日本七鰓鰻物種特異性microRNAs及其前體的識(shí)別與驗(yàn)證

劉欣，張潔，趙春暉，李鐵松，王繼紅，李慶偉

?

日本七鰓鰻物種特異性microRNAs及其前體的識(shí)別與驗(yàn)證

劉欣1,2，張潔1,2，趙春暉1,2，李鐵松1,2，王繼紅1,2，李慶偉1,2

1. 遼寧師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，大連 116081；2. 遼寧師范大學(xué)七鰓鰻研究中心，大連 116081

MicroRNAs(miRNAs)對(duì)參與多種生物代謝過(guò)程的基因在轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平進(jìn)行負(fù)調(diào)控。近年來(lái)，隨著深度測(cè)序及芯片技術(shù)的應(yīng)用，有關(guān)miRNA的發(fā)現(xiàn)和功能分析在植物和動(dòng)物中得到廣泛研究。文章利用第二代測(cè)序技術(shù)對(duì)日本七鰓鰻()白細(xì)胞的小RNA進(jìn)行了高通量測(cè)序，共得到5 207 787條小RNA序列，其中4 739 346條序列可以拼接為10 989種miRNA變體?；谛蛄邢嗨菩苑治?，發(fā)現(xiàn)這10 989個(gè)變體序列與306個(gè)已知的保守miRNA家族成員序列相匹配；其中，6個(gè)保守miRNA家族成員呈極高豐度表達(dá)，表明miRNA在物種間具有保守性。70個(gè)未注釋序列被預(yù)測(cè)為新的miRNA。通過(guò)miRNA微陣列技術(shù)鑒定與驗(yàn)證了34個(gè)新預(yù)測(cè)的miRNA在免疫處理的日本七鰓鰻白細(xì)胞中表達(dá)，其中16個(gè)miRNA前體的最低折疊自由能系數(shù)大于0.85，說(shuō)明日本七鰓鰻存在特異性miRNA。這些物種特異性miRNAs的存在可能在日本七鰓鰻的白細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育和對(duì)疾病的反應(yīng)中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。

日本七鰓鰻；物種特異性miRNA；高通量測(cè)序；基因芯片

20世紀(jì)90年代，Lee等[1]首次在線蟲(chóng)()中發(fā)現(xiàn)一種內(nèi)源的、長(zhǎng)約22nt的非編碼小RNA，命名為lin-4；lin-4通過(guò)RNA-RNA的相互作用方式參與對(duì)線蟲(chóng)胚胎后期發(fā)育基因lin-14的調(diào)控。2000年，Reinhart等[2]在中又發(fā)現(xiàn)了第二個(gè)長(zhǎng)約21nt的非編碼小RNA——let-7，作為時(shí)序調(diào)控基因lin-14、lin-28、lin-41、lin-42和daf12的開(kāi)關(guān)基因，let-7失活或過(guò)表達(dá)可導(dǎo)致線蟲(chóng)幼蟲(chóng)的滯育或早熟。

2001年，Lagos-Quintana等[3]從果蠅()和人體中克隆了49個(gè)類(lèi)似線蟲(chóng)lin-4的小RNA基因，并把它們正式定名為microRNA (miRNA)；研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物存在的這些新的miRNA在序列上高度保守。至2001年底，多個(gè)研究小組通過(guò)直接對(duì)小RNA克隆和測(cè)序從各種動(dòng)物中鑒別出數(shù)百個(gè)miRNA基因[4,5]。之后，隨著多種模式生物基因組測(cè)序工作的相繼完成使得全基因組搜索miRNA成為可能[6]。結(jié)合分子克隆和計(jì)算機(jī)識(shí)別方法，在動(dòng)物[7~9]、植物[10~14]甚至病毒中[15,16]確定了成千上萬(wàn)的miRNA基因，僅在人類(lèi)就驗(yàn)證了2558個(gè)miRNAs (http://www.mirbase.org/cgi-bin/bro-wse.pl?org=hsa)[17]。對(duì)部分miRNAs的功能研究分析提示：miRNAs參與生命過(guò)程中一系列的重要進(jìn)程，包括發(fā)育進(jìn)程[2]、細(xì)胞增殖與凋亡[18]、脂肪代謝[19]、造血過(guò)程[20]、生殖干細(xì)胞自我更新[21]及腫瘤發(fā)生[22]等。

隨著第二代高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，已在越來(lái)越多的物種中發(fā)現(xiàn)了新的miRNA基因[23~26]。七鰓鰻屬于圓口綱、七鰓鰻目，是迄今為止最原始的無(wú)頜類(lèi)脊椎動(dòng)物，是現(xiàn)存脊椎動(dòng)物亞門(mén)中最古老的物種[27]。長(zhǎng)久以來(lái)，七鰓鰻在進(jìn)化上因聯(lián)系著脊椎動(dòng)物與無(wú)脊椎動(dòng)物而具有極高的研究?jī)r(jià)值。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)七鰓鰻miRNA的研究很少，僅見(jiàn)Heimberga等[28]于2010年采用小RNA測(cè)序和基因組檢索方法對(duì)海七鰓鰻()、普氏七鰓鰻()和盲鰻()的miRNA進(jìn)行了識(shí)別和鑒定，并以七鰓鰻和盲鰻的miRNAs作為保守的遺傳標(biāo)記對(duì)它們之間的系統(tǒng)演化地位進(jìn)行了討論。由于miRNA具有種間保守性、組織表達(dá)特異性和時(shí)序性，本文運(yùn)用高通量測(cè)序以及基因芯片技術(shù)在日本七鰓鰻()免疫激發(fā)后的白細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)和鑒定免疫組織中表達(dá)保守的miRNA以及物種特異性miRNA，以期對(duì)未來(lái)探索miRNA在其免疫應(yīng)答過(guò)程中的調(diào)控作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

