凋亡途徑實(shí)現(xiàn)的。

胰腺癌 去甲斑蝥素 凋亡 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

胰腺癌是一種惡性程度極高的消化道腫瘤，其起病隱襲，病情進(jìn)展迅速，且早期診斷率低，預(yù)后差[1]。近年來(lái)尋找新型的抗腫瘤藥是治療腫瘤的趨勢(shì)[2]。體內(nèi)外研究證實(shí)中藥單體能高效、安全地抑制腫瘤細(xì)胞增殖，并且無(wú)肝腎功能損害，不引起骨髓抑制還能增強(qiáng)免疫功能。本研究探討中藥單體去甲斑蝥素抗胰腺癌的機(jī)制，為其治療胰腺癌提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料 去甲斑蝥素（美國(guó)Sigma公司）；人胰腺癌細(xì)胞系PANC-1（中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)）；胎牛血清（杭州四季青公司）；青霉素-鏈霉素（北京索萊寶科技有限公司）；DMEM培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司）；細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒（CCK-8 kit）（日本Dojindo公司）；Annexin VFITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（美國(guó)BioVision公司）；小鼠抗人GADD153抗體、小鼠抗人ATF4抗體、兔抗人GRP78抗體（英國(guó)Abcam公司）；兔抗人phospho-PERK（Thr980）抗體、兔抗人phospho-eIF2α（Ser51）抗體、兔抗人cleaved caspase-3（Asp175）抗體、兔抗人β-tubulin抗體（美國(guó)CST公司）。

1.2 方法

1.2.1 PANC-1細(xì)胞培養(yǎng) PANC-1細(xì)胞在含10%滅活胎牛血清、100U/ml青霉素、100μg/m l鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，于37℃、5%二氧化碳條件下培養(yǎng)。使用容積為60ml、培養(yǎng)面積為25cm2的斜頸帶濾膜的培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，盛約5ml的完全培養(yǎng)基。細(xì)胞呈單層貼壁生長(zhǎng)，生長(zhǎng)至80%～90%時(shí)傳代。

1.2.2 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期PANC-1細(xì)胞，接種于96孔培養(yǎng)板中常規(guī)培養(yǎng)。每孔總體積100μl，細(xì)胞培養(yǎng)24h后加藥物處理，分對(duì)照組（0.1%DMSO溶液）和處理組；處理組再根據(jù)添加的去甲斑蝥素濃度分為A組（10μmol/L）、B組（50μmol/L）、C組（75μmol/L）、D組（100μmol/L）、E組（150μmol/L）、F組（200μmol/L）；每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24h。然后每孔加入10μl的CCK-8溶液和100μl不含血清的培養(yǎng)基，培養(yǎng)4h，酶標(biāo)儀測(cè)A450值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算24h細(xì)胞存活率[細(xì)胞存活率=（處理組A450值-空白調(diào)零A450值）/（對(duì)照組A450值-空白調(diào)零A450值）×100%]。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期PANC-1細(xì)胞，接種于6孔培養(yǎng)板中常規(guī)培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)24h后加藥物處理分組（分組法同前），實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。將細(xì)胞重懸于500μl Binding buffer中，加入5μl Annexin V-FITC和10μl PI，室溫下避光孵育5min后在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行檢測(cè)。流式細(xì)胞儀激發(fā)光波長(zhǎng)用488 nm，用一波長(zhǎng)為515nm的通帶濾器檢測(cè)FITC熒光，另一波長(zhǎng)＞560nm的濾器檢測(cè)PI。

1.2.4 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 于6孔板中收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期PANC-1細(xì)胞，藥物處理分組（分組法同前），細(xì)胞裂解液作用后，提取細(xì)胞總蛋白，采用BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，之后將PVDF膜置于5%脫脂奶粉中室溫封閉1.5 h，并置于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和凋亡相關(guān)蛋白GRP78、phospho-PERK、phospho-eIF2α、ATF4、GADD153、cleaved caspase-3和內(nèi)參蛋白β-tubulin中參與免疫反應(yīng)，最后化學(xué)發(fā)光、顯影、定影，膠片掃描，以各蛋白與β-tubulin灰度比值表示蛋白表達(dá)水平。

