大腸桿菌TorS/TorR二組分體應(yīng)答蛋白TorR對DNA復(fù)制起始的影響

姚遠，喬佳鑫，李靜，李慧，莫日根

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大腸桿菌TorS/TorR二組分體應(yīng)答蛋白TorR對DNA復(fù)制起始的影響

姚遠，喬佳鑫，李靜，李慧，莫日根

內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，呼和浩特 010021

二組分體作為一種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)在細菌中普遍存在，能夠感知外界環(huán)境變化并做出應(yīng)答。細菌中CckA/CtrA、ArcA/ArcB和PhoP/PhoQ二組分體與DNA復(fù)制起始和細胞分裂相關(guān)，但目前還未見TorS/TorR二組分體對細胞周期及DNA復(fù)制影響的相關(guān)報道。大腸桿菌TorS/TorR二組分體能夠監(jiān)測細胞周圍氧化三甲胺(Trimethylamine oxide, TMAO)的濃度變化，但其是否影響DNA復(fù)制起始呢？文章利用流式細胞儀檢測了Δ和Δ突變體菌株的復(fù)制式樣。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Δ突變菌株每個細胞復(fù)制起始原點數(shù)目和倍增時間與野生型細胞一致，而Δ突變菌株每個細胞復(fù)制起始原點數(shù)目多于野生型細胞，說明復(fù)制起始發(fā)生時間比野生型細胞早。但是過表達TorR蛋白或者共同表達TorS和TorR蛋白都不能使Δ突變體表型恢復(fù)為野生型表型。而在野生型和Δ突變細胞中過表達SufD蛋白能使復(fù)制起始提早發(fā)生，在Δ和Δ雙突變細胞中復(fù)制起始延遲。所以，TorR可能通過改變基因的表達來間接影響染色體復(fù)制起始。

TorS/TorR二組分體；應(yīng)答蛋白TorR；DNA復(fù)制；大腸桿菌

細菌時時刻刻都被各種分子所包圍，這些分子或者來自于周圍環(huán)境，或者來自于細菌本身的代謝產(chǎn)物。所以，細菌要想保證自身存活和繁殖，就必須做出應(yīng)答來適應(yīng)周圍不斷變化的環(huán)境。而這些應(yīng)答途徑的激活大多都是先接受一個外界信號分子的刺激，然后激活特異性基因的轉(zhuǎn)錄。在細菌中，由結(jié)合于細胞膜的組氨酸激酶(Histidine kinase)和其相互協(xié)作的應(yīng)答蛋白(Response regulator)組成的二組分體(Two-component system)可以感知溫度、滲透壓和pH值等環(huán)境變化，從而激活(或抑制)靶基因表達，使細胞做出相應(yīng)的應(yīng)答[1]。二組分體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通過以下步驟來實現(xiàn)：接受外界信號刺激的組氨酸激酶將ATP上磷酸基團轉(zhuǎn)移到其特定的組氨酸殘基上，相繼磷酸基團會被轉(zhuǎn)移到應(yīng)答蛋白的天冬氨酸殘基，磷酸化會引起應(yīng)答蛋白構(gòu)型的改變，從而影響其與靶基因啟動子結(jié)合的能力[2]，由此誘導(dǎo)細胞對環(huán)境變化做出反應(yīng)。

大腸桿菌TorS/TorR二組分體中TorS是一個跨膜的組氨酸蛋白激酶，TorS通過N-末端特異性感知細胞外環(huán)境中的氧化三甲胺(Trimethylamine oxide, TMAO)濃度，并使自身His443位點磷酸化，依次將磷酸基團傳遞到自身Asp723和C-末端的His850位點，最終轉(zhuǎn)移到TorR接收區(qū)域的Asp53位點。磷酸化的TorR蛋白可以誘導(dǎo)操縱子的表達，從而應(yīng)答細胞周圍TMAO的濃度變化[3]。