日本七鰓鰻捕獲自黑龍江省松花江流域同江地區(qū)，活體置于實(shí)驗(yàn)室水族箱馴養(yǎng)(2~5℃)。1周后選取32條無(wú)外傷、健康的個(gè)體(體長(zhǎng)35~55 cm) ，以腹腔注射100 μL復(fù)合抗原進(jìn)行免疫刺激。復(fù)合抗原用50 mmol/L磷酸緩沖液(pH7.0) 配制，含大腸桿菌(DH5ɑ) (TaKaRa, Dalian)、滅活的金黃色葡萄球菌() (TaKaRa, Dalian) 和啤酒酵母菌() (市售)各1×107個(gè)/mL。經(jīng)過(guò)3次加強(qiáng)免疫(每周1次) ，末次免疫后3 d斷尾取血，采用ficoll密度梯度離心法進(jìn)行單核白細(xì)胞分離[29]。

1.2 日本七鰓鰻小RNA測(cè)序及分析

使用RNAiso Reagent (TaKaRa, Dalian)提取日本七鰓鰻白細(xì)胞總RNA，在獲得符合測(cè)序標(biāo)準(zhǔn)的總RNA樣本后，委托深圳華大基因股份有限公司構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)并用Illumina GA IIx進(jìn)行測(cè)序及分析。經(jīng)Solexa測(cè)序，獲得35nt序列，通過(guò)去接頭、去低質(zhì)量、去污染、統(tǒng)計(jì)序列長(zhǎng)度分布等過(guò)程完成初級(jí)分析。將初級(jí)分析得到的序列按照文獻(xiàn)[30]中的生物信息分析流程及分析軟件(包括BLAST和華大基因自主開(kāi)發(fā)的分析軟件Tag2annotation)進(jìn)行分類(lèi)注釋?zhuān)@得樣品中包含的各種RNA及表達(dá)量信息。將其中miRNA片段與miRBase17.0中所有動(dòng)、植物的miRNA成熟序列進(jìn)行比對(duì)進(jìn)行注釋?zhuān)y(tǒng)計(jì)在樣品中出現(xiàn)的miRNA家族(不分物種)、序列及其數(shù)量。余下的未注釋片段以近緣種海七鰓鰻(.)基因組(http://asia.ensembl.org/Petromyzon_marinus/Info/ Index)為參考基因組進(jìn)行新miRNA及其前體的預(yù)測(cè)。預(yù)測(cè)軟件采用華大基因自主開(kāi)發(fā)的分析軟件MIREAP (http://sourceforge.net/projects/mireap/)[30]。利用mFOLD軟件(http://mfold.rit.albany.edu/?q= mfold/ Structure-display-and-free-energy-determination)計(jì)算獲得莖環(huán)結(jié)構(gòu)的最小折疊自由能(MFE，ΔG值(kcal/ mol))。以最小自由能量指數(shù)(MFEI，MFEI =(MFE/前體序列長(zhǎng)度)×100/(G%+C%))大于0.85為鑒定miRNA前體的標(biāo)準(zhǔn)[31]。

1.3 miRNA基因芯片實(shí)驗(yàn)與分析

miRNA的定制基因芯片檢驗(yàn)工作委托美國(guó)LC Sciences公司進(jìn)行實(shí)驗(yàn)與分析。在μParaflo[32]微流體芯片上，每條檢測(cè)探針使用PGR(photogenerated reagent)化學(xué)法進(jìn)行原位合成。被檢測(cè)目標(biāo)選自miRBase中幾種低等脊椎動(dòng)物的miRNA(如海七鰓鰻301條；佛羅里達(dá)文昌魚(yú)()189條；斑馬魚(yú)()248條；鉛點(diǎn)東方鲀()109條；玻璃海鞘()511條；非洲爪蟾()168條；囊舌蟲(chóng)()114條)以及在日本七鰓鰻中預(yù)測(cè)的新miRNA 70條。雜交后檢測(cè)使用標(biāo)記特異性的Cy5熒光染料。利用激光掃描儀(GenePix 4000B，Molecular Device)采集雜交圖像并使用Array-Pro圖像分析軟件(Media Cybernetics)進(jìn)行圖像數(shù)字化轉(zhuǎn)換。數(shù)據(jù)分析首先是減除背景值，然后使用LOWESS過(guò)濾(Locally-Weighted Regression)進(jìn)行信號(hào)歸一化[33]。被列為可檢測(cè)的轉(zhuǎn)錄子必須至少符合兩個(gè)條件：信號(hào)強(qiáng)度>3×(背景標(biāo)準(zhǔn)偏差)并且點(diǎn)變異系數(shù)(spot)<0.5。值通過(guò)計(jì)算(標(biāo)準(zhǔn)偏差)/(信號(hào)強(qiáng)度)獲得。只有當(dāng)超過(guò)50%的重復(fù)探針的信號(hào)值大于檢測(cè)水平，才認(rèn)為該轉(zhuǎn)錄子可以被檢測(cè)[33]。