1.2.5 熒光定量PCR 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期PANC-1細(xì)胞，接種于6孔培養(yǎng)板中常規(guī)培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后加藥物處理分組（分組法同前）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。進(jìn)行RNA提取以及RNA濃度的測(cè)定，采用美國(guó)Fermentas公司的RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，采用日本Toyobo公司的SYBR Green Realtime PCR Master Mix-Plus-試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)基因表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，多組間比較采用方差分析，組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 各組PANC-1細(xì)胞24h存活率、凋亡率的比較 見(jiàn)表1。

表1 各組PANC-1細(xì)胞24h存活率、凋亡率的比較（%）

由表1可見(jiàn)，除A組外，處理組與對(duì)照組的細(xì)胞24h存活率、凋亡率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；并且，去甲斑蝥素對(duì)PANC-1細(xì)胞24h存活率的半抑制濃度約100μmol/l。

2.2 Western blot檢測(cè)各組PANC-1細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平 見(jiàn)圖1、表2。

圖1 Western blot檢測(cè)各組PANC-1細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平電泳圖

由圖1可見(jiàn)，處理組較對(duì)照組Western blot結(jié)果蛋白表達(dá)灰度高。由表2可見(jiàn)，除A組外，處理組較對(duì)照組GRP78、phospho-eIF2α、phospho-PERK、ATF4、cleaved caspase-3蛋白的表達(dá)水平均上調(diào)（均P＜0.05）；除A、B、C組外，D、E、F組較對(duì)照組GADD153蛋白的表達(dá)水平均上調(diào)（均P＜0.05）。

2.3 各組PANC-1細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和凋亡相關(guān)蛋白mRNA表達(dá)水平比較 見(jiàn)表3。

由表3可見(jiàn)，除A組外，處理組與對(duì)照組比較，PANC-1細(xì)胞GRP78、phospho-eIF2α、phospho-PERK、ATF4、cleaved caspase-3mRNA的表達(dá)水平均上調(diào)（均P＜0.05）；除A、B、C組外，D、E、F組較對(duì)照組GADD153 mRNA的表達(dá)水平亦均上調(diào)（均P＜0.05）。

表2 各組PANC-1細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較

表3 各組PANC-1細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和凋亡相關(guān)蛋白mRNA表達(dá)水平比較

3 討論

去甲斑蝥素是從傳統(tǒng)中藥中提取并經(jīng)人工合成的一種新型低毒的抗腫瘤藥物，具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性和獨(dú)特的升高血白細(xì)胞作用。去甲斑蝥素抑制肝癌和結(jié)腸癌等腫瘤細(xì)胞的增殖,可能機(jī)制是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[3-4]，但對(duì)于其抗胰腺癌作用的機(jī)制仍沒(méi)有完全的認(rèn)識(shí)。本研究觀察了去甲斑蝥素對(duì)人胰腺癌PANC-1細(xì)胞增殖和凋亡的影響，結(jié)果顯示，去甲斑蝥素對(duì)PANC-1細(xì)胞的生長(zhǎng)有明顯抑制作用，并呈濃度依賴關(guān)系。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示去甲斑蝥素可通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而發(fā)揮抑制PANC-1細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。