研究表明，細菌中CckA/CtrA、ArcA/ArcB和PhoP/PhoQ二組分體與DNA復(fù)制起始和細胞分裂相關(guān)[4~6]。但目前還未見TorS/TorR二組分體對細胞周期及DNA復(fù)制影響的相關(guān)報道。本文發(fā)現(xiàn)，相對野生型細胞，Δ突變細胞的復(fù)制起始提早發(fā)生，但在Δ突變細胞中，過量表達TorR不能使Δ突變表型恢復(fù)。進一步研究表明，TorR可能通過調(diào)節(jié)基因的表達量來間接影響DNA復(fù)制起始。

1 材料和方法

1.1 菌株與質(zhì)粒

本研究使用的所有菌株均為K-12。野生型菌株BW25113和其派生的::R、::R、::R、::R、::R、::R、::R、::R、::R、::R缺失突變菌株由美國亞利桑那州立大學(xué)施一燊博士惠贈。pACYC177[7]和pcDNA3-mCherry[8]質(zhì)粒由本實驗室保存，p、p[9]和pUHE21- 2lac[10]質(zhì)粒由施一燊博士惠贈。

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)粒構(gòu)建

將基因連同其自身的啟動子利用一對特異性引物(正向：5￠-CCGCTCGAGTTGCTCGCTTCC-AGTTTG-3￠；反向：5￠-CGGGATCCTGTCAGCCC-ACC-GATTTT-3￠)，以BW25113基因組DNA為模板進行PCR擴增，擴增得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)Ⅰ和HⅠ限制性內(nèi)切酶消化后連接到同樣用這兩種酶消化后的pACYC177片段上，獲得p過表達質(zhì)粒(圖1A)。為了構(gòu)建TorR-mCherry融合表達質(zhì)粒，先將基因連其自身啟動子同時缺失終止密碼子的片段利用特異性引物(正向：5￠-CCCAAGCTTG-CGCCAGTACCGACCAACG-3￠；反向：5￠-CGGGGT-ACCGCACACATCAGCGGCTAAG-3￠)以BW25113菌株基因組DNA為模板經(jīng)過PCR擴增，得到兩端分別帶有dⅢ和Ⅰ酶切位點的片段。然后，利用特異性引物(正向：5￠-CGGGGTACCGTGAGC-AAGGGCGAGGA-3￠；反向：5￠-CGGGATCCTTACT-TGTACAGCTCGTCCATGC-3￠)以pcDNA3-mCherry質(zhì)粒為模板經(jīng)過PCR擴增，得到兩端分別帶有Ⅰ和HⅠ酶切位點的片段。將上述兩條片段經(jīng)過相應(yīng)限制性內(nèi)切酶的消化、連接，獲得-片段，之后將其插入到pACYC177質(zhì)粒的dⅢ和HⅠ限制性內(nèi)切酶位點間，構(gòu)建了融合表達質(zhì)粒p-mCherry(圖1B)。根據(jù)基因的開放閱讀框(ORF)序列設(shè)計引物(正向：5￠-CG-GGATCCGTGAGTAAACGTTATTTTGTCACCGG-3￠；反向：5￠-CCCAAGCTTCTACAACAAGGCAAGGTT-TATGTAC-3￠)，以BW25113基因組DNA為模板進行PCR擴增，隨后用HⅠ和dⅢ限制性內(nèi)切酶消化，并連接到pUHE21-2lac質(zhì)粒啟動子序列之后，獲得p質(zhì)粒，的表達需要IPTG誘導(dǎo)(圖1C)。p和p質(zhì)粒來源于ASKA庫，其或由IPTG誘導(dǎo)表達。

構(gòu)建好的質(zhì)粒由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進行測序。利用NCBI(www.ncbi.nim.nih.gov/)在線分析軟件進行序列比對，發(fā)現(xiàn)插入的基因未發(fā)生突變，質(zhì)粒構(gòu)建正確。

1.2.2 雙突變菌株的構(gòu)建

先將Δ突變菌株的卡那霉素抗性刪除[11]，之后利用P1轉(zhuǎn)導(dǎo)構(gòu)建得到ΔΔ雙突變菌株[12]，本文共得到23個雙突變菌株，隨機選取4個單菌落，利用PCR和流式細胞儀檢測方法對其進行驗證，證明所得到的雙突變菌株構(gòu)建正確。