2 結(jié)果與分析

2.1 小RNA測(cè)序結(jié)果

通過(guò)高通量測(cè)序，最終獲得日本七鰓鰻各種小RNA分子數(shù)量見(jiàn)表1。共獲得5 207 787個(gè)小RNA讀數(shù)(Read)，其中miRNA有4 739 346個(gè)讀數(shù)，占91%，拼接后可歸為10 989種一致序列片段。有7.54%的小RNA片段屬于未注釋的未知序列，還有少量的轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(tRNA，0.74%)、核糖體RNA(rRNA，0.66%)、小核RNA(snRNA，0.05%)和核仁小RNA (snoRNA，0.01%)等，說(shuō)明測(cè)序結(jié)果較好。日本七鰓鰻miRNA成熟序列的長(zhǎng)度和其他物種一樣，大部分(占總數(shù)的87.66%)集中在20~24nt之間(圖1)。

2.2 保守miRNA家族表達(dá)譜

通過(guò)與數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，上述10 989條miRNA一致序列被注釋為306個(gè)保守miRNA家族的不同變體。其中201個(gè)保守miRNA家族的各個(gè)變體表達(dá)豐度之和小于10個(gè)讀數(shù)，說(shuō)明大多數(shù)(65.7%)保守miRNA為低豐度表達(dá)；75個(gè)保守miRNA家族的各個(gè)變體表達(dá)豐度之和介于10~1 000之間，屬于中豐度表達(dá)；30個(gè)miRNA家族的表達(dá)豐度高于1 000個(gè)讀數(shù)(表2)，從編號(hào)可以看出它們絕大多數(shù)為最先被發(fā)現(xiàn)的miRNA家族(15個(gè)編號(hào)小于100，9個(gè)編號(hào)小于200)。這30個(gè)家族共包括9 560個(gè)miRNA變體，由4 729 961個(gè)讀數(shù)組成，分別占保守miRNA家族(共10 989條miRNA)一致序列的87.0%和總讀數(shù)(4 739 346)的99.8%。其中，let-7、miR-146、miR-184、miR-143、miR-30、miR-142等6個(gè)家族的miRNA表達(dá)豐度均超過(guò)10萬(wàn)個(gè)讀數(shù)，占總讀數(shù)的94.1%。這些結(jié)果表明，極少數(shù)保守miRNA家族的成員呈極高豐度表達(dá)，反映出miRNA在物種間具有保守性。

表1 高通量測(cè)序獲得七鰓鰻小片段RNA種類(lèi)及數(shù)量

圖1 七鰓鰻miRNA成熟序列核苷酸分布情況

表2 日本七鰓鰻高豐度表達(dá)的miRNA家族

2.3 七鰓鰻新miRNA的預(yù)測(cè)及驗(yàn)證

利用高通量測(cè)序未注釋的小RNA片段，用華大基因自主構(gòu)建的miRNA及其前體預(yù)測(cè)軟件MIREAP共預(yù)測(cè)得到70個(gè)新的miRNA成熟序列。通過(guò)定制芯片微陣列分析驗(yàn)證(表3)，有35個(gè)預(yù)測(cè)的新miRNA成熟序列的檢測(cè)信號(hào)符合信號(hào)強(qiáng)度大于基值的3倍且點(diǎn)變異系數(shù)(spot CV)小于0.5這兩個(gè)檢測(cè)條件，說(shuō)明它們是真實(shí)存在的。

從表3中可見(jiàn)，有8種預(yù)測(cè)的物種特異性miRNA (Ljm-058、Ljm-037、Ljm-016、Ljm-073、Ljm-004、Ljm-049、Ljm-023和Ljm-065)的信號(hào)強(qiáng)度高于1 000，占23.5%；尤其是Ljm-058、Ljm-037和Ljm-073不僅芯片檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度高，而且在測(cè)序檢測(cè)中讀數(shù)值也高。信號(hào)強(qiáng)度介于100~1 000之間的有16個(gè)物種特異性miRNA，占47.1%。信號(hào)強(qiáng)度小于100的有10個(gè)，占29.4%。由此可見(jiàn)，大多數(shù)預(yù)測(cè)的物種特異性miRNA在受抗原免疫激發(fā)后的日本七鰓鰻免疫細(xì)胞中均有較高水平的表達(dá)。

對(duì)新預(yù)測(cè)的物種特異性miRNAs，其鑒定還需要預(yù)測(cè)是否存在能折疊成較穩(wěn)定的發(fā)卡結(jié)構(gòu)的前體序列的支持。根據(jù)海七鰓鰻基因組數(shù)據(jù)，預(yù)測(cè)的物種特異性的miRNA的成熟和前體序列以及前體序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)(GenBank序列登錄號(hào)：KJ031059~ KJ031093)見(jiàn)表4。這些miRNA前體的最小折疊自由能介于-19.7 kcal/mol~-49.56 kcal/mol之間，最小折疊自由能系數(shù)介于0.48~1.64之間。有16個(gè)miRNA前體的最小折疊自由能系數(shù)大于0.85。

表3 日本七鰓鰻新miRNA候選序列的定制miRNA芯片分析驗(yàn)證

注：加粗的探針表示該探針?biāo)鶛z測(cè)的信號(hào)強(qiáng)度滿足文中設(shè)定的兩個(gè)檢測(cè)條件。

表4 日本七鰓鰻新miRNA序列及其二級(jí)結(jié)構(gòu)