介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的途徑很多，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的凋亡途徑是一種新的凋亡途徑[5-7]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是各種分泌蛋白和膜蛋白合成與折疊的一種細(xì)胞器。多種生理或病理情況下，例如蛋白質(zhì)糖基化的抑制、蛋白質(zhì)不能形成正常的二硫鍵結(jié)合、突變蛋白表達(dá)以及氧化還原狀態(tài)的改變等均會(huì)引起未折疊蛋白或錯(cuò)誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)聚集，損傷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的正常生理功能，稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）[8]。發(fā)生ERS時(shí)，細(xì)胞內(nèi)GRP78結(jié)合未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)，誘發(fā)非折疊蛋白反應(yīng)，激活ERK/eIF2α/ ATF4、ATF6和IRE-1/XBP-1 3條信號(hào)途徑，增強(qiáng)對(duì)蓄積在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)的處理能力，以利于維持細(xì)胞的正常功能[9]。其中，GRP78是ERS的標(biāo)志性特異分子。如果細(xì)胞損傷太過(guò)嚴(yán)重或時(shí)間太過(guò)長(zhǎng)久，內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定不能及時(shí)恢復(fù)，ERS可以激活下游的凋亡信號(hào)分子GADD153，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而去除受損傷的細(xì)胞[10]。以此假設(shè)：去甲斑蝥素亦可通過(guò)ERS介導(dǎo)的凋亡途徑誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡。Western blot和熒光定量PCR結(jié)果顯示，去甲斑蝥素明顯上調(diào)GRP78蛋白和基因的表達(dá)水平，并且GRP78上調(diào)的水平和細(xì)胞凋亡的水平一致。此外Western blot結(jié)果還顯示，ERS的其他反應(yīng)蛋白，如磷酸化PERK、磷酸化eIF2α和ATF4在經(jīng)去甲斑蝥素處理PANC-1細(xì)胞中表達(dá)明顯增高。這些結(jié)果表明ERS在去甲斑蝥素誘導(dǎo)的PANC-1細(xì)胞凋亡中起了重要作用。

綜上所述，本研究顯示去甲斑蝥素對(duì)PANC-1細(xì)胞具有生長(zhǎng)抑制和凋亡誘導(dǎo)的作用，其可能的機(jī)制是去甲斑蝥素可通過(guò)ERS介導(dǎo)的凋亡途徑誘導(dǎo)PANC-1細(xì)胞凋亡。此結(jié)果對(duì)去甲斑蝥素在抗胰腺癌的臨床應(yīng)用及其機(jī)制研究有指導(dǎo)作用。本實(shí)驗(yàn)僅在體外條件下研究了去甲斑蝥素對(duì)人胰腺癌PANC-1細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制和凋亡誘導(dǎo)作用及其機(jī)制，還需完成在動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。

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ObjectiveTo investigate the effect of norcantharidin on human panc reatic cancer PANC-1 cells． Methods PANC-1 cells were cultured w ith 0．1%DMSO and norcantharid in(0,10,50,75,100,150,200μmol/L)for24h．The grow th inhibitory effectwas observed by using CCK-8,cellapop tosis was determ ined by flow cytometry(FCM)．The exp ressions of endop lasm ic reticulum stress(ERS)markers were detected byWestern b lot,exp ressions ofGRP78 and GADD153m RNAwere detected by real-time PCR afterexposure to norcantharid in．ResultsCCK-8 assay showed thatnorcantharidin significant inhibited the grow th of PANC-1 cells．Apop tosis rates of PANC-1 cells treated w ith norcantharid in were significantly higher than those of control g roup．Western b lotanalysis showed that norcantharidin up-regulated ERSmarkers(P＜0．05)．Real-time PCR showed that the exp ression ofGRP78 and GADD153mRNA in PANC-1 cells treated w ith norcantharid in was higher than thatof controlgroup(P＜0．05)．ConclusionNorcantharid in can inhibit the g row th of human pancreatic cancer PANC-1 cells and induce cell apop tosis．ERS-mediated apop tosis pathwaymay be involved in norcantharid in-induced apop tosis in pancreatic cancer PANC-1 cells．

Pancreatic cancer Norcantharid in Apop tosis Endop lasm ic reticulum stress

2014-03-26）

（本文編輯：李媚）

325027 溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院普外科（張日沅、林勝璋，張日沅為研究生，現(xiàn)在平陽(yáng)縣人民醫(yī)院普外科工作）；平陽(yáng)縣人民醫(yī)院普外科（陳翀、王盈盈、徐賢綢）

張日沅，E-mail：pyzry2013@163.com