1.2.3 細胞倍增時間(Doubling time)的測定

將過夜培養(yǎng)的菌液按照1:10000倍數(shù)在ABTGcasa培養(yǎng)基[13]中稀釋，然后轉(zhuǎn)入37℃水浴搖床中培養(yǎng)。每隔15 min檢測活體細胞數(shù)目，用紫外分光光度計(Shimadzu, UV-1800)測量值(ABTGcasa培養(yǎng)基450)，記錄相應(yīng)的時間。如果質(zhì)粒需要IPTG誘導(dǎo)表達，在450≈0.03時加入終濃度為0.1 mmol/L的IPTG。450≈0.04開始，450≈0.5結(jié)束。測得的值取底數(shù)為2的log值，與時間差(min)分別為橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)，用Microsoft EXCEL作圖得到細胞生長曲線，線性方程的斜率即為細胞倍增時間。重復(fù)3次，得到的平均值為菌株在ABTGcasa培養(yǎng)基上的細胞倍增時間，比較野生型與突變體的細胞倍增時間。

1.2.4 流式細胞儀測定復(fù)制式樣和相對熒光強度

在ABTGcasa培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)細胞至對數(shù)生長期，在450≈0.15時加入利福平(300 μg/mL)和先鋒霉素(10 μg/mL)，繼續(xù)讓細胞生長3~4代。利福平能夠抑制新的復(fù)制起始，但允許已經(jīng)開始的復(fù)制繼續(xù)進行，先鋒霉素能夠阻止細胞分裂。收集細胞用70%乙醇固定，用Tris-HCl buffer(pH7.5)洗滌細胞，之后用Hoechst 33258 DNA染料染色30 min，用流式細胞儀(BD LSRFortessa)測定DNA復(fù)制式樣，具體方法和原理見文獻[14]。檢測相對熒光強度的樣品與測定復(fù)制式樣的樣品相同，利用流式細胞儀PE-Texas Red通道檢測mCherry的相對熒光強度。

1.2.5 熒光顯微鏡樣品的制備及觀察

熒光顯微鏡樣品與流式細胞儀檢測樣品的處理與制備方法相同，取10 μL固定樣品制片，利用熒光顯微鏡(蔡司Axio Imager A2)觀察，濾光片43(chroma filter sets 43，Carl Zeiss)觀察mCherry。同時用AxioCam MRc5相機拍照。最后使用AxioVision Rel. 4.8軟件進行數(shù)據(jù)分析和圖片處理。

圖1 過表達質(zhì)粒構(gòu)建

A：p質(zhì)粒構(gòu)建。圖中黑色長方形代表基因的開放閱讀框序列，灰色長方形代表基因啟動子。利用PCR擴增出基因及其自身啟動子的片段經(jīng)過Ⅰ和HⅠ消化連接到pACYC177質(zhì)粒上，經(jīng)過改造的質(zhì)粒具有氨芐青霉素抗性基因。B：p-mCherry質(zhì)粒構(gòu)建。圖中黑色長方形代表基因的開放閱讀框序列(ORF)，灰色長方形代表基因啟動子，白色長方形代表基因，經(jīng)過改造的質(zhì)粒具有氨芐青霉素抗性基因。C：p質(zhì)粒構(gòu)建。圖中黑色長方形代表基因的ORF區(qū)域，插入到pUHE21-2lac質(zhì)粒中HⅠ和dⅢ酶切位點之間，并位于啟動子(p)之后，具有氨芐青霉素和氯霉素抗性基因。