續(xù)表

新預(yù)測(cè)miRNAmiRNA成熟及前體序列二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Mfe(kcal/mol)MfeI Ljm-028-3pGATGGTGATAGGTGCAGTGCTGCAAGTTACTCTTTTGATGAAATTACATAGTGATTTGTGATTGCGGGCTACTGAGGCAGATTCCAT.((((.(((..((.(((((((((((.((((...((..(((......)))...))...)))))))).))).))))..))..)))))))-30.20.81 Ljm-030-3pTCCAGTGCTGGAAGCTTCTGCAGGGAACGGACTTCACTCAGCTGAGTTGACGCGACTGAATTGATTCAACTCCTTGAAGAAGCTCCCAGCAGGTGG.(((.((((((.(((((((.((((((...((..(((.((((.((.(....).)).))))..))).))...)))))).))))))).))))))..)))-38.20.75 Ljm-031-3pAATCTTCATTTGAAGCTTTCGTGACTGCAGGAATCCATACTCTTTGGCTCTTTCGGTAAAGTCACGTAGGCTCATCCCCTGAT.(((......(((.((((.(((((((((.((((.(((.......)))...)))).))..))))))).)))))))......)))-21.70.59 Ljm-033-5pCTTTGGTTATTTCGGTAAAGTCACGTAGGTGCAAATTTCGGATTCCAGTACCTACGTGACTTTACCGAAAGAACCAAAGA((((((((.(((((((((((((((((((((((...............))))))))))))))))))))))).)))))))).-49.561.5 Ljm-034-3pCTTTGGTTCTTTCGGTAAAGTCGCGTAGGTACAACATGAAATAAATCACGTTATTTCGAACCTACGTGACTTTACCGAATGAACCAAAGA(((((((((.((((((((((((((((((((......((((((((......)))))))).)))))))))))))))))))).))))))))).-50.91.64 Ljm-037-5pCGCGCGGGGGAAAAGTGCAAATAGTGGTAGGTAGTGATCACTGCCGTCTGCCTACTCCATTTGCATTTTGGCCTCCGTGCGT((((((((((.(((((((((((.(..((((((((((........)).))))))))..))))))))))))..)))))))))).-46.41.03 Ljm-039-5pTTATACAGGTAACGAGCTGAGATTAGGAGAACGCTCTTAAAGGGAGTGCTCCTAAACTCAGCTTGTTACCTGTATAAA(((((((((((((((((((((.(((((((..((((((.....))))))))))))).))))))))))))))))))))).-51.81.62 Ljm-040-5pACACGTATATACCGGATTATAAGACGCACCCGCACATCATTTCCTTTAAAACGCAGGGGAAACGTGCGCCTGATGATCCGGTGAACATGGTC...(((.(.(((((((((((.((.(((((..........((((((((.......)))))))).))))).)).))))))))))).).)))...-29.20.65 Ljm-041-5pGTTGCCCATTACGGATCTGGCTTCTGAGGCTAGCAACCACTGCGTTGAGGCTAGCAACCGCTGCGTTGCT((.((.((...(((..((((((((.((.((.((......)))).))))))))))...))).)).)).)).-19.20.48 Ljm-044-5pTGTCCCGCTGAGGTCAGGATGGGCAGCAATGCGTGACTAGATCCTGTATTGCACTCGTCCCGGCCTTAGCGAGATT.(((.((((((((((.(((((((..((((((((.((.....)).)))))))).))))))).)))))))))).))).-40.70.95 Ljm-047-3pTTTTTTTCTATCTACATGACTTTACCGAAAGAAACAAAAAATATGAATTCCATACTCTTTGGTTCTTTCGGTAAAGTCATGTAGGTACAGTGAGGGAA.((((((((((((((((((((((((((((((((.((((.(.((((.....)))).).)))).)))))))))))))))))))))))))....)))))))-441.38 Ljm-049-5pTCAATGTAAACACCCTACACTCTCAGCTGTGCGCCATTGGTTAGCTGGGAGTGGGGTGTTTATGTTGACTGCCTTA(((((((((((((((..((((((((((((...(((...))))))))))))))))))))))))))))))........-40.31.09 Ljm-053-5pCACCGTAGCAGCACGTAAATATTGGAGTGTGAACTCTGCGATTCCAGTATTTCGTGCTGCTGCTGTGCGGTGGG.....((((((((((.((((((((((((((.......)).))))))))))))))))))))))............-38.80.98 Ljm-057-5pCCCACATGGTGTTGGACCAGATGACGCCACATGGTCTCACATGGTGCTGGACCAGATGACGTCACATGGTTCCACATGGTGTTGGA((.((((.((((.((((((..(((((.((..(((((((((...)))..))))))..)).)))))..)))))).)))).)))).)).-400.85 Ljm-058-5pCGTGCATTGTTAAAGTGCAGATAGTGGTAGTTGGTCCTAAAAATGACAGCTACTCTATTTACACTTTAAACACTGTGCGG((..((.((((((((((.((((((.((((((((.((........)))))))))))))))).)))))).)))).))..)).-31.80.99 Ljm-061-3pAGACAATACCTCAGAATTGTCAGGGTGCTCAGCAATCCGCACCTGACAGTGCTGGGGTTTAGTCTCAGCAGAC((((...(((((((.(((((((((.(((..........)))))))))))).)))))))...))))........-31.50.83 Ljm-063-5pTGCGCATCAGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACATCCATCTTGTAGCGAACGACCTACAGCGAACTGAGATACCTACGGCGTG.((((.(((((...((((...(((..((((((..(((.........))).))))))..))).))))..)))))..........)))).-27.30.54 Ljm-065-5pGGCTGTGCGATGAGGTAGTAGTTGTATAGTTTTTTGGGTGCAATCCCAAACGGGTAACTGTACAATCTACTGTCTTTCCCACGGCTT(((((((.((.(((..(((((((((((((((.((((((......)))))).....)))))))))).)))))..))))).))))))).-39.30.98 Ljm-066-3pGCGCGATGCCTGCCGTTTCGATCCCCGTGCCGGGAAGCTTCTTCGGGAACTGCACGTGGAGCGAAATGTTTGGCGTCACGTCG(((.((((((...(((((((.(((.(((((.(.((((...)))).....).))))).))).)))))))...)))))).)))..-35.50.68 Ljm-072-5pTTAGATCTTGTGGTGGACCTGGATGAGACAGAGTACTGAGATCGGGTCTCTCTTAAGCCCTCCACACGGTTTAT.((((((.(((((.((.(..(((.(((((.((.........))..))))))))...).)).))))).)))))).-27.10.75 Ljm-073-5pGCGAGGGTGATGTAAACATCTCAACTGGAAGCTGTGACGTCAGTAAAGGCTTTCAGTTAGGTGTTCACGTCAGCACGCTAC(((..(.((((((.(((((((.(((((((((((...((....))...)))))))))))))))))).)))))).).)))...-38.60.97