2 結(jié)果與分析

2.1 ΔtorR和ΔtorS突變菌株的鑒定

為了鑒定Δ和Δ突變菌株的正確性，本文分別以和基因的ORF序列為模板在基因內(nèi)部設(shè)計特異性引物，擴增大小合適的片段來檢測相應(yīng)基因是否被敲除。利用特異性引物(正向：5￠-GGATTGACCGTATTGTTGG-3￠；反向：5￠-GG-TGGCATTTGTGACGAA-3￠)，分別以BW25113和Δ菌株基因組DNA為模板，擴增基因內(nèi)部262 bp片段(圖2A)。利用特異性引物(正向：5￠-TAA-TGAGCGGACGGGTGA-3￠；反向：5￠-TGGGTTAGC-GGGTTATCTT-3￠)，分別以BW25113和Δ菌株基因組DNA為模板，擴增基因內(nèi)部490 bp片段(圖2B)。如圖2A所示，利用野生型BW25113基因組DNA(陽性對照)為模板進行目的基因的擴增，有明顯的目的條帶，以ddH2O(陰性對照)為模板進行擴增，未見到目的條帶，利用Δ菌株基因組DNA為模板進行目的片段擴增，也未檢測到目的條帶。圖2B以Δ菌株基因組DNA為模板進行目的基因的擴增，并未檢測到目的條帶。以上結(jié)果證明，本文所獲得的缺失突變菌株構(gòu)建正確。

2.2 torR基因的缺失導(dǎo)致DNA復(fù)制起始的提早發(fā)生

為了檢測TorR對DNA復(fù)制起始的影響，將野生型、Δ和Δ細胞在ABTGcasa培養(yǎng)基中培養(yǎng)到對數(shù)期，加入利福平(300 μg/mL)和先鋒霉素(10 μg/mL)培養(yǎng)細胞3~4代。經(jīng)Hoechst 33258 DNA染料染色后，用流式細胞儀檢測野生型、Δ和Δ突變細胞的復(fù)制式樣。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)野生型菌株主要有2、4、8條染色體的細胞，而在Δ突變體中只發(fā)現(xiàn)4、8條染色體的細胞，而且其細胞倍增時間(30 min)比野生型細胞(32 min)短，說明TorR缺失導(dǎo)致復(fù)制起始的提早發(fā)生[14](圖3)。但是，Δ突變菌株和野生型細胞的復(fù)制式樣基本相同(圖3)，其細胞倍增時間和野生型細胞同為32 min，顯然，TorS的缺失并不改變DNA復(fù)制起始和細胞倍增時間。這些結(jié)果說明，Δ突變菌株復(fù)制起始提早發(fā)生不是因為TorS/TorR二組分體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑阻斷所引起。

圖2 突變菌株的鑒定

A：Δ突變菌株的鑒定。泳道1、3~5：利用野生型BW25113基因組DNA(陽性對照)為模板進行目的基因的擴增；泳道2：陰性對照；泳道6~8：利用Δ菌株基因組DNA為模板進行目的片段擴增。B：Δ突變菌株的鑒定。泳道1：陰性對照；泳道2：陽性對照，以野生型BW25113基因組DNA為模板進行目的片段的擴增；泳道3：以Δ菌株基因組DNA為模板進行目的基因的擴增。

2.3 質(zhì)粒表達的TorR蛋白不能將ΔtorR突變表型恢復(fù)為野生型表型

將pACYC177和p過表達質(zhì)粒利用CaCl2法分別轉(zhuǎn)化到Δ突變體和野生型細胞中，按圖3中所述方法，用流式細胞儀測定兩者的染色體復(fù)制式樣(圖4)。結(jié)果表明，pACYC177不會影響野生型和Δ突變菌株的復(fù)制式樣(圖4：A，B)，在野生型和Δ突變菌株中過量表達TorR也不能改變其DNA復(fù)制式樣(圖4：C，D)。

2.4 TorR-mCherry融合蛋白的表達也不能恢復(fù)ΔtorR突變表型

基于用p質(zhì)粒轉(zhuǎn)化不能使Δ突變細胞改變其復(fù)制起始提早發(fā)生的表型，本文推測p質(zhì)?？赡懿槐磉_TorR蛋白。因此，本文構(gòu)建了能夠表達TorR-mCherry融合蛋白的表達質(zhì)粒p-mCherry，-基因的表達受啟動子的控制。為了驗證p質(zhì)粒表達TorR蛋白，而p-mCherry表達TorR-mCherry融合蛋白，首先將p-mCherry質(zhì)粒利用CaCl2轉(zhuǎn)化法引入Δ突變菌株中，隨后用流式細胞儀和熒光顯微鏡檢測mCherry的表達情況(圖5A)、表達量(圖5C)及Δ/p-mCherry菌株的復(fù)制式樣(圖5B)。如圖5A所示，細胞有明顯的紅色熒光，說明TorR-mCherry蛋白在細胞中有表達；流式細胞儀PE-Texas Red熒光通道也檢測到了mCherry發(fā)出的特異性熒光信號(圖5C)，而在對照質(zhì)粒p中未檢測到任何信號。這些結(jié)果說明p和p-mCherry質(zhì)粒分別表達有TorR蛋白和TorR- mCherry融合蛋白。然而，由p-mCherry質(zhì)粒表達的TorR-mCherry融合蛋白依然不能使Δ突變的提早復(fù)制起始表型恢復(fù)為野生型表型(圖5B)。

圖3 ΔtorR缺失突變引起DNA復(fù)制起始提早發(fā)生

處在對數(shù)生長期的細胞(ABTGcasa培養(yǎng)基)中加入利福平和先鋒霉素繼續(xù)培養(yǎng)3~4代后用70%酒精固定細胞。Hoechst 33258進行染色后，用流式細胞儀對細胞所含的染色體數(shù)目進行測定。橫坐標(biāo)表示每個細胞所含染色體數(shù)目，縱坐標(biāo)表示細胞數(shù)目。每個測定包含了10 000個細胞。

圖4 過量表達TorR蛋白不能恢復(fù)ΔtorR突變表型

樣品處理和測定方法如圖3所述，橫坐標(biāo)表示每個細胞所含染色體數(shù)目，縱坐標(biāo)表示細胞數(shù)目。A，B：野生型菌株或者Δ突變菌株中轉(zhuǎn)入空質(zhì)粒pACYC177并不會影響復(fù)制式樣。C，D：野生型菌株或者Δ突變菌株中轉(zhuǎn)入p質(zhì)粒，過表達TorR不能影響其復(fù)制式樣。每個測定包含了10 000個細胞。

2.5 共表達TorR和TorS蛋白也不能使ΔtorR突變表型恢復(fù)為野生型表型

為什么過表達TorR不能恢復(fù)Δ突變表型？是否由于細胞內(nèi)TorS含量不足而不能有效磷酸化TorR，進而導(dǎo)致該二組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路受阻？為了探討以上問題，本文將質(zhì)粒p和p共轉(zhuǎn)化到Δ突變菌株中，用流式細胞儀檢測其DNA復(fù)制式樣。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，同時過表達TorR和TorS蛋白不能使其DNA復(fù)制樣式改變，即與Δ突變細胞一樣，共表達TorR和TorS蛋白的Δ菌株仍然以含4、8條染色體的細胞為主(圖6)，其原因仍不清楚。

圖5 質(zhì)粒表達的TorR-mCherry融合蛋白不能恢復(fù)ΔtorR突變表型

A：熒光顯微鏡下觀察TorR-mCherry融合蛋白的亞細胞定位。圖中標(biāo)尺為1 μm，紅色表示TorR-mCherry。B：Δ突變菌株過量表達TorR-mCherry蛋白的DNA復(fù)制式樣，樣品處理方法如圖3所述。橫坐標(biāo)表示每個細胞所含染色體數(shù)目，縱坐標(biāo)表示細胞數(shù)目。每個測定包含10 000個細胞。C：利用流式細胞儀測定Δ/p-mCherry菌株中TorR-mCherry的相對熒光強度值。橫坐標(biāo)表示mCherry相對熒光強度，縱坐標(biāo)表示所測定的細胞數(shù)目。

圖6 共同表達TorR和TorS蛋白不能恢復(fù)ΔtorR突變的表型

樣品處理和測定方法如圖3中描述，橫坐標(biāo)表示每個細胞所含染色體數(shù)目，縱坐標(biāo)表示細胞數(shù)目。：野生型細胞復(fù)制式樣；Δ：Δ突變細胞的復(fù)制式樣；Δ/p/p：Δ突變細胞共表達TorR和TorS蛋白后的DNA復(fù)制式樣。p質(zhì)粒IPTG誘導(dǎo)濃度為0.1 mmol/L，每個測定包含10 000個細胞。