注：miRNA前體序列中加粗的部分為成熟序列；miRNA前體序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)中，“.”表示頸環(huán)區(qū)堿基，“(”和“)”表示互補(bǔ)的堿基；Mfe為最小折疊自由能，MfeI為最小折疊自由能系數(shù)。

3 討 論

miRNAs是重要的基因表達(dá)調(diào)節(jié)因子，它們通過(guò)在轉(zhuǎn)錄后水平抑制特異的靶基因表達(dá)來(lái)行使功能。最近的研究表明，miRNA在哺乳動(dòng)物先天免疫和適應(yīng)性免疫兩大系統(tǒng)中具有獨(dú)特的表達(dá)譜，在免疫細(xì)胞的發(fā)育和功能的調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用[34]。近年來(lái)，一種平行于脊椎動(dòng)物適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的以可變淋巴受體為特征的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)在七鰓鰻中被發(fā)現(xiàn)[35]，拓寬了關(guān)于適應(yīng)性免疫系統(tǒng)起源與進(jìn)化的研究視野。目前，對(duì)無(wú)頜類(lèi)免疫系統(tǒng)免疫應(yīng)答機(jī)制方面的研究還不多見(jiàn)，尤其是關(guān)于七鰓鰻miRNA在免疫應(yīng)答過(guò)程中的調(diào)控角色及其功能研究，在國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，開(kāi)展七鰓鰻免疫組織中miRNA的基礎(chǔ)研究將對(duì)未來(lái)探索miRNA在其免疫應(yīng)答過(guò)程中的調(diào)控作用奠定基礎(chǔ)。

高通量測(cè)序技術(shù)的興起，大大降低了基因組學(xué)研究的時(shí)間和成本，同樣為編碼及非編碼RNA的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究的快速發(fā)展提供了可能。本文通過(guò)對(duì)日本七鰓鰻單個(gè)核白細(xì)胞的miRNA進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)少數(shù)保守的miRNA家族(let-7、miR-146、miR-184、miR-143、miR-30、miR-142)在七鰓鰻免疫組織中呈現(xiàn)極高豐度表達(dá)。let-7最早在線蟲(chóng)中被發(fā)現(xiàn)，能夠調(diào)控細(xì)胞的分化和增殖的時(shí)序[2]；人miR-146可以調(diào)控干細(xì)胞的增殖和遷移[36]；miR-184可調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)育與凋亡[37]；miR-143與鼠胚胎干細(xì)胞向心臟祖細(xì)胞的分化調(diào)控有關(guān)[38]；miR-30調(diào)節(jié)爪蟾前腎的發(fā)育過(guò)程[39]；miR-142能夠調(diào)節(jié)造血干細(xì)胞的分化[40]。這些保守miRNA家族都具有調(diào)控細(xì)胞增殖和分化的功能，推測(cè)在七鰓鰻免疫系統(tǒng)免疫應(yīng)答過(guò)程中，它們對(duì)免疫細(xì)胞的活化、分化、增殖的調(diào)控過(guò)程也應(yīng)該起重要作用。