2.6 sufD和bioD基因缺失導(dǎo)致DNA復(fù)制起始滯后

研究表明，基因的缺失影響多個基因的表達，包括、、、、、、和等[15]。所以，TorR蛋白可能通過調(diào)節(jié)這些基因的表達來間接影響DNA復(fù)制起始。為了驗證這個推測，本文利用流式細胞儀分別檢測了Δ、Δ、Δ、Δ、Δ、Δ、Δ和Δ突變細胞的DNA復(fù)制式樣。如圖7所示，除了Δ和Δ缺失突變體的復(fù)制式樣不同于野生型細胞外，其余突變菌株的復(fù)制式樣與野生型并無明顯差異。Δ和Δ缺失突變體與野生型相比，缺少含8條染色體的細胞，這說明和基因的缺失會引起DNA復(fù)制起始延遲。

2.7 SufD蛋白過量表達引起DNA復(fù)制起始提早發(fā)生

在Δ缺失突變菌株中，基因的表達量高于野生型細胞[15]，此時DNA復(fù)制起始早于野生型細胞。因此，基因表達量的高低可能與DNA復(fù)制起始時間有直接聯(lián)系。本文分別在野生型菌株和Δ缺失突變菌株中過量表達SufD蛋白，用流式細胞儀檢測其復(fù)制式樣。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相較于野生型細胞，/p和Δ/p菌株DNA復(fù)制起始發(fā)生的時間都有明顯提前(圖8)。與/p細胞比較，Δ/p菌株有更多的細胞有8條染色體，說明缺失TorR和過表達SufD的效果是累加的。而過表達BioD并不明顯改變Δ缺失突變體細胞的DNA復(fù)制式樣(圖9)。

圖7 sufD基因缺失導(dǎo)致DNA復(fù)制起始延遲

樣品處理和測定方法如圖3中描述，野生型菌株和突變體菌株在圖中已經(jīng)標(biāo)出，橫坐標(biāo)表示每個細胞所含染色體數(shù)目，縱坐標(biāo)表示細胞數(shù)目。每個測定包含了10 000個細胞。

2.8 ΔtorRΔsufD雙突變會引起DNA復(fù)制起始延遲

利用P1轉(zhuǎn)導(dǎo)法[12]，構(gòu)建了ΔΔ雙突變體，并按圖3中所述方法檢測復(fù)制式樣，發(fā)現(xiàn)ΔΔ雙突變體中只存在含有2、4條染色體的細胞(圖10)，與野生型細胞相比其DNA復(fù)制起始延遲，與Δ單突變細胞的復(fù)制式樣一致，說明對DNA復(fù)制起始而言，SufD蛋白的作用獨立于TorR蛋白。以上結(jié)果支持TorR蛋白通過調(diào)節(jié)基因表達間接影響DNA復(fù)制起始。

3 討 論

本研究表明，Δ突變細胞的復(fù)制起始相較野生型細胞會提早發(fā)生，而Δ突變細胞的復(fù)制式樣與野生型相同。并且在Δ突變細胞中，不論過量表達TorR，還是共同表達TorR和TorS蛋白，都不能使Δ突變表型恢復(fù)。前人研究表明，基因能夠進行自我調(diào)控，即當(dāng)細胞中TorR過量時，不論TorR是否被磷酸化，都會結(jié)合到基因啟動子的上，阻斷的轉(zhuǎn)錄[16]，這或許可以解釋過量表達TorR并不能在互補實驗中看到表型恢復(fù)的結(jié)果。SufD蛋白與SufB和SufC蛋白共同形成復(fù)合體，參與鐵硫簇的組裝[17]。當(dāng)細胞中缺乏SufD蛋白時，會引起復(fù)制起始延遲，而SufD過表達則使細胞復(fù)制起始提早發(fā)生，有研究表明基因缺失會導(dǎo)致基因的表達提高[15]。因此，TorR可能通過調(diào)節(jié)基因的表達量來影響鐵硫簇的組裝從而間接調(diào)控DNA復(fù)制起始。而SufD蛋白或者鐵硫簇如何調(diào)控DNA復(fù)制還需要進一步探究。本文還發(fā)現(xiàn)Δ缺失突變導(dǎo)致DNA復(fù)制起始延遲。而在細胞中基因表達量低于野生型細胞[15]，但其DNA復(fù)制起始提早發(fā)生，也就是說，基因的低表達并未導(dǎo)致復(fù)制起始提早發(fā)生。另外，在Δ缺失突變細胞中過表達BioD也未見復(fù)制式樣的改變，這些結(jié)果建議TorR并不通過基因表達來影響DNA復(fù)制起始。

圖8 過量表達SufD蛋白引起DNA復(fù)制起始提早發(fā)生

樣品處理和測定方法如圖3中描述，野生型菌株，突變體菌株和質(zhì)粒在圖中已經(jīng)標(biāo)出，p質(zhì)粒IPTG誘導(dǎo)濃度為0.1 mmol/L，橫坐標(biāo)表示每個細胞所含染色體數(shù)目，縱坐標(biāo)表示細胞數(shù)目。每個測定包含了10 000個細胞。

圖9 過量表達BioD蛋白不能恢復(fù)ΔtorR突變表型

樣品處理和測定方法如圖3中描述，p質(zhì)粒IPTG誘導(dǎo)濃度為0.1 mmol/L，橫坐標(biāo)表示每個細胞所含染色體數(shù)目，縱坐標(biāo)表示細胞數(shù)目。每個測定包含了10 000個細胞。

圖10 ΔtorRΔsufD雙突變會引起DNA復(fù)制起始延遲

樣品處理和測定方法如圖3中描述，橫坐標(biāo)表示每個細胞所含染色體數(shù)目，縱坐標(biāo)表示細胞數(shù)目。每個測定包含了10 000個細胞。

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(責(zé)任編委: 何群)

The effects of TorR protein on initiation of DNA replication in

Yuan Yao, Jiaxin Qiao, Jing Li, Hui Li, Morigen

The two-component systems, which could sense and respond to environmental changes, widely exist in bacteria as a signal transduction pathway. The bacterial CckA/CtrA, ArcA/ArcB and PhoP/PhoQ two-component systems are associated with initiation of DNA replication and cell division, however, the effects of the TorS/TorR system on cell cycle and DNA replication remains unknown. The TorS/TorR system incan sense changes in trimethylamine oxide (TMAO) concentration around the cells. However, it is unknown if it also affects initiation of DNA replication. We detected DNA replication patterns in Δand Δmutant strains by flow cytometry. We found that the average number of replication origins (s) per cell and doubling time in Δmutants were the same while the average number ofs in Δmutantswas increased compared with that in wild-type cells. These results indicated that absence of TorR led to an earlier initiation of DNA replication than that in wild-type cells. Strangely, neither overexpression of TorR nor co-expression of TorR and TorS could restore Δmutant phenotype to the wild type. However, overexpression of SufD in both wild type and Δmutants promoted initiation of DNA replication, while mutation of SufD delayed it in Δmutants. Thus, TorR may affect initiation of DNA replication indirectly through regulating gene expression of.

TorS/TorR two-component system; the response regulator TorR; DNA replication;

2014-09-01;

2014-09-30

國家自然科學(xué)基金項目(編號：31360208)，內(nèi)蒙古自然科學(xué)基金重大開放項目(編號：20102009)和內(nèi)蒙古大學(xué)人才引進科研啟動基金資助項目(編號：SPH-IMU, Z20090107)資助

姚遠，在讀博士研究生，專業(yè)方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)。E-mail:zhjyq129@163.com

莫日根，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)，DNA復(fù)制與細胞周期。E-mail: morigenm@life.imu.edu.cn

10.16288/j.yczz.14-291

2015-1-5 10:50:43

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20150105.1050.001.html