本文測(cè)序結(jié)果顯示，除了物種間保守的miRNA家族外，尚發(fā)現(xiàn)七鰓鰻物種特異性miRNA的存在。對(duì)物種特異性miRNA的鑒定需要有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的支持，因此本文采用高通量的定制芯片對(duì)候選的70個(gè)miRNA進(jìn)行了檢測(cè)。從芯片驗(yàn)證結(jié)果看，有34個(gè)候選的miRNA在免疫處理后的日本七鰓鰻單個(gè)核白細(xì)胞中的表達(dá)情況被有效檢出，但有些miRNA的芯片檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度與測(cè)序?qū)嶒?yàn)檢測(cè)到的讀數(shù)豐度不匹配(表3)。Ljm-004、Ljm-016、Ljm-023、Ljm-049及Ljm-065芯片檢測(cè)信號(hào)較強(qiáng)，但測(cè)序讀數(shù)豐度較低。另外，有些在測(cè)序檢驗(yàn)時(shí)較高豐度表達(dá)的miRNA(Ljm-026、Ljm-041和Ljm-044)在芯片檢測(cè)時(shí)信號(hào)較低。究其原因可能和分別送到測(cè)序和芯片測(cè)試公司的總RNA樣本在提取時(shí)間、提取的個(gè)體方面存在的差異所致。有研究認(rèn)為，在高通量測(cè)序結(jié)果中，必須有 10 個(gè)拷貝以上的表達(dá)量(不含變體的表達(dá)量)來(lái)支持該小RNA的表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)[41]。但本研究發(fā)現(xiàn)，測(cè)序讀數(shù)低于10的8種預(yù)測(cè)的物種特異的miRNA在利用定制芯片檢測(cè)時(shí)都能被有效檢測(cè)出來(lái)，并且Ljm-016、Ljm-018、Ljm-023和Ljm-072的檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度均在500以上，說(shuō)明miRNA表達(dá)具有時(shí)效性。盡管目前利用qPCR作為miRNA檢測(cè)的工具具有準(zhǔn)確、靈敏等優(yōu)點(diǎn)，但定制芯片檢測(cè)技術(shù)在通量和實(shí)驗(yàn)成本上無(wú)疑為物種特異性miRNA的驗(yàn)證提供了高效和快速的通道。

對(duì)所預(yù)測(cè)的miRNA的鑒定還要以其是否存在能折疊成較穩(wěn)定的發(fā)卡結(jié)構(gòu)的前體序列來(lái)確定。前體序列的預(yù)測(cè)一般需要該物種基因組數(shù)據(jù)的支持。由于目前還未進(jìn)行日本七鰓鰻基因組的測(cè)序，本文曾嘗試?yán)玫诙鷾y(cè)序技術(shù)獲得的該物種白細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行前體預(yù)測(cè)，許多新預(yù)測(cè)的miRNA也不能得到完全定位，分析原因可能是測(cè)序深度和覆蓋度不夠[42]。由于海七鰓鰻為日本七鰓鰻近緣物種，序列一致性一般在93%以上，有些保守基因甚至能達(dá)到100%一致性[45]，因此本研究采用海七鰓鰻的基因組數(shù)據(jù)作為參考基因組進(jìn)行特異性miRNAs的前體鑒定。從預(yù)測(cè)結(jié)果看，在所預(yù)測(cè)的物種特異性miRNA的前體序列中，有16個(gè)最小折疊自由能系數(shù)達(dá)到0.85以上，說(shuō)明這16個(gè)物種特異性miRNA符合新miRNA鑒定標(biāo)準(zhǔn)[46]。另外的18個(gè)候選miRNA的成熟miRNA可被芯片檢測(cè)驗(yàn)證，但所預(yù)測(cè)的前體序列的最小折疊自由能系數(shù)均小于0.85這個(gè)閾值，可能是由于海七鰓鰻基因組數(shù)據(jù)的組裝程度較低(覆蓋率80%左右)而形成許多缺口，導(dǎo)致不能準(zhǔn)確定位所致[43]。

[1] Lee RC, Feinbaum RL, Ambros V. Theheterochronic geneencodes small RNAs with antisense complementarity to., 1993, 75(5): 843?854.

[2] Reinhart BJ, Slack FJ, Basson M, Pasquinelli AE, Bettinger JC, Rougvie AE, Horvitz HR, Ruvkun G. The 21-nucleotideRNA regulates developmental timing in., 2000, 403(6772): 901?906.

[3] Lagos-Quintana M, Rauhut R, Lendeckel W, Tuschl T. Identification of novel genes coding for small expressed RNAs., 2001, 294(5543): 853?858.

[4] Lee RC, Ambros V. An extensive class of small RNAs in., 2001, 294(5543): 862–864.

[5] Lau NC, Lim LP, Weinstein EG, Bartel DP. An abundant class of tiny RNAs with probable regulatory roles in., 2001, 294(5543): 858–862.

[6] Berezikov E, Plasterk RH. Camels and zebrafish, viruses and cancer: a microRNA update., 2005, 14(S2): R183?R190.

[7] Lai EC, Tomancak P, Williams RW, Rubin GM. Computational identification ofmicroRNA genes., 2003, 4: R42.

[8] Berezikov E, Guryev V, van de Belt J, Wienholds E, Plasterk RH, Cuppen E. Phylogenetic shadowing and computational identification of human microRNA genes., 2005, 120(1): 21–24.

[9] Lim LP, Glasner ME, Yekta S, Burge CB, Bartel DP. Vertebrate microRNA genes., 2003, 299(5612): 1540.

[10] Lim LP, Lau NC, Weinstein EG, Abdelhakim A, Yekta S, Rhoades MW, Burge CB, Bartel DP. The microRNAs of Caenorhabditis elegans., 2003, 17(8): 991–1008.

[11] Bentwich I, Avniel A, Karov Y, Aharonov R, Gilad S, Barad O, Barzilai A, Einat P, Einav U, Meiri E, Sharon E, Spector Y, Bentwich Z. Identification of hundreds of conserved and nonconserved human microRNAs., 2005, 37(7): 766–770.

[12] Reinhart BJ, Weinstein EG, Rhoades MW, Bartel B, Bartel DP. MicroRNAs in plants., 2002, 16(13): 1616–1626.

[13] Sunkar R, Zhu JK. Novel and stress-regulated microRNAs and other small RNAs from., 2004, 16(8): 2001–2019.

[14] Park W, Li JJ, Song RT, Messing J, Chen XM. CARPEL FACTORY, a Dicer homolog, and HEN1, a novel protein, act in microRNA metabolism in., 2002, 12(17): 1484–1495.

[15] Pfeffer S, Sewer A, Lagos-Quintana M, Sheridan R, Sander C, Gr?sser FA, van Dyk LF, Ho CK, Shuman S, Chien M, Russo JJ, Ju JY, Randall G, Lindenbach BD, Rice CM, Simon V, Ho DD, Zavolan M, Tuschl T. Identification of microRNAs of the herpesvirus family., 2005, 2(4): 269–276.

[16] Pfeffer S, Zavolan M, Gr?sser FA, Chien M, Russo JJ, Ju JY, John B, Enright AJ, Marks D, Sander C, Tuschl T. Identification of virus-encoded microRNAs., 2004, 304(5671): 734–736.

[17] Griffiths-Jones S, Saini HK, van Dongen S, Enright AJ. miR-Base: tools for microRNA genomics., 2008, 36(S1): D154–D158.

[18] Brennecke J, Hipfner DR, Stark A, Russell RB, Cohen SM. Bantam encodes a developmentally regulated microRNA that controls cell proliferation and regulates the proapoptotic gene hid in., 2003, 113(1): 25?36.

[19] Xu PZ, Vernooy SY, Guo M, Hay BA. ThemicroRNA mir-14 suppresses cell death and is required for normal fat metabolism., 2003, 13(9): 790?795.

[20] Chen CZ, Li L, Lodish HF, Bartel DP. MicroRNAs modulate hematopoietic lineage differentiation., 2004, 303(5654): 83?86.

[21] Park JK, Liu X, Strauss TJ, McKearin DM, Liu QH. The miRNA pathway intrinsically controls self-renewal ofgermline stem cells., 2007, 17(6): 533?538.

[22] Alvarez-Garcia I, Miska EA. MicroRNA functions in animal development and human disease., 2005, 132(21): 4653–4662.

[23] Ruby JG, Jan C, Player C, Axtell MJ, Lee W, Nusbaum C, Ge H, Bartel DP. Large-scale sequencing reveals 21U-RNAs and additional microRNAs and endogenous siRNAs in., 2006, 127(6): 1193–1207.

[24] Ruby JG, Stark A, Johnston WK, Kellis M, Bartel DP, Lai EC. Evolution, biogenesis, expression, and target predictions of a substantially expanded set ofmicroRNAs., 2007, 17(12): 1850–1864.

[25] Fahlgren N, Howell MD, Kasschau KD, Chapman EJ, Sullivan CM, Cumbie JS, Givan SA, Law TF, Grant SR, Dangl JL, Carrington JC. High-throughput sequencing ofmicroRNAs: evidence for frequent birth and death ofgenes., 2007, 2(2): e219.

[26] Landgraf P, Rusu M, Sheridan R, Sewer A, Iovino N, Aravin A, Pfeffer S, Rice A, Kamphorst AO, Landthaler M, Lin C, Socci ND, Hermida L, Fulci V, Chiaretti S, Foà R, Schliwka J, Fuchs U, Novosel A, Müller RU, Schermer B, Bissels U, Inman J, Phan Q, Chien M, Weir DB, Choksi R, De Vita G, Frezzetti D, Trompeter HI, Hornung V, Teng G, Hartmann G, Palkovits M, Di Lauro R, Wernet P, Macino G, Rogler CE, Nagle JW, Ju JY, Papavasiliou FN, Benzing T, Lichter P, Tam W, Brownstein MJ, Bosio A, Borkhardt A, Russo JJ, Sander C, Zavolan M, Tuschl T. A mammalian microRNA expression Atlas based on small RNA library sequencing., 2007, 129(7): 1401–1414.

[27] Janvier P. Palaeontology: modern look for ancient lamprey., 2006, 443(7114): 921? 924.

[28] Heimberg AM, Cowper-Sal-lari R, Sémon M, Donoghue PC, Peterson KJ. microRNAs reveal the interrelationships of hagfish, lampreys, and gnathostomes and the nature of the ancestral vertebrate., 2010, 107(45): 19379–19383.

[29] 劉岑杰, 劉欣, 吳毓, 馬飛, 王繼紅, 李慶偉. 日本七鰓鰻類(lèi)淋巴細(xì)胞的分離及細(xì)胞學(xué)特征. 動(dòng)物學(xué)雜志, 2008, 43(1): 82?87.

[30] Shu LF, Hu ZL. Characterization and differential expression of microRNAs elicited by sulfur deprivation in., 2012, 13: 108.

[31] Zhang BH, Pan XP, Cox B,. Evidence that miRNAs are different from other RNAs., 2006, 63(2): 246–254.

[32] Gao XL, Gulari E, Zhou XC. In situ synthesis of oligonucleotide microarrays., 2004, 73(5): 579–596.

[33] Bolstad BM, Irizarry RA, Astrandand M, Speed TP. A comparison of normalization methods for high density oligonucleotide array data based on variance and bias., 2003, 19(2): 185–193.

[34] O'Connell RM, Rao DS, Chaudhuri AA, Baltimore D. Physiological and pathological roles for microRNAs in the immune system., 2010, 10(2): 111–122.

[35] Pancer Z, Amemiya CT, Ehrhardt GR, Ceitlin J, Gartland GL, Cooper MD. Somatic diversification of variable lymphocyte receptors in the agnathan sea lamprey., 2004, 430(6996): 174–180.

[36] Hsieh JY, Huang TS, Cheng SM, Lin WS, Tsai TN, Lee OK, Wang HW. MiR-146a-5p circuitry uncouples cell proliferation and migration, but not differentiation, in human mesenchymal stem cells., 2013, 41(21): 9753–9763.

[37] Li P, Peng JJ, Hu JB, Xu ZX, Xie W, Yuan LD. Localized expression pattern of miR-184 in., 2010, 38(1): 355–358.

[38] Cordes KR, Sheehy NT, White MP, Berry EC, Morton SU, Muth AN, Lee TH, Miano JM, Ivey KN, Srivastava D. miR-145 and miR-143 regulate smooth muscle cell fate and plasticity., 2009, 460(7256): 705–710.

[39] Agrawal R, Tran U, Wessely O. The miR-30 miRNA family regulatesdevelopment and targets the transcription factor/., 2009, 136(23): 3927–3936.

[40] Lu XY, Li XJ, He QP, Gao J, Gao Y, Liu B, Liu F.regulates the formation and differentiation of hematopoietic stem cells in vertebrates., 2013, 23(12): 1356–1368.

[41] 高飛, 孫鵬, 陳靜, 李章磊, 張孜宸, 李華云, 王寧, 周宜君. 蒙古沙冬青保守 microRNAs 的鑒定及靶基因預(yù)測(cè). 遺傳, 2014, 36(5): 485–494.

[42] Zhu LN, Dai YL, Ma F, Li QW. ESTs analyses ofliver and comparation transcriptome with the jawed vertebrates., 2008, 51(1): 27–37.

[43] Smith JJ, Kuraku S, Holt C, Sauka-Spengler T, Jiang N, Campbell MS, Yandell MD, Manousaki T, Meyer A, Bloom OE, Morgan JR, Buxbaum JD, Sachidanandam R, Sims C, Garruss AS, Cook M, Krumlauf R, Wiedemann LM, Sower SA, Decatur WA, Hall JA, Amemiya CT, Saha NR, Buckley KM, Rast JP, Das S, Hirano M, McCurley N, Guo P, Rohner N, Tabin CJ, Piccinelli P, Elgar G, Ruffier M, Aken BL, Searle SM, Muffato M, Pignatelli M, Herrero J, Jones M, Brown CT, Chung-Davidson YW, Nanlohy KG, Libants SV, Yeh CY, McCauley DW, Langeland JA, Pancer Z, Fritzsch B, de Jong PJ, Zhu BL, Fulton LL, Theising B, Flicek P, Bronner ME, Warren WC, Clifton SW, Wilson RK, Li WM. Sequencing of the sea lamprey() genome provides insights into vertebrate evolution., 2013, 45(4): 415–421.

(責(zé)任編委: 胡松年)

The identification and verification of species-specific microRNAs and their precursors in

Xin Liu1,2, Jie Zhang1,2, Chunhui Zhao1,2, Tiesong Li1,2, Jihong Wang1,2, Qingwei Li1,2

MicroRNAs (miRNAs) negatively regulate genes which are involved in various biological processes of metabolism at both transcriptional and post-transcriptional levels. In recent years, the existence and function of miRNAs have been extensively studied in plants and animals with the application of deep sequencing and microarray technology. In this study, small RNAs from leucocytes of() were sequenced using the second generation high-throughput sequencing technology. A total of 5 207 787 small RNA sequences were identified, and 4 739 346 of them assembled into 10 989 variants. Based on sequence similarity analysis, the sequences of thesevariants matched known miRNAs of 306 conserved families, among which 6 conserved miRNA family members expressed at an extremely high level which reflected the conservatism of miRNAs among species. In addition, 70 unannotated sequences were predicted to be new miRNAs, and 34 of them were further verified expressing in antigen-treatedleucocytes by miRNA microarray assay. Moreover, the minimal folding free energy indexes for 16 of the 34 miRNA precursors exceed 0.85, indicating the existence of species-specific miRNAs inwhich may play important roles in regulating, growth, development and disease response ofleukocytes.

; species-specific miRNA; high-throughput sequencing; microarray assay

2014-11-25;

2015-01-19

國(guó)家重大基礎(chǔ)研究發(fā)展規(guī)劃項(xiàng)目(973計(jì)劃) (編號(hào)：2013CB835304)和國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：31271323)資助

劉欣，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：細(xì)胞生物學(xué)。E-mail: liuxin@lnnu.edu.cn

李慶偉，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：細(xì)胞生物學(xué)。E-mail: liqw@263.net

10.16288/j.yczz.14-411

2015-1-21 10:52:51

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20150121.1052.001